يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

6.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59446

⸱

أبريل 23, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Department of Biotechnology and Life Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 4Department of Mechanical Systems, Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 5Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 6Duke Institute for Brain Sciences, Duke University

في هذه المقالة

ملخص

فسيولوجيا، يتم تنشيط مستقبلات الرائحة من جزيئات الرائحة المستنشقة في مرحلة البخار. ومع ذلك، استخدام معظم النظم في المختبر التحفيز الرائحة الطور السائل. نقدم هنا، أسلوب الذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة عند التحفيز الرائحة في مرحلة البخار.

الملخص

تصور حاسة الشم تبدأ مع تفاعل أودورانتس مع مستقبلات الرائحة (أو) أعرب عن طريق الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (OSN). ويتبع الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. من خلال هذا الترميز اندماجي، يمكن الكشف عن الكائنات الحية وتميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. وهكذا، يمكن وصف رائحة بتركيز معين عن طريق نمط تنشيط من أملاح الإماهة الفموية، ومحددة لكل رائحة. وبهذا المعني، تكسير الآليات التي يستخدمها الدماغ لإدراك رائحة يتطلب الرائحة فهم-أو التفاعلات. هذا السبب في أن المجتمع أولفاكتيون ملتزمة "دي أورفانيزي" هذه المستقبلات. نظم في المختبر التقليدية المستخدمة لتحديد الرائحة-أو التفاعلات استخدمت تحضين خلية الإعلام مع الرائحة، الذي يختلف عن كشف الروائح عن طريق حل أودورانتس البخار الطبيعي في الغشاء المخاطي للأنف قبل التفاعل مع أملاح الإماهة الفموية. هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للتنشيط أو عبر مرحلة البخار odorants. لدينا أسلوب يعتمد على قياس الإفراج عن المخيم التﻷلؤ استخدام الإنزيم جلوسينسور. أنه يسد الثغرات الحالية بين النهج المجراة في وفي المختبر، ويوفر أساسا لاستشعار المحاكاة البيولوجية كيميائية المتطايرة.

المقدمة

حاسة الشم يسمح الحيوانات البرية للتفاعل مع بيئتها الكيميائية المتطايرة للسلوكيات محرك الأقراص والعواطف. وتبدأ عملية الكشف عن رائحة أساسا، مع تفاعل جزيئات الرائحة الأولى مع نظام حاسة الشم، على مستوى الرائحة مستقبلات (أملاح الإماهة الفموية)1. في الثدييات، وأملاح الإماهة الفموية فردياً يعبر عن حاسة الشم العصبية الحسية (أوسنس) تقع في حاسة الشم ظهارة2. أنها تنتمي لعائلة مستقبلات (GPCR) مقترنة بالبروتين ز وأكثر دقة للأسرة الفرعية مثل رودوبسين (وتسمى أيضا الفئة A). زوجين أملاح الإماهة الفموية وتنشيطية ز البروتين زجبهة تحرير أورومو التنشيط الذي يؤدي إلى إنتاج المخيم متبوعاً بفتح قنوات دوري النوكليوتيدات بوابات وتوليد إمكانات العمل. من المسلم به أن الإدراك رائحة يعتمد على نمط محدد من أملاح الإماهة الفموية المنشط3،4 ويترتب على ذلك الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. ومن خلال هذا الترميز اندماجي، افترض أن الكائنات الحية يمكن الكشف عن وأن تميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. واحد من مفاتيح لفهم كيف تعتبر الروائح أن نفهم كيف والذي يتم تنشيط أملاح الإماهة الفموية من رائحة معينة.

في محاولة لتوضيح الرائحة-أو التفاعلات، في المختبر فحوصات فنية لعبت دوراً أساسيا. تم تحديد مؤثر يغاندس معطر لليتيم أملاح الإماهة الفموية (أو دي أورفانيزيشن) حقل نشط جداً طوال السنوات العشرين الماضية، من خلال استخدام مختلف في المختبر، السابقين فيفو والاختبارات الوظيفية المجراة في5،6،7 ،،من89،10،11،،من1213،14،15،16، 17.

نظم الفحص في المختبر الأنسب لتوصيف وظيفي مفصل من أملاح الإماهة الفموية، بما في ذلك تحديد مجالات وظيفية والبقايا الحرجة من أملاح الإماهة الفموية، فضلا عن التطبيقات الهندسية المحتملة. ومع ذلك، كذلك تطوير نظم القيم في المختبر لأملاح الإماهة الفموية قد تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة مع أوسنس تثقيف والتعبير الوظيفي من أملاح الإماهة الفموية في خلايا مغايرة. وكان التحدي الأول وضع البروتوكولات التي تسمح بالتعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية الفنية في رسم خرائط للرائحة-أو التفاعلات. وقد استخدمت عددا من المجموعات المستقلة مختلف النهج5،6،،من78،9،10،11،12، 14،18،،من1920. أحد إنجازات أقرب كان أدلى بها كروتوورست et al في المعلمة N-المحطة من أملاح الإماهة الفموية مع تسلسل تقصير من رهودوبسن (رو-العلامة) ولاحظ تعبير سطحية محسنة في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)13. الاختلافات إلى علامة تعلق على التسلسل أو لا يزال مسار البحث لتحسين أو التعبير ووظائف19،21. سايتو et al. ثم حدد نقل مستقبلات البروتين 1 (RTP1) و RTP2 التي تيسر أو الاتجار. 22 نسخة أقصر من RTP1، يسمى RTP1S، كما تبين أن يكون أكثر فعالية من البروتين الأصلي23. تطوير خط الخلية (Hana3A) الذي يعرب ستابلي زجبهة تحرير أورومو، REEP1، RTP1، و RTP2 24، مقترنة باستخدام الصحفيين دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) قد مكن تحديد الرائحة-أو التفاعلات. ما زال يتعين تحديد الآلية التي تعزز الأسرة RTP البروتينات التعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية.

التحذير واحد من هذه الأساليب المتبعة أنها تعتمد على تحفيز الرائحة في الطور السائل، بمعنى أن أودورانتس تذاب مسبقاً إلى وسيلة تحفيز وتنشيط الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط. هذا متميز جداً من الظروف الفسيولوجية حيث يصل إلى ظهارة حاسة الشم في مرحلة البخار جزيئات الرائحة وتنشيط أملاح الإماهة الفموية بانحلال في الغشاء المخاطي الأنفي. أكثر شبهاً التعرض الحوافز ذات الصلة الفيزيولوجية، اقترح سانز et al.20 مقايسة استناداً إلى تحفيز البخار بتطبيق قطره حل الرائحة معطلاً تحت الوجه الداخلي للفيلم البلاستيك توضع على رأس الخلية الآبار. أنها سجلت الردود الكالسيوم عن طريق رصد كثافة الأسفار. هذا الأسلوب كان الأول من استخدم الهواء-المرحلة الرائحة التحفيز، ولكن لم تسمح بفرز كبيرة للتنشيط أو.

وهنا، قمنا بتطوير أسلوب جديد يتيح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر أو التنشيط عن طريق حفز الرائحة مرحلة البخار بمقايسة جلوسينسور (الشكل 1). وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا في سياق الرائحة السائل التحفيز18،19،25،26،27،،من2829، 30 , 31-قاعة الرصد لومينوميتير هو اكويليبراتيد أولاً مع الرائحة يتبخر قبل لوحة القراءة (الشكل 1أ). جزيئات الرائحة، ثم ومذاوبة إلى المخزن المؤقت، والاستحمام الخلايا Hana3A التعبير عن أو الفائدة، RTP1S والبروتينات جلوسينسور (الشكل 1ب). إذا كانت الرائحة مؤثر أو، أو سوف التبديل إلى تكيف المنشط وربط مجموعةجبهة تحرير أورومو، تفعيل adenylyl cyclase (AC)، وتسبب في نهاية المطاف إلى ارتفاع مستويات المخيم. سيتم ربط هذا المخيم ارتفاع وتنشيط البروتين جلوسينسور لتوليد التﻷلؤ تحفيز لوسيفرين. ثم يتم تسجيلها لومينوميتير هذا التﻷلؤ ويتيح رصد أو التنشيط. هذا الأسلوب لفائدة عالية في سياق ديورفانيزيشن أو أنه يجلب في المختبر أنظمة أقرب إلى تصور الطبيعية من الروائح الكريهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-Hana3A خلايا الثقافة

  1. إعداد M10 (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) زائد 10% v/v مصل الدم البقري الجنين (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب).
  2. ثقافة الخلايا في 10 مل M10PSF في صحن ثقافة خلية 100 ملم في حاضنة في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) 37 درجة مئوية و 5 في المائة.
  3. تقسيم الخلايا كل يومين بنسبة 20%: عند التقاء 100 ٪ من الخلايا (حوالي 1.1 × 107 خلايا) يلاحظ تحت مجهر مرحلة-على النقيض، تطمح وسائل الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
  4. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل من 0.05% التربسين الإثيلين diamine tetraacetic حمض (يدتا، 0.48 ملم). ترك العمل لمدة 1 دقيقة تقريبا، حتى فصل الخلايا من اللوحة.
  5. إضافة 5 مل M10 إلغاء تنشيط التربسين وفي نهاية المطاف فصل الخلايا لا تزال تعلق على اللوحة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  6. نقل وحدة التخزين (8 مل) إلى أنبوب 15 مل والطرد المركزي في 200 x ز لأدنى 5 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند الخلايا إلى 5 مل M10PSF من بيبيتينج صعودا وهبوطاً لكسر أي خلية الشامل. تجنب خلق الفقاعات في الأنبوب.
  7. نقل 1 مل الحل حراكه الخلايا في طبق ثقافة خلية 100 ملم جديدة وإضافة 9 مل M10PSF جديدة. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2.

2-إعداد الخلايا تعداء

  1. تقييم الالتقاء، أو العدد من الخلايا، بمراقبة لهم تحت مجهر تباين مرحلة. على الأقل التقاء 10% (حوالي 1.1 × 106 خلايا) هناك حاجة للوحة واحدة.
  2. نضح وسائط الإعلام وغسل الخلايا بلطف مع 10 مل من برنامج تلفزيوني. نضح برنامج تلفزيوني وأضف 3 مل يدتا. ترك العمل لمدة 1 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة، حتى فصل الخلايا من اللوحة.
  3. إضافة 5 مل M10 إلغاء تنشيط التربسين وفي نهاية المطاف فصل الخلايا لا تزال تعلق على اللوحة من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. نقل وحدة التخزين (8 مل) إلى الأنبوبة 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق.
  4. نضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا إلى 5 مل M10PSF من بيبيتينج صعودا وهبوطاً لكسر أي خلية الشامل. تجنب خلق الفقاعات في الأنبوب.
  5. اعتماداً على عدد اللوحات تكون ترانسفيكتيد، نقل مبلغ مناسب للخلايا في خزان مع حجم المقابلة المناسبة M10PSF. وينبغي أن مطلي لوح واحد 96-جيدا مع 1/10 صحن المتلاقية 100 مم 100% (حوالي 1.1 × 106 خلايا) المخفف في M10PSF للوصول إلى إجمالي حجم 6 مل. لوحة 96-بئر واحدة بدءاً بطبق التقاء 100% 100 مم، إضافة 500 ميليلتر من 5 مل خلايا حراكه إلى 5.5 مل M10PSF جديدة. مزيج الخلايا و M10PSF دون توليد فقاعات الهواء.
  6. "الماصة؛" 50 ميليلتر من الخلايا مع وقف التنفيذ في كل بئر من لوحة 96-جيدا ماصة متعددة باستخدام. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5% CO2.

3-بلازميد تعداء

  1. مراقبة لوحة 96-البئر تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء خلية بين 30% و 50%.
  2. إعداد مزيج تعداء أول يحتوي على والبلازميدات المشتركة إلى لوحة كاملة (RTP1S، أو والبروتين جلوسينسور، انظر الجدول للمواد) التالية وحدات التخزين في الجدول 1. لاحظ أن الكمية من معلم رو أو ينبغي أن يكون مقسوماً على عدد من أملاح الإماهة الفموية إذا عدة أملاح الإماهة الفموية.
    ملاحظة: ونحن بقوة المشورة لإضافة عنصر سلبي متجه فارغة (هنا رو-pCI) وأي رقابة إيجابية (المعروفة أو الاستجابة للرائحة المجربة) لخطة التجربة.
  3. إعداد مزيج تعداء ثانية التي تحتوي على 500 ميليلتر من MEM و 20 ميليلتر من كاشف ليبوفيكتاميني 2000 (صالحة للوح واحد 96، حسنا، انظر الجدول للمواد). إضافة هذا المزيج الثاني إلى أول واحد، وتخلط بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة 5 مل M10 وتخلط برفق.
  4. استبدال M10PSF في لوحة 96-بئر بلاتيد سابقا من 50 ميليلتر من وسائط الإعلام تعداء النهائية. احتضان مجموعة حاضنة إلى 37 درجة مئوية و 5% CO2 وفراغ الدائرة بالتالي بين عشية وضحاها luminometer الإجراء هو موضح في الخطوة 6.

4-الركيزة الحضانة

  1. مراقبة لوحة 96-البئر تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء خلايا بين 60% و 100%. تعد حلاً تحفيز من موازنة الملح الحل (حبس هانك) تحتوي على 10 ملم من حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك هيدروكسيثيل (حبيس) و 5 ملم د-الجلوكوز.
  2. تمييع ميليلتر 75 من الكاشف المخيمات (انظر الجدول للمواد) حل لمل 2.75 الحل التحفيز. إزالة المتوسطة تعداء من لوحة 96-جيدا وغسل الخلايا بإضافة 50 ميليلتر من التحفيز الطازجة الحل لكل بئر.
  3. إزالة الحل التحفيز وإضافة 25 ميليلتر من الحل كاشف معسكر إعداده في الخطوة 4، 2 لكل بئر. احتضان لوحة 96-جيدا في درجة حرارة الغرفة في بيئة مظلمة وخالية من رائحة (على سبيل المثال، درج فارغة نظيفة بعيداً عن المواد الكيميائية أو أي مصدر الرائحة) ح 2.

5-الرائحة التحفيز

  1. أولاً، حجته قاعة luminometer مع جزيئات الرائحة متقلبة. تمييع الرائحة إلى التركيز المطلوب في 10 مل من الزيوت المعدنية (الشكل 2أ). قبل نهاية فترة الحضانة كاشف المخيم، إضافة 25 ميليلتر من الحل الرائحة في صفيحة 96-بئر جديدة (لا واحدة تحتوي على الخلايا). احتضان هذه اللوحة الرائحة في درجة حرارة الغرفة في قاعة لومينوميتير لمدة 5 دقائق (الشكل 2ب) (لا تسجيل لومينوميتير مطلوب هنا).
  2. تعيين لومينوميتير لتسجيل التﻷلؤ مع 0 s تأخير خلال دورات 20 لوحة القياس 90 s مع 0.7 s من الفترة الفاصلة بين الدورات.
  3. حق قبل قراءة اللوحة، إزالة لوحة الرائحة من الدائرة. إضافة 25 ميليلتر من الرائحة بين الآبار لصفيحة 96-كذلك تحتوي على الخلايا (لا تقم بإضافة الرائحة في الآبار التي تحتوي على الخلايا) وسرعة بدء القياس التﻷلؤ لجميع الآبار للدورات 20 ضمن 30 دقيقة (الشكل 2-ج).

6-إزالة الرائحة المتبقية داخل لومينوميتير

  1. فتح باب لومينوميتير. إدراج أنبوب متصل بمضخة فراغ.
  2. أودورانتس فراغ في القراءة الدائرة على نطاق واسع (على الأقل 2 حاء، ويفضل أن يكون ذلك بين عشية وضحاها) بين أودورانتس اثنين لتجنب التلوث المتبادل للتطاير رائحة من تجربة واحدة إلى آخر. استبدال بالهواء النقي بإرسال الهواء المضغوط خلال 5 دقائق قبل تفرخ الرائحة القادمة.

7-بيانات التحليل

  1. تصدير البيانات من البرنامج لومينوميتير.
  2. متوسط replicates لنفسه أو لكل وقت التسجيل. حساب متوسط الاستجابة أو طبيعية لأي تحكم في نهاية المطاف (مثلاً، متجه فارغة و الشكل 3ألف وقسم النتائج الممثل) بقسمة قيمة عنصر التحكم في المتوسط إلى أو القيمة في كل مرة تسجيل (الشكل 3ب وقسم النتائج التمثيلية).
  3. تطبيع أو استجابة كل نشاطهم القاعدية بقسمة رد أو متوسط 0 s لكل استجابة وقت التسجيل (انظر الشكل 3ج وقسم النتائج التمثيلية).
  4. حساب المساحة تحت المنحنى لكل أو للحصول على قيمة أو استجابة واحدة. للقيام بذلك، مجموع كافة قيم التﻷلؤ في كل مرة تسجيل لكل أو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نحن فحص الاستجابة لثلاثة من الماوس أملاح الإماهة الفموية و Olfr746 و Olfr124 و Olfr1093 باستخدام سينمالدهيد بخار التحفيز (الشكل 3). في نفس الوقت، كنا ناقلات فارغة (رو-pCI) لضمان أن الأنشطة المستحثة بالرائحة من أملاح الإماهة الفموية اختبارها كانت محددة (الشكل 3أ). وكان التنشيط في الوقت الحقيقي من أملاح الإماهة الفموية إلى التحفيز الرائحة بخار رصد قياس أكثر من 20 دورة. بيانات كل جيدا تم أولاً تطبيع إلى قيمة عنصر التحكم في المتوسط متجه فارغة لكل دو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الإحساس برائحة تعتمد اعتماداً أساسيا على التفعيل لأملاح الإماهة الفموية. ونتيجة لذلك، فهم وظيفة كل منها مطلوب للقضاء الآليات المعقدة التي تستخدم الدماغ لإدراك بيئتها الكيميائية المتطايرة. ومع ذلك، قد أعاق فهم هذه العملية الصعوبات في إنشاء وسيلة قوية الشاشة أو مرجع للحصول على وظائف ضد أودورانتس في المختبر. خلية التعبير السطحي ومغايرة لأملاح الإماهة الفموية وقد تم حل جزئيا بإنشاء كلمات مستقبلات13،19 والاكتشاف والاستغلال الأمثل للبروتينات مستقبلات والنقل (ر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المجلس وحاء ك وصاحب الجلالة طلبا البراءات ذات الصلة بهذا العمل في 27 أكتوبر 2016.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (DC014423 و DC016224) والدفاع المتقدم المشروع وكالة ريلنوسي المشروع البحثي. يلافن بقي في جامعة ديوك بدعم مالي من برنامج JSPS "النهوض بالشبكات الدولية الاستراتيجية" للتعجيل "تداول الباحثين الموهوبين" (R2801). ونشكر كليم سهر على تحرير المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ تريبسين-EDTAجيبكو25300-0540.05٪ تريبسين - EDTA (1x) ، فينول أحمر - يخزن عند 4 درجات ؛ طبق
ثقافة الخلية C 100 مم  BD Falcon353003طبق زراعة الخلايا 100 مم × 20 مم ؛
أنبوب 15 ملBD Falcon35209917 مم × 120 مم أنابيب مخروطية 96
بئرCorning384396 بئر ، مع غطاء LE أبيض مع قاع شفاف بولي دي ليسين مطلي بالبوليسترين
أمفوتريسينجيبكو15290-018أمفوتريسين ب 250 & مايكرو ؛ جم / مل - تخزين في درجة حرارة 4 درجات ؛
آلة الطرد المركزيJouanC312مع دوار دلو متأرجح ل 15 مل
من الفئة الثانية من النوع A / B3 الدخانNUAIRENU-407-500الدخان لزراعة الخلايا
FBSGibco16000-044مصل الأبقار الجنين - تخزين في -20 درجة ؛ C
GloSensor cAMP ReagentPromegaE1290GloSensor cAMP كاشف الركيزة البروتين المضيئة - تخزينها عند -20 درجة ؛ حاضنة C
37 درجة ؛ C; 5٪ CO2< / sub> FisherScientific11-676-604حاضنة لزراعة الخلايا
كاشف Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Lipofectamine 2000 كاشف 1 مجم / مل كاشف تعداء - تخزين في 4 درجات ؛ C
Luminometer POLARstar OPTIMA BMGLABTECHتوقفقارئ لوحة 96 جيدا للتلألؤ
الزيوت المعدنيةSigmaM8410مذيب للروائح - يحفظ في درجة حرارة الغرفة
الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) Corningcellgro10-010-CVالحد الأدنى من النسر المتوسط الأساسي مع إيرل الأملاح و L-glutamine - يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ C
البنسلين / الستربتومايسينسيجما ألدريتشP4333حل البنسلين والستربتومايسين الذي استقر مع 10,000 وحدة من البنسلين و 10 ملغ من الستربتومايسين - يخزن عند -20 درجة ؛ C
pGlosensorPromegaE2301pGloSensor-22F cAMP بلازميد البروتين المضيء - يخزن في 4 درجات ؛ مجهر
تباين المرحلةLeica090-131.001مجهر تباين الطور مع أهداف x4 ، x10 ، x20
RTP1SH. Matsunamilab-100 ng/µ ؛ L البلازميد - يخزن في درجة حرارة 4 درجات ؛ ج
C آلة الطرد المركزي C

المراجع

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
  2. Serizawa, S., Miyamichi, K., Sakano, H. One neuron-one receptor rule in the mouse olfactory system. Trends in Genetics. 20 (12), 648-653 (2004).
  3. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  4. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  5. Peterlin, Z., Firestein, S., Rogers, M. E. The state of the art of odorant receptor deorphanization: a report from the orphanage. The Journal of General Physiology. 143 (5), 527-542 (2014).
  6. Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science Signal. 2 (60), (2009).
  7. Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2, 4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chemical Senses. 42 (3), 181-193 (2017).
  8. Nishizumi, H., Sakano, H. Decoding and deorphanizing an olfactory map. Nature Neuroscience. 18 (10), 1432(2015).
  9. Wetzel, C. H., et al. Functional expression and characterization of a Drosophila odorant receptor in a heterologous cell system. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (16), 9377-9380 (2001).
  10. Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (7), 4040-4045 (1999).
  11. Levasseur, G., et al. Ligand-specific dose-response of heterologously expressed olfactory receptors. European Journal Of Biochemistry. 270 (13), 2905-2912 (2003).
  12. Zhao, H., et al. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
  13. Krautwurst, D., Yau, K. -W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
  14. Wetzel, C. H., et al. Specificity and Sensitivity of a Human Olfactory Receptor Functionally Expressed in Human Embryonic Kidney 293 Cells andXenopus Laevis Oocytes. Journal of Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
  15. Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. Journal of Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
  16. Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1446(2015).
  17. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nature Neuroscience. 18 (10), 1455(2015).
  18. Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A butter aroma recombinate activates human class-I odorant receptors. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9410-9420 (2015).
  19. Noe, F., et al. IL-6-HaloTag® enables live-cell plasma membrane staining, flow cytometry, functional expression, and de-orphaning of recombinant odorant receptors. Journal of Biological Methods. 4 (4), 81(2017).
  20. Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical Senses. 30 (1), 69-80 (2005).
  21. Shepard, B. D., Natarajan, N., Protzko, R. J., Acres, O. W., Pluznick, J. L. A cleavable N-terminal signal peptide promotes widespread olfactory receptor surface expression in HEK293T cells. PLoS One. 8 (7), 68758(2013).
  22. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
  23. Wu, L., Pan, Y., Chen, G. -Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-Transporting Protein 1 Short (RTP1S) Mediates the Translocation and Activation of Odorant Receptors by Acting through Multiple Steps. Journal of Biological Chemistry. , (2012).
  24. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature Protocols. 3 (9), 1402(2008).
  25. Zhang, Y., Pan, Y., Matsunami, H., Zhuang, H. Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay. Journal of Visualized Experiments. (128), e55831(2017).
  26. Li, S., et al. Smelling sulfur: Copper and silver regulate the response of human odorant receptor OR2T11 to low-molecular-weight thiols. Journal of the American Chemical Society. 138 (40), 13281-13288 (2016).
  27. Ahmed, L., et al. Molecular mechanism of activation of human musk receptors OR5AN1 and OR1A1 by (R)-muscone and diverse other musk-smelling compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (17), 3950-3958 (2018).
  28. Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (9), 3492-3497 (2012).
  29. Sekharan, S., et al. QM/MM model of the mouse olfactory receptor MOR244-3 validated by site-directed mutagenesis experiments. Biophysical journal. 107 (5), 5-8 (2014).
  30. Liu, M. T., et al. Carbon chain shape selectivity by the mouse olfactory receptor OR-I7. Organic & Biomolecular Chemistry. 16 (14), 2541-2548 (2018).
  31. Li, Y., et al. Aldehyde Recognition and Discrimination by Mammalian Odorant Receptors via Functional Group-Specific Hydration Chemistry. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2563-2571 (2014).
  32. Kida, H., et al. Vapor detection and discrimination with a panel of odorant receptors. Nature Communications. 9 (1), 4556(2018).
  33. Yu, Y., et al. Responsiveness of G protein-coupled odorant receptors is partially attributed to the activation mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (48), 14966-14971 (2015).
  34. de March, C. A., et al. Conserved residues control Activation of mammalian G protein-coupled odorant receptors. Journal of the American Chemical Society. 137 (26), 8611-8616 (2015).
  35. de March, C. A., et al. Odorant receptor 7D4 activation dynamics. Angewandte Chemie. 130 (17), 4644-4648 (2018).
  36. Kim, S. -K., Goddard, W. A. Predicted 3D structures of olfactory receptors with details of odorant binding to OR1G1. Journal of Computer-Aided Molecular Design. 28 (12), 1175-1190 (2014).
  37. de March, C. A., Kim, S. K., Antonczak, S., Goddard, W. A., Golebiowski, J. G protein-coupled odorant receptors: From sequence to structure. Protein Science. 24 (9), 1543-1548 (2015).
  38. Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS Genetics. 8 (7), 1002821(2012).
  39. Mainland, J. D., et al. The missense of smell: functional variability in the human odorant receptor repertoire. Nature Neuroscience. 17 (1), 114(2014).
  40. Meister, M. On the dimensionality of odor space. Elife. 4, 07865(2015).
  41. Bushdid, C., Magnasco, M. O., Vosshall, L. B., Keller, A. Humans can discriminate more than 1 trillion olfactory stimuli. Science. 343 (6177), 1370-1372 (2014).
  42. Gerkin, R. C., Castro, J. B. The number of olfactory stimuli that humans can discriminate is still unknown. Elife. 4, 08127(2015).
  43. Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
  44. Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468(2007).
  45. McRae, J. F., et al. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical Senses. 37 (7), 585-593 (2012).
  46. de March, C. A., Ryu, S., Sicard, G., Moon, C., Golebiowski, J. Structure-odour relationships reviewed in the postgenomic era. Flavour and Fragrance Journal. 30 (5), 342-361 (2015).
  47. Olson, M. J., Martin, J. L., LaRosa, A. C., Brady, A. N., Pohl, L. R. Immunohistochemical localization of carboxylesterase in the nasal mucosa of rats. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (2), 307-311 (1993).
  48. Nagashima, A., Touhara, K. Enzymatic conversion of odorants in nasal mucus affects olfactory glomerular activation patterns and odor perception. Journal of Neuroscience. 30 (48), 16391-16398 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المواد العطرية في الطور البخاريالمراقبة في الوقت الفعليمقايسة Glosensorقياس تحرر cAMPالعصبونات الحسية الشميةتحفيز الأسيتوفينونتحليل مقياس اللمعانبروتوكول زراعة الخلاياإجراء ترانسفكشن (نقل الجينات)
في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.