التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

Joshua Deal; Andrea Britain; Thomas Rich; Silas Leavesley

doi:10.3791/59448

مقالة منهجية

التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

DOI:

10.3791/59448

⸱

أغسطس 22, 2019

Joshua Deal¹^,²^,³ , Andrea Britain²^,³ , Thomas Rich²^,³ , Silas Leavesley¹^,²^,³

¹Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama, ²Center for Lung Biology, University of South Alabama, ³Department of Pharmacology, University of South Alabama

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أصبح التصوير الطيفي حلاً موثوقاً به لتحديد وفصل إشارات الفلورة المتعددة في عينة واحدة، ويمكن أن يميز بسهولة بين الإشارات ذات الأهمية والخلفية أو الفلورة الذاتية. يحسن التصوير الطيفي الفائق المسح الضوئي على هذه التقنية عن طريق تقليل وقت الحصول على الصور اللازمة مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في نفس الوقت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتعتمد عدة تقنيات على الكشف عن إشارات الفلورة لتحديد الظواهر أو دراستها أو توضيح الوظائف. وقد ثبت أن فصل إشارات الفلورة هذه مرهق حتى ظهور التصوير فوق الطيفي، الذي يمكن فيه فصل مصادر الفلورة عن بعضها البعض وكذلك عن إشارات الخلفية والفلورة الذاتية (نظراً للمعرفة بخصائصها الطيفية التوقيعات). ومع ذلك، فإن التصوير الطيفي الفائق المسحي للانبعاثات التقليدي يعاني من بطء أوقات الاكتساب وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التصفية الضرورية لكل من الإثارة وضوء الانبعاثات. وقد تبين من قبل أن التصوير الطيفي الفائق المسح يُحدِّد وقت الاكتساب اللازم مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة في الوقت نفسه. وباستخدام المعدات المتاحة تجارياً، يصف هذا البروتوكول كيفية تجميع ومعايرة واستخدام نظام تصوير التصوير الطيفي الفائق المسح يُظهر الإثارة لفصل الإشارات عن عدة مصادر فلورسفية في عينة واحدة. في حين أن هذه التقنية تنطبق بشكل كبير على التصوير المجهري للخلايا والأنسجة، إلا أنها قد تكون مفيدة لأي نوع من التجارب التي تستخدم الفلورة التي يمكن فيها تغيير أطوال موجية الإثارة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: التصوير الكيميائي، التطبيقات البيئية، ورعاية العيون، وعلوم الأغذية، وعلم الطب الشرعي، والعلوم الطبية، والمعادن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن إجراء التصوير الطيفي بطرق مختلفة ويشار إليه بعدةمصطلحات¹^و2و3^و4. وبوجه عام، يشير التصوير الطيفي إلى البيانات التي تم الحصول عليها في بعدين مكانيتين على الأقل وبعد طيفي واحد. يتميز التصوير المتعدد الأطياف وفرط الطيفية في أغلب الأحيان بعدد نطاقات الطول الموجي أو ما إذا كانت النطاقات الطيفية متجاورة¹. وبالنسبة لهذا التطبيق، تُعرَّف البيانات فوق الطيفية بأنها البيانات الطيفية المكتسبة بنطاقات الطول الموجي المتجاورة التي تتحقق عن طريق المباعدة بين الأطوال الموجية المركزية بما لا يقل عن نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكل مرشح تمرير شريطي يستخدم للإثارة (أي 5 نانومتر تباعد الطول الموجي مركز لمرشحات النطاق مع 14-20 نانومتر عرض النطاق). وتسمح الطبيعة المتجاورة لنطاقات البيانات بالإفراط في أخذ مجموعة البيانات، مما يكفل استيفاء معايير Nyquist عند أخذ عينات من المجال الطيفي.

وقد تم تطوير التصوير فوق الطيفي من قبل ناسا في 1970s و 1980s جنبا إلى جنب مع أول ساتل لاندسات⁵^,⁶. وقد أتاح جمع البيانات من عدة نطاقات طيفية متجاورة توليد طيف إشراقة لكل بكسل. إن تحديد وتحديد طيف الإشراقة للمكونات الفردية جعل من الممكن ليس فقط الكشف عن المواد السطحية بواسطة أطيافها المميزة، بل سمح أيضاً بإزالة الإشارات المتداخلة، مثل الاختلافات في الإشارة بسبب الظروف الجوية. وقد طُبق مفهوم الكشف عن المواد باستخدام أطيافها المميزة على النظم البيولوجية في عام 1996 عندما استخدم شروك وآخرون مجموعات من خمسة فلوروفورات مختلفة وأطيافها المعروفة للتمييز بين الكروموسومات المسماة في عملية تسمى [كرّوبي] طيفيّة [كرّووبي]⁷. وقد تم تفصيل هذه التقنية في عام 2000 من قبل Tsurui وآخرون لتصوير الفلورة من عينات الأنسجة، وذلك باستخدام سبعة أصباغ فلورية وتحلل قيمة فريدة لتحقيق الفصل الطيفي لكل بكسل في تركيبات خطية من الأطياف في المرجع مكتبة⁸. وعلى غرار نظيراتها في مجال الاستشعار عن بعد، يمكن حساب مساهمة كل فلوروفور معروف من الصورة الفائقة الطيفية، مع إعطاء معلومات مسبقة عن طيف كل فلوروفور.

كما تم استخدام التصوير الطيفي الفائق في مجالات الزراعة⁹، علم الفلك¹⁰، الطب الحيوي¹¹، التصوير الكيميائي¹²، التطبيقات البيئية¹³، العناية بالعين¹⁴، علوم الأغذية¹⁵، علم الطب الشرعي¹⁶^،¹⁷، العلوم الطبية¹⁸، علم المعادن¹⁹، والمراقبة^20. ومن القيود الرئيسية لأنظمة التصوير فوق الطيفي المجهر الفلوري الحالي أن تقنية التصوير الطيفي الفائق الطيفي القياسية تعزل إشارات الفلورة في نطاقات ضيقة بنسبة 1) أولاً تصفية ضوء الإثارة للتحكم في الإثارة العينة، ثم 2) مزيد من تصفية الضوء المنبعث لفصل انبعاث الفلورة إلى نطاقات ضيقة التي يمكن فصلها في وقت لاحق رياضيا^21. يؤدي تصفية كل من إضاءة الإثارة والفلورة المنبعثة إلى تقليل مقدار الإشارة المتاحة، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويتطلب فترات اكتساب طويلة. وتحد الإشارة المنخفضة وفترات الاكتساب الطويلة من إمكانية تطبيق التصوير فوق الطيفي كأداة تشخيصية.

وقد تم تطوير طريقة التصوير التي تستخدم التصوير فوق الطيفي ولكن يعزز الإشارة المتاحة، مما يقلل من وقت الاقتناء اللازم^21،²². وتكتسب هذه الطريقة الجديدة، التي تسمى التصوير الطيفي الفائق المسح للإثارة، بيانات الصورة الطيفية عن طريق تغيير طول موجة الإثارة وجمع مجموعة واسعة من الضوء المنبعث. وقد تبين من قبل أن هذه التقنية تسفر عن أوامر من الزيادات في حجم نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع تقنيات مسح الانبعاثات^21،²². وتعزى الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير إلى النطاق الواسع (~ 600 نانومتر) من ضوء الانبعاثات المكتشف، في حين يتم توفير الخصوصية عن طريق تصفية ضوء الإثارة فقط بدلاً من انبعاث الفلورة. وهذا يسمح لجميع الضوء المنبعث (لكل موجة الإثارة) للوصول إلى كاشف^21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتمييز الفلورة الذاتية من التسميات الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تقليل وقت الاكتساب بسبب زيادة الإشارة القابلة للكشف تقلل من خطر ابيضاض الصور، كما تسمح بإجراء عمليات مسح طيفي بمعدل اكتساب مقبول للتصوير الطيفي بالفيديو.

والهدف من هذا البروتوكول هو أن يكون بمثابة دليل لاقتناء البيانات من أجل التصوير المجهري للتصوير فوق الطيفي المسحي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين الأوصاف التي تساعد على فهم مسار الضوء والأجهزة. كما يرد وصف لتنفيذ برمجيات مفتوحة المصدر للمجهر التصويري الفائق الطيفي المسحي. وأخيراً، يتم توفير أوصاف لكيفية معايرة النظام إلى معيار NIST يمكن تتبعها، وضبط إعدادات البرامج والأجهزة للحصول على نتائج دقيقة، وفك خلط الإشارة المكتشفة في مساهمات من مكونات فردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جهاز الإعداد

مصدر الضوء: حدد مصدر ضوء طيفي واسع النطاق مع خرج طاقة عالية وترتيب عالي (تم استخدام مصباح قوس يُستخدم بقوة 300 واط في هذه الدراسات).
الغالق (اختياري): أضف غالقًا إلى المسار البصري لتقليل ابيضاض الصور للتصوير بالفاصل الزمني.
نظام فلتر قابل للضبط: تضمين تجميع ضبط ميكانيكي وفلتر رقيق للأفلام القابلة للضبط (TFTF) تم تعيينه لتمكين نطاق الإثارة المطلوب قابل للتعديل الطول الموجي (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر).
المجهر: استخدام مجهر الفلورة المقلوبة بما في ذلك برج فلتر ثنائي الكشريك بمحركات وتحكم.
1. مكعب فلتر الفلورة: قم بتجميع مكعب فلتر الفلورة الذي يمر طويلاً. للحصول على أفضل النتائج، اختر مرآة ثنائية اللون وفلتر انبعاثات طويل المرور على نفس الطول الموجي لتحقيق الفصل الأمثل للإثارة من ضوء الانبعاثات (على سبيل المثال، 495 نانومتر).
2. الهدف: استخدام هدف أبوكرومي مناسب لضمان التركيز الموحد على نطاق الطول الموجي المستخدم في التجربة (تم استخدام هدف الماء 60x لهذه الدراسة).
3. المرحلة التلقائية (اختياري): استخدم مرحلة تلقائية لأخذ عينات سريعة من مجالات عرض متعددة و/أو حقول كبيرة جدًا من خلال خياطة الصور. معايرة المرحلة مع الهدف والكاميرا.
الكاميرا: حدد كاميرا مناسبة لتحقيق الدقة المكانية، والحساسية، ومتطلبات الضوضاء من التجربة (استخدم هذا النظام كاميرا sCMOS عالية الحساسية).

2 - برامجيات الاقتناء

اختر حزمة برامج تسمح بالتحكم المستقل في كل مكون من مكونات الأجهزة، مثل Micro-Manager.
1. إنشاء ملف التكوين: ملف التكوين هو مجموعة محفوظة من الأدوات والإرشادات التي سيتم تحميل Micro-Manager لتشغيل أجهزة النظام. لإنشاء ملف تكوين، انقر فوق أدوات > معالج تكوين الأجهزة.
  1. في الخطوة 1، انقر فوق إنشاء تكوين جديد > التالي للمتابعة. لاحظ أنه قد يختار المستخدم تعديل أو استكشاف التكوين الموجود إذا كان متوفراً بالفعل.
  2. في الخطوة 2، استعرض قائمة الأجهزة المتوفرة للعثور على الأجهزة التي تريد التحكم فيها من خلال Micro-Manager، مثل المجهر والمصباح والمسرح والغالق والكاميرا. عند تمييزه، انقر فوق إضافة... لإضافة الجهاز إلى قائمة الأجهزة المثبتة. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة.
    1. تعيين تسمية الجهاز في المربع تسمية. (على سبيل المثال، كاميرا sCMOS)
    2. ضمن القيمة، حدد منفذ COM المناسب لكل جهاز. سيؤدي هذا إلى ظهور قائمة بخصائص الجهاز في أسفل الإطار.
    3. اترك خصائص الجهاز في إعداداتها الافتراضية. لاحظ أنه قد يتم إدخال القيم المخصصة لكل خاصية جهاز كما هو مطلوب.
    4. عند إضافة كل جهاز، انقر فوق الزر التالي للمتابعة إلى الخطوة التالية. لاحظ أنه إذا تم ترك أية أجهزة أو تحتاج إلى تغيير، يمكن تعديل ملف التكوين لاحقاً كما هو موضح في الخطوة 2.1.1.1.
  3. في الخطوة 3، استخدم القوائم المنسدلة لتحديد مرحلة الكاميرا والغالق والتركيز الافتراضية. إذا كان الغالق التلقائي مرغوبًا فيه، فانقر على خانة الاختيار أسفل القائمة المنسدلة مرحلة التركيز البؤري. إذا كان اتجاه التركيز للمرحلة Z معروفًا، فحدده من القائمة المنسدلة ضمن اتجاهات تركيز المرحلة (المتقدمة). وإلا، اترك الافتراضي كغير معروف.
  4. في الخطوة 4، انقر نقراً مزدوجاً فوق المربعات ضمن عنوان تأخير [مللي ثانية] لتعيين التأخيرات المقترنة بالأجهزة التلقائية مثل تأخيرات 100 مللي ثانية للمصباح والمرحلة والغالق و تأخير 250 مللي ثانية للأوامر إلى تجميع الضبط الميكانيكي لحساب الميكانيكية التبديل الوقت بين المرشحات.
  5. في الخطوة 5 تعيين تسميات لأجهزة الحالة. يستخدم تكوين نظام المجهر المسح الضوئي للإثارة التسميات في كتلة الفلتر لتحديد كل مكعب فلتر الفلورة (على سبيل المثال، الدولة 0 يتوافق مع التسمية مشرق،مكعب فلتر فارغ المستخدمة أثناء التصوير حقل مشرق؛ الدولة 3 يتوافق مع التسمية 495 نانومتر والعرف 495 نانومتر مكعب مرشح dichroic المستخدمة لفصل الإثارة وضوء الانبعاثات في 495 نانومتر). وتستخدم التسميات أيضا في تجميع ضبط الميكانيكية لتخزين أوامر التبديل لكل الطول الموجي الإثارة (على سبيل المثال، الدولة 0 يتوافق مع 340 نانومتر الإثارة الطول الموجي ضبط الأمر لتجميع ضبط الميكانيكية).
  6. في الخطوة 6، انقر فوق الزر استعراض بجوار المربع ملف التكوين لاختيار حفظ الموقع واسم الملف لملف التكوين. انقر فوق إنهاء لحفظ ملف التكوين.
2. مجموعات بدء التشغيل والإعدادات المسبقة: يمكن للمدير ة الصغرى تخزين مجموعات مختلفة داخل كل ملف تكوين لتنشيط مجموعة فرعية من الأجهزة أو تغييرها. على سبيل المثال، ستقوم مجموعة "بدء تشغيل النظام" ومجموعة الإعداد المسبق بتخزين الإعدادات الافتراضية مثل حجم الطعام ومعدلات القراءة للكاميرا.
  1. إنشاء مجموعة (على سبيل المثال، النظام) بالنقر فوق + في النافذة الرئيسية في القسم الفرعي للمجموعة.
  2. تحقق من أي استخدام في المجموعة؟ مربعات داخل المجموعة التي تتطلب قيمة افتراضية ليتم تعيينها (على سبيل المثال، تناول الطعام في الكاميرا الافتراضية المقترنة).
  3. إنشاء إعداد مسبق جديد (على سبيل المثال، "بدء التشغيل") بالنقر فوق + في النافذة الرئيسية في القسم الفرعي الإعداد المسبق.
  4. سيظهر كل مربع تم إيداعه في الخطوة 2 كخيار مسبق الإعداد هنا. اختر قيمة افتراضية ليتم تحميلها لكل مربع محدد.
3. مجموعة والمسبقة لموجات الإثارة: مدير مايكرو يعامل كل الطول الموجي الإثارة كما قناة خاصة بها معها أمر التبديل الطول الموجي الخاصة بها؛ لذلك، يجب حفظ كل كإعداد مسبق خاص به.
  1. إنشاء مجموعة جديدة تحتوي على مجموعة من الأطوال الموجية الإثارة المطلوبة (على سبيل المثال، "495 نانومتر dichroic")
  2. تحقق من المربع استخدام في المجموعة؟ المسمى تسمية المقابلة لجهاز VF-5.
  3. إنشاء إعداد مسبق جديد يسمى لكل موجة إثارة (على سبيل المثال، "340 نانومتر").
  4. تعيين اسم الخاصية المناسبة والقيمة المسبقة (على سبيل المثال، اسم الخاصية: "التسمية"؛ قيمة الإعداد المسبق: "340 نانومتر").
4. أداة اكتساب متعددة الأبعاد: انقر فوقمتعددة الد ACQ.بالقرب من أعلى يسار نافذة المدير الصغير لفتح أداة قابلة للتخصيص لاستخدامها لالتقاط صورة للعينة في كل الطول الموجي الإثارة بنقرة زر واحدة. هناك العديد من خيارات التخصيص لإنشاء الاكتساب تماما ً كما هو مطلوب.
  1. النقاط الزمنية (غير المستخدمة في هذا المثال): للدراسات التي لا تحتوي على مكون الفاصل الزمني، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت دراسات الفاصل الزمني مرغوبة، حدد هذا المربع. في حالة تحديد، أدخل عدد المرات لتنفيذ باقي إعدادات الامتلاك في المربع رقم. قم بتعيين الوقت بين عمليات الشراء المتتالية عن طريق إدخال المدة في المربع الفاصل الزمني واختر الوحدة المناسبة (مللي ثانية أو ثانية أو دقائق؛ وعادة ما تكون ثانية).
  2. مواضع متعددة (XY؛ غير مستخدمة في هذا المثال): للدراسات الخاصة بموضع XY واحد، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت مواضع XY متعددة مرغوبة، حدد المربع وانقر فوق الزر تحرير قائمة الموضع لفتح إطار منفصل. نقل المرحلة إلى كل موقع المطلوب وانقر فوق الزر وضع علامة لحفظ هذا الموقف في البرنامج. كرر حتى يتم وضع علامة على كافة مواضع XY المطلوبة. أغلق هذا الإطار للمتابعة.
  3. مكدسات Z (شرائح؛ غير مستخدمة في هذا المثال): للدراسات الخاصة بموضع Z واحد، اترك المربع دون تحديد. إذا كانت مواضع Z متعددة مرغوبة، حدد المربع. نقل المرحلة إلى الموضع Z البداية المطلوبة وانقر فوق الزر تعيين بجوار مربع بدء Z. نقل المرحلة إلى الموضع Z النهاية المطلوبة وانقر فوق الزر تعيين بجانب مربع Z-نهاية. أدخل حجم الخطوة المطلوب (بالميكرون) في المربع خطوة Z.
  4. القنوات: تأكد من تحديد مربع القنوات. هنا، القنوات هي الأسماء المعطاة لموجات الإثارة الفردية. وتتوافق "القنوات" المتاحة مع "المجموعات" الموصوفة في الخطوتين 2-1-2 و2-1-3.
    1. المجموعة: انقر فوق القائمة المنسدلة لتحديد مجموعة للاختيار من بينها الأطوال الموجية الإثارة المتاحة (على سبيل المثال، 495 نانومتر dichroic).
    2. انقر فوق المربع الاحتفاظ بفتح الغالق للحفاظ على الغالق مفتوحاً بين عمليات الاستحواذ لكل قناة. لاحظ أن الغالق سيظل مغلقاً بين عمليات المسح الطيفي المتعاقبة إذا تم تحديد هذا المربع، بافتراض تحديد خيار الغالق التلقائي أيضًا في النافذة الرئيسية.
  5. انقر فوق الزر جديد لإضافة قنوات إلى قائمة الاكتساب. لاحظ أنه يمكن استخدام الزر إزالة لإزالة أي قنوات لم تعد مرغوبة وأنه يمكن استخدام أعلى وأسفل لإعادة ترتيب أي قناة محددة.
    1. تأكد من تحديد خانة الاختيار Use؟ لكل طول موجي مرغوب فيه في الفحص الطيفي.
    2. التكوين: انقر على القائمة المنسدلة ضمن التكوين واختر الطول الموجي الأول في النطاق الطيفي المطلوب (على سبيل المثال، 340 نانومتر).
    3. التعرض: انقر نقرًا مزدوجًا على المربع ضمن التعرض وأدخل وقت التعرض المطلوب للطول الموجي المحدد (على سبيل المثال، "100" لـ 100 مللي ثانية). انظر الفرع 5 ("الحصول على البيانات") للاطلاع على اقتراحات لتحديد أوقات التعرض المناسبة.
    4. Z-offset (لا ينطبق في المسح الطيفي): اترك هذا المربع فارغاً (في 0) عند إجراء فحص طيفي.
    5. Z-المكدس: تأكد من أن يتم فحص هذا المربع لكل طول موجة في النطاق الطيفي إذا كان تنفيذ كومة Z.
    6. تخطي الأب (لا ينطبق في المسح الطيفي): اترك هذا المربع فارغاً (في 0) عند إجراء فحص طيفي. لاحظ أنه قد يكون من المفيد تخطي الإطارات بشكل انتقائي في حالة أن واحد أو عدد قليل من موجات الإثارة هي أكثر قوة بكثير من غيرها أو إذا ثبت أن الأطوال الموجية الفردية السمية الضوئية بشكل خاص.
    7. اللون: اترك هذا المربع فارغاً عند إجراء فحص طيفي. لاحظ أنه يمكن اختيار الألوان لنطاقات الطول الموجي الفردية لأغراض تصور البيانات، ولكن اللون غير مناسب للفك الطيفي اللاحق.
    8. كرر هذه الخطوات حتى يتم إضافة كل الطول الموجي الإثارة المطلوب ضمن نطاق المسح الطيفي المحدد.
  6. أمر الشراء: انقر على القائمة المنسدلة لاختيار الترتيب الذي سيتم تنفيذ الخيارات أعلاه (2.1.4.1-2.1.4.5). للمسح الطيفي مثل واحد هو مبين هنا، أمر الاستحواذ هو ببساطة قناة. لاحظ أن تظهر خيارات إضافية كمربعات إضافية يتم التحقق ضمن أداة الاكتساب متعدد الأبعاد [نقاط الوقت، مواضع متعددة (XY)، و مكدسات Z (شرائح)] والسماح باختيار إما الموضع أو الوقت أولاً، متبوعاً بشريحة أو قناه.
  7. التركيز التلقائي (غير مستخدم في هذا المثال): إذا تم تحديد مواضع متعددة (XY)، تتوفر عدة أنماط مختلفة من التركيز البؤري التلقائي. انقر فوق الزر خيارات وحدد طريقة تركيز تلقائي من القائمة المنسدلة بجانب الزر إغلاق.
  8. ملخص: راجع هذا الإطار للحصول على ملخص لعدد النقاط الزمنية، مواضع XY، شرائح Z، القنوات، العدد الإجمالي للصور، إجمالي الذاكرة، مدة المسح الضوئي، وترتيب الاكتساب لضمان تطابق المعلومات المسرودة مع إعدادات الاكتساب المتوقعة.
  9. حفظ الصور: تأكد من تحديد هذا المربع لحفظ البيانات التي تم جمعها من خلال استخدام أداة الاكتساب متعدد الأبعاد.
    1. انقر فوق ... بجوار جذر الدليل لاختيار جذر الدليل الذي سيتم حفظ الملفات فيه. اسم جذر الدليل بطريقة تصف التفاصيل ذات الصلة من التجربة (على سبيل المثال، GCaMP Airway خلايا العضلات الملساء).
    2. أدخل اسماً في المربع المجاور لبادئة الاسم الذي يصف عملية الحصول على الصورة الحالية (على سبيل المثال FOV1_100ms_60X_495nmDichroicFilter). من المستحسن إنشاء بادئة اسم تعرّف مجال العرض ووقت التعرض، بالإضافة إلى المعلومات الأخرى ذات الصلة مثل الكائن وعامل التصفية ثنائي الذرة المستخدم. لاحظ أنه سيتم حفظ مكدس الصور الأول الذي تم التقاطه باستخدام هذه الإعدادات مع "_1" بعد بادئة الاسم. سيتم حفظ أي مكدس اللاحقة التي تم التقاطها مع نفس جذر الدليل وبادئة الاسم مع "_n" الذي "n" هو عدد المرات التي تم أخذ مكدس مع هذا الاسم في الدليل.
    3. انقر فوق ملفات صور منفصلة لضمان حفظ الصورة التي تم إنشاؤها في كل الطول الموجي الإثارة.
  10. حفظ باسم: انقر فوق الزر حفظ باسم... لاحظ أنه سيتم حفظ جذر الدليل وبادئات الاسم أيضاً.
  11. الحصول على: أخيرا، انقر فوق اكتساب! لبدء الحصول على الصور وفقا لإعدادات الاكتساب المختارة أعلاه.

3- تصحيح الاستجابة الطيفية (اختياري):

ويمكن إجراء تصحيح النواتج الطيفية لمعايرة الاستجابة الطيفية للنظام إلى مستوى معروف، مثل مصباح يمكن تعقبه من NIST أو معيار أو أداة أخرى يمكن تتبعها من NIST. وهذه الخطوة مهمة بصفة خاصة إذا ما قورنت النتائج بأدوات التصوير الطيفية الأخرى أو مطياف الطيف أو بين مختبرات مختلفة. تم الإبلاغ عن هذه العملية بالتفصيل سابقا²¹^،²³.
1. استخدم مطياف معاير ًا لمصدر ضوء يمكن تعقبه لـ NIST (مثل LS-1-CAL-INT أو Ocean Optics) أو معيار آخر يمكن تتبعه من NIST للحصول على القوة الطيفية للإضاءة كما تم قياسها في مرحلة العينة. إجراء تصحيح منفصل لكل مجموعة من إعداد مصدر الضوء، مرآة ثنائية، وموضوعية. استخدم كرة دمج مقترنة بمطياف لقياس الإضاءة ذات الزاوية العريضة بدقة من هدف المجهر.
2. استخدم طريقة تكامل، مثل القاعدة شبه المنحرفة، لدمج البيانات الطيفية على الأطوال الموجية المضيئة. عرض نطاق ترددي 40 نانومتر للتكامل تتمحور حول الطول الموجي المركز كافية لمعظم المرشحات التي لديها عرض نطاق نطاق ينصف اسمي بين 14-20 نانومتر عرض كامل في نصف الحد الأقصى (FWHM). تمثل القيمة المتكاملة شدة الإضاءة الطيفية في كل نطاق موجة إثارة.
3. رسم الكثافة المتكاملة لكل نطاق الطول الموجي كدالة لطول موجة مركز الإثارة للسماح بالتصور للمحة كثافة الإضاءة الطيفية.
4. تحديد نطاق الطول الموجي مع أدنى كثافة متكاملة.
5. قم بتطبيع ملحت شدة الإضاءة الطيفية عن طريق تقسيم أدنى كثافة متكاملة حسب الكثافة المتكاملة لكل نطاق طول موجي لتوليد عامل تصحيح يعتمد على الطول الموجي.

4. إعداد عينة

إعداد عينة "فارغة" (على سبيل المثال، وضع غطاء زجاجي في غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت). تم وصف هذا المخزن المؤقت مسبقاً²⁴.
إعداد عينة غير مسمى لتحديد أي عينة autofluorescence (على سبيل المثال، وضع غطاء زجاجي يحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء غير المسمى^25،²⁶ في غرفة الخلية وإضافة 1 مل من العازلة).
إعداد عينة منفصلة ذات علامة واحدة لكل تسمية فلورسنت مستخدمة في التجربة على النحو التالي:
1. إضافة تسمية الميتوكوندريا المخففة إلى المخزن المؤقت لتحقيق تركيز 100 nM. أضف هذا المخزن المؤقت إلى غطاء الغطاء الذي يحتوي على خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء. حضانة لمدة 20 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. نقل غطاء إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت. لاحظ أن التركيز الأمثل لتسمية الميتوكوندريا سوف تختلف حسب عوامل مثل الشركة المصنعة، واللون المرتبط، والخصوصية المطلوبة.
2. نقل غطاء تحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء transfected مع التحقيق GCaMP²⁷ إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من العازلة.
إعداد عينة تجريبية واحدة أو أكثر تحتوي على خليط من التسميات الفلورية المطلوبة.
1. إضافة 1 مل من العازلة (100 تركيز NM من تسمية الميتوكوندريا) إلى غطاء يحتوي على خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء المنقولة مع التحقيق GCaMP وحضانة لمدة 20 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. نقل غطاء إلى غرفة الخلية وإضافة 1 مل من المخزن المؤقت.

5- الحصول على البيانات:

تحقق من أن beamsplitter ثنائي ة ثنائية الشكل (على سبيل المثال، 495 نانومتر مكعب مرشح ثنائي الأبعاد)، والهدف (على سبيل المثال، 60X هدف المياه)، والكاميرا (كاميرا sCMOS) يتم اختيارها.
تحميل العينة على خشبة المسرح.
انقر نقرًا مزدوجًا فوق المربع بجوار التعرض [مللي ثانية] واكتب "100" لتعيين وقت التعرض عند 100 مللي ثانية، لاحظ أن وقت التعرض قد يحتاج إلى زيادة أو إنقاص وفقًا لشدة الفلورة للعينة.
حدد 475 نانومتر من القائمة المنسدلة من الإطار الرئيسي مدير صغير لعرض العينة الأولية. لاحظ أن 475 نانومتر قد لا يكون الطول الموجي الأمثل لعرض العينة أو تحديد ما إذا كان التشبع الزائد سيحدث في جميع أنحاء مكدس الصور.
انقر فوق مباشر لعرض النموذج.
1. انقر فوق زر نطاق عرض كثافة التلقائي السيارات بجوار الرسم البياني في الجزء السفلي من النافذة لجلب القيم الدنيا والقصوى في نطاقات بصرية ذات مغزى.
استخدام المقابض التركيز المجهر للتركيز على العينة. غالباً ما يكون من المفيد العثور على حافة العينة للمساعدة في التركيز. سيتم تركيز العينة عندما تظهر ميزات الحافة في الصورة حادة. لاحظ أنه قد يكون من الضروري النقر فوق الزر تلقائي عدة مرات أثناء التركيز للمساعدة في عرض صورة الفلورة. بالإضافة إلى ذلك، قد يجد بعض المستخدمين أنه من الأسهل التركيز على العينة إذا كان المجهر في وضع الإرسال.
1. إذا كان التركيز في وضع الإرسال، للسلامة، تأكد أولاً من أن مصدر الضوء الطيفي لا ينقل الضوء إلى الأعين قبل ضبط مسار الضوء لتصوير الإرسال. لاحظ أيضًا أنه قد تكون هناك انحرافات صغيرة بين تركيز صور الإرسال والفلورة. وعندما يتحقق التركيز المقبول، نعيد تكوين مسار الضوء للتصوير الطيفي الفلوري.
انقر فوق Acq متعدد الد. بالقرب من أعلى يسار الإطار لفتح أداة الاكتساب متعدد الأبعاد (الموضحة والمكونة في القسم 2).
اختيار نطاق طيفي مناسب للاكتساب الطيفي (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر لفلتر ثنائي الأبعاد 495 نانومتر) بالنقر فوق الزر Load... في الجزء العلوي الأيمن من نافذة أداة الاكتساب متعددة الأبعاد والتنقل إلى إعدادات الإثارة حفظها مسبقا (في الخطوة 2.1.4.10). انظر المناقشة للحصول على معلومات بشأن النطاقات الطيفية المناسبة.
الحصول على خلفية / صورة فارغة التي لا تحتوي على بيانات الفلورة لاستخدامها في الخلفية والطرح الضوضاء. يمكن تنفيذ ذلك باستخدام نموذج فارغ (الخطوة 4.1) أو عن طريق التنقل إلى منطقة فارغة من عينة تجريبية. كما هو موضح في الخطوة 5.6، يتم تحقيق هذا بسهولة عن طريق العثور على حافة العينة ثم وضعها بحيث يتم توسيط الحافة داخل مجال العرض.
1. بمجرد تأكيد إعدادات الاكتساب وظهور منطقة خلفية، انقر فوق الزر Acquire! للحصول على كومة صور طيفية تحتوي على خلفية وضوضاء لاستخدامها للطرح لاحقًا. وتجدر الإشارة إلى أن العينات من المرجح أن يكون لها الفلورة أكثر كثافة بعيدا عن حافة العينة. قد يكون من المستحسن التحرك حول العينة للعثور على المناطق "ألمع" وإجراء عدة مكدسات صور الاختبار لتحديد أوقات الاكتساب المناسبة وتجنب التعرض المفرط.
خذ كومة صورة واحدة على منطقة من العينة التي يبدو أن لديها الفلورة مكثفة لضمان عدم وجود مزيج من الأطوال الموجية وأن أوقات التعرض يؤدي إلى التعرض المفرط.
استخدم ImageJ للتأكد من عدم احتواء الأطوال الموجية على بيكسلات مكشوفة.
1. في ImageJ، انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور وانتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية التي تم التقاطها في الخطوة 5.10. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انقر فوق المربع بجوار عدد الصور وأدخل عدد الأطوال الموجية المضمنة في المسح الطيفي (على سبيل المثال، 26). ترك بداية الصورة وزيادة كـ "1". انقر فوق الزر موافق للمتابعة.
2. اضغط على M على لوحة المفاتيح للاستفادة من وظيفة قياس ImageJ. تأكد من أن الرقم المدرج ضمن Max ليس الحد الأقصى للكشف عن الكاميرا (على سبيل المثال، 65,535). كرر لكل صورة في الفحص الطيفي. لاحظ أن حد الكشف عن الكاميرا يعتمد على الكاميرا نفسها. يتم عرض الحد العلوي في الجزء العلوي الأيمن من الرسم البياني في الإطار الرئيسي من MicroManager. بدلاً من ذلك، يمكن تحديد الحد الأعلى عن طريق فتح صورة في ImageJ والتنقل إلى الصورة > ضبط > السطوع/التباين. انقر فوق الزر تعيين في النافذة المنبثقة الناتجة، وأدخل قيمة كبيرة بشكل مفرط (على سبيل المثال، 999,999) في الفراغ بجوار الحد الأقصى للقيمة المعروضة، وانقر فوق موافق للمتابعة. يجب أن تكون القيمة القصوى المعروضة في الرسم البياني الجديد حد الكشف العلوي للكاميرا.
3. وإذا كانت أي صور تحتوي على الحد الأعلى للكشف عن الكاميرا (على سبيل المثال، 535 65)، اضبط وقت التعرض للمسح الطيفي لضمان ألا تتجاوز الإشارة القصوى في جميع أنحاء النطاق الطيفي النطاق الدينامي للكاميرا.
الحصول على بيانات الصورة الطيفية من عينات غير مسمى لتحديد أي الفلورة الذاتية. الحصول على المسح الضوئي للعينات غير المسماة باستخدام نطاق الطول الموجي متطابقة وإعدادات الكاميرا كما تبقى من التجربة (على سبيل المثال، 360-485 نانومتر في 100 مللي ثانية لكل طول موجة).
الحصول على بيانات الصورة الطيفية من عينات تحمل علامة واحدة لاستخدامها كضوابط طيفية لبناء المكتبة الطيفية. إجراء المسح الضوئي لكل تسمية باستخدام نطاق الطول الموجي متطابقة، ووقت التعرض، وإعدادات الكاميرا. لاحظ أنه قد تكون هناك حاجة إلى وقت أطول للحصول على بعض العينات للسماح بالكشف الدقيق عن طيف الملصقات مع الحد الأدنى من المساهمة في الضوضاء.
إجراء قياسات على عينة تجريبية (على سبيل المثال، خلايا العضلات الملساء مجرى الهواء البشري مع مسبار GCaMP وتسمية الميتوكوندريا).
1. ضع شريحة أو غطاء تحتوي على العينة التجريبية على المجهر.
2. حدد حقل طريقة عرض مع خلايا الأنسجة المسماة بشكل مناسب.
3. الحصول على بيانات الصورة الطيفية باستخدام إعدادات الاكتساب المطلوبة، كما هو موضح أعلاه.

6. تحليل الصور

تصحيح الصور إلى استجابة طيفية مسطحة.
1. طرح طيف الخلفية الذي تم الحصول عليه في القسم 5-9 وضربه بمعامل التصحيح المحدد في الفرع 3-1-5. يمكن القيام بذلك باستخدام برنامج نصي MATLAB بسيط أو روتين ImageJ. يتوفر رمز MATLAB للطرح/التصحيح (المستخدم في هذا المثال) على موقع موارد التصوير الحيوي لجامعة جنوب ألاباما.
  1. تحميل رمز الطرح/التصحيح في MATLAB.
  2. في علامة التبويب محرر، انقر فوق تشغيل. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة تحتوي على زر تصحيح Bsq. انقر فوق الزر تصحيح Bsq لفتح إطار آخر يحتوي على خيارات لدليل العمل وملف الخلفية وملف عامل التصحيح ومجلد tiff غير المصحح.
    1. استخدام الاستعراض... بجانب "دليل العمل" لاختيار مسار الملف حيث سيتم فتح الإطارات اللاحقة. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على طيف الخلفية المحفوظة (بتنسيق .dat).
    2. استخدام الاستعراض... بجانب ملف الخلفية (.dat) لفتح الدليل الذي تم اختياره في الخطوة 6.1.1.2.1 واختيار ملف الخلفية المطلوب (بتنسيق .dat). انقر فوق الزر فتح للمتابعة.
    3. استخدم الزر استعراض... الدليل لـ عامل التصحيح الافتراضي إلى موقع التعليمات البرمجية MATLAB الأصل. إذا لزم الأمر، انتقل إلى المجلد الفرعي الذي يحتوي على ملف عامل التصحيح (بتنسيق .dat). قم بتمييز ملف عامل التصحيح المناسب وانقر فوق الزر فتح للمتابعة.
    4. استخدم الزر استعراض... بجانب مجلد Tiff غير مصحح لفتح الدليل الذي تم اختياره في الخطوة 6.1.1.2.1 واختيار المجلد للطرح الخلفية وتصحيح الصورة (هذا عادةً المجلد Pos0 الذي يحتوي على الخام فوراً الصور الطيفية). انقر فوق الزر فتح للمتابعة.
    5. انقر فوق انقر للتصحيح الطيفي. بعد اكتمال المعالجة، سيتم فتح نافذة مع رسالة "Bsq تصحيح كاملة". انقر فوق الزر موافق للمتابعة. يتم تخزين صور التصحيح في مجلد جديد يسمى مع مجلد الصورة الطيفية الخام الأصلي و "_Corrected" إضافية (على سبيل المثال، Pos0_Corrected).
إنشاء المكتبة الطيفية. ويمكن استخدام عدة مجموعات من البرامج لاستخراج البيانات الطيفية من الصور، بما في ذلك ImageJ. للحصول على أفضل النتائج، قم بتطبيع كل عضو نهاية إلى نطاق الطول الموجي من أكبر كثافة عن طريق تحديد النطاق الطول الموجي الذي له القيمة الأكثر كثافة وتقسيم القياس في كل نطاق الطول الموجي بتلك القيمة القصوى. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن عناصر التحكم ذات التسمية المفردة التي تم إنشاؤها داخل عينات الفلورسنت التلقائي ستحتاج إلى تعديلات إضافية²⁸^و29^و30^و31^و32. انظر الخطوة 6-2-4 والمناقشة للاطلاع على التفاصيل.
1. في ImageJ، انقر فوق ملف > استيراد > تسلسل الصور. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية المصححة. انقر نقراً مزدوجاً فوق أي ملف صورة في المجلد لفتح إطار جديد. انقر فوق المربع بجوار عدد الصور وأدخل عدد الأطوال الموجية المضمنة في المسح الطيفي (على سبيل المثال، 26). ترك بداية الصورة وزيادة كـ "1". انقر فوق الزر موافق للمتابعة.
2. في الإطار الرئيسي ImageJ، انقر فوق رمز تحديدات المضلع، ثم استخدم مؤشر الماوس بالنقر فوق الصورة لإنشاء مضلع حول منطقة تحتوي على بيانات الفلورة. لاحظ أنه قد يكون هناك القليل من البيانات الفلورية في الطول الموجي الأولي. انتقل إلى صورة طول موجة أخرى و/أو استخدم أداة السطوع/التباين (Image> ضبط > السطوع/التباين >تلقائي) لتصور المناطق التي تحتوي على بيانات الفلورة ذات الاهتمام بشكل أفضل.
3. مع المضلع رسمها، إنشاء ملف تعريف محور Z عن طريق النقر فوق صورة > مكدسات > رسم Z-محور الشخصي. سيؤدي هذا إلى فتح نافذة جديدة. انقر فوق حفظ لحفظ البيانات الطيفية كملف .csv.
4. إجراء الطرح لضمان مكتبة الطيفية المناسبة مع تسميات نقية خالية من التلوث autofluorescence. استخدم المعادلة 29 التالية لعزل طيف نقي عن خليط من تسمية واحدة وفلورة:
  (1)
  حيث: S نقية هو الطيف النقي من التسمية، S_مختلطة هو الطيف المقاس للعينة الملوثة autofluorescence، S _autoFL هو الطيف autofluorescence قياس، "أ" هو مقياس مضاعف طيف الفلورة الذاتية (بين 0 و1؛ على سبيل المثال، 0.4)، و"الإزاحة" هو إزاحة (عادة 0). تختلف عبارة "أ" حتى يتم تحقيق قيمة شبه الصفر للمساهمة الظاهرة من autofluorescence. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية في العديد من المنشورات^28،^29،^30،^31،³².
فك خلط بيانات الصورة الطيفية. سوف خطوة فك توليد صورة وفرة لكل تسمية الفلورسنت، حيث وفرة هو كمية إشارة الفلورة النسبية في الصورة من التسمية المعنية. تتوفر العديد من خوارزميات فك الخلط للاستخدام مع ImageJ³³^،³⁴^،³⁵. بالإضافة إلى ذلك، يتوفر رمز MATLAB طيفي (يستخدم في هذا المثال) على موقع موارد التصوير الحيوي لجامعة جنوب ألاباما. وهناك نظرة عامة أشمل على فك الخلط الطيفي متاح³⁶.
1. قم بتحميل رمز فك الخلط الطيفي في MATLAB.
2. تحرير ملفات Wavelength.mat وLibrary.mat لتتوافق مع الظروف التجريبية (على سبيل المثال، "الطول الموجي" كما 360-485 بزيادات من خمسة).
  ملاحظة: يجب تحميل القيم المقابلة لتلك الأطوال الموجية في "مكتبة" لكل تسمية الفلورسنت (وautofluorescence). Endmember_Name يجب سرد التسميات بنفس ترتيب قيم العمود "مكتبة". لاحظ أن الملف Library.mat يجب أن يحتوي على متغيرات "مكتبة" و "Endmember_Name".
3. في علامة التبويب محرر، انقر فوق تشغيل. سيؤدي ذلك إلى فتح إطار جديد يسمح للمستخدم باختيار دليل. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور الطيفية لتكون غير مختلطة. بمجرد تحديده، سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة جديدة.
4. في الفراغات الناتجة، أدخل اسم الصورة (على سبيل المثال، HASMC مع GCaMP وMito FOV1)، وعدد نطاقات الطول الموجي (على سبيل المثال، 26)، وعدد النقاط الزمنية (على سبيل المثال، 1) وما إذا كان من المرغوب في قياس FRET (على سبيل المثال، ن) في الفراغات الخاصة بكل منهما. إذا تم تحديد "n" لـ FRET، اترك كل من الفراغات العضو النهائي فارغة. اضغط "موافق" للمتابعة، والتي ستفتح نافذة جديدة.
5. Naviagate إلى المجلد الذي يحتوي على الملف Wavelength.mat. بمجرد تحديده، انقر فوق فتح للمتابعة، والذي سيفتح نافذة جديدة.
6. انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الملف Library.mat. بمجرد تحديده، انقر فوق فتح للمتابعة، مما سيؤدي إلى حفظ الصور غير المختلطة في مجلد جديد "غير مختلط" داخل الدليل الذي يحتوي على الصور الطيفية.
فحص الصور الطيفية غير المختلطة للجودة.
1. افتح كل صورة غير مختلطة لفحص توزيع المكونات النقية بشكل مرئي.
  1. مقارنة حجم صورة الخطأ مع الصور غير المختلطة (على غرار الخطوة 5.11، يمكن أن يتم ذلك من خلال وظيفة قياس ImageJ). وإذا كان حجم صورة الخطأ مماثلاً من حيث الحجم لصور الوفرة غير المختلطة، فمن المرجح أن تكون هناك إشارات في بيانات الصورة الطيفية لا تحسبها بدقة المكتبة الطيفية والعملية الخطية للفك الطيفي.
  2. مقارنة صورة الخطأ إلى الصور غير المختلطة لمعرفة ما إذا كان هناك بنيات متبقية غير معروفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومن الضروري اتخاذ عدة خطوات هامة من هذا البروتوكول لضمان جمع البيانات الدقيقة والخالية من التصوير والقطع الأثرية الطيفية. وقد يؤدي تخطي هذه الخطوات إلى بيانات تبدو هامة ولكن لا يمكن التحقق منها أو استنساخها مع أي نظام تصوير طيفي آخر، مما يبطل فعلياً أي استنتاجات يتم التوصل إليها باستخدام البيانات المذكورة. ومن أهم هذه الخطوات الهامة تصحيح النواتج الطيفية السليمة (القسم 3). ويعوض عامل التصحيح عن التغيرات المعتمدة على الطول الموجي في الناتج الطيفي لنظام الإثارة القابل للضبط. ويتم ذلك عن طري...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدأ الاستخدام الأمثل لإعداد التصوير فوق الطيفي المسح يُظهر ببناء مسار الضوء. وعلى وجه الخصوص، فإن اختيار مصدر الضوء، والمرشحات (القابلة للضبط وثنائية الديكروويك)، وطريقة تبديل الفلاتر، والكاميرا تحدد النطاق الطيفي المتاح، وسرعة المسح المحتملة، وحساسية الكاشف، وأخذ العينات المكانية. تقدم مصابيح قوس الزئبق العديد من قمم الطول الموجي للإثارة ولكنها لا توفر مخرجاً طيفياً مسطحاً وستتطلب تخفيضاً كبيراً للإشارة عند قمم المخرجات لتصحيح بيانات الصورة الطيفية مرة أخرى إلى استجابة يمكن تتبعها من NIST^38. مصا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدكتور ليفسلي وريتش يكشفان عن اهتمام مالي في شركة ناشئة، SpectraCyte LLC، تأسست لتسويق تكنولوجيا التصوير الطيفي.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم من NSF 1725937، وNIH P01HL066299، وNIH R01HL058506، وNIH S10OD020149، وNIH UL1 TR001417، وNIH R01HL137030، AHA 18PRE34060163، وصندوق أبراهام ميتشل لبحوث السرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء	التبادل الوطني لأبحاث الأمراض (NDRI)	معزولة من أنسجة الرئة البشرية التي تم الحصول عليها من NDRI	الخلايا الحساسة للكالسيوم عالية الفلورسنت
الذاتي Automated	Shutter Thorlabs Inc.	SHB1	مصراع يمكن التحكم فيه عن بعد لتقليل التبييض الضوئي
المرحلة الآلية H177P1T4	العلمية السابقة		مرحلة يمكن التحكم فيها عن بعد لمجال الرؤية الآلي المتعدد أو جمع الصور المخيطة.
وحدة التحكم في المرحلة الآلية (XY)	السابق Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	للتفاعل مع المرحلة الآلية مع الكمبيوتر وعصا
التحكم Buffer	مصنوع داخليا	صنع داخليا	145 ملي كلوريد الصوديوم ، 4 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار HEPES ، 10 ملي مولار D-glucose ، 1 ملي مولار MgCl _{2< / sub> ، و 1 ملي مولار CaCl _{2< / sub> ، عند درجة الحموضة 7.3}}
غرفة الخلية	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber ، A7816	حامل Coverslip يتكون من الفولاذ المقاوم للصدأ الجراحي وحلقة مطاطية O لإغلاق الوسائط ومنع العينة و / أو التلوث الموضوعي
مرشحات	الإثارة Semrock Inc.	TBP01-378 / 16	نطاق الطول الموجي المركزي (340-378 نانومتر) ، عرض النطاق الترددي (الحد الأدنى 16 نانومتر ، FWHM الاسمي 20 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.88)
	شركة Semrock Inc.	TBP01-402 / 16	نطاق الطول الموجي المركزي (360-400 نانومتر) ، عرض النطاق الترددي (الحد الأدنى 16 نانومتر ، FWHM الاسمي 20 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.8)
	شركة Semrock Inc.	TBP01-449 / 15	نطاق الطول الموجي المركزي (400-448.8 نانومتر) ، عرض النطاق الترددي (الحد الأدنى 15 نانومتر ، FWHM الاسمي 20 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.8)
	شركة Semrock Inc.	TBP01-501 / 15	نطاق الطول الموجي المركزي (448.8-501.5 نانومتر) ، عرض النطاق الترددي (الحد الأدنى 15 نانومتر ، FWHM الاسمي 20 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.84)
	شركة Semrock Inc.	TBP01-561 / 14	نطاق الطول الموجي المركزي (501.5-561 نانومتر) ، عرض النطاق الترددي (الحد الأدنى 14 نانومتر ، FWHM الاسمي 20 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.83)
مرشح التألق ثنائي اللون Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	يفصل بين ضوء الإثارة والانبعاث عند 495 نانومتر (انعكاس >98٪ بين 350-488 نانومتر ، انتقال >93٪ بين 502-950 نانومتر) ، مؤشر فعال للمرشح (1.78)
الفلورة مكعب Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496 / LP-25	يسمح بمرور الضوء أطول من 496 نانومتر (>93٪ متوسط الإرسال بين 503.2-1100 نانومتر) ، معامل الانكسار (1.86)
مسبار GCaMP	Addgene	G-CaMP3 ؛ البلازميد # 22692	مؤشر كالسيوم مشفر وراثيا أحادي الطول الموجي يعتمد على GCaMP2
يدمج بصريات المحيط الكروية		FOIS-1	يستخدم للقياس الدقيق للإضاءة ذات الزاوية العريضة المجهر
المضان المقلوب	نيكون	TE2000	تسمح المجاهر المقلوبة بالإثارة المباشرة للعينة دون الحاجة إلى اختراق طبقات الوسائط و / أو الأنسجة.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	ملصقات الميتوكوندريا
NIST مصباح معايرة يمكن تتبعه Ocean	Optics	LS-1-CAL-INT	مصباح ذو طيف معروف للاستخدام كمعيار
NIST يمكن تتبعه الفلورسين	ThermoFisher Scientific	F36915	للتحقق من الاستجابة الطيفية المناسبة للنظام
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	الملصقات نوى الخلايا
الهدف (10X)	خطة أدوات نيكون	Apo & lambda; 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	مفيد لمجالات الرؤية الكبيرة
الهدف (20X)	خطة أدوات نيكون	Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	غالبا ما تستخدم لعينات الأنسجة
الهدف (60X)	خطة أدوات نيكون	Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	غالبا ما تستخدم لعينات الخلايا
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	للحصول على صور رقمية عالية الحساسية
مطياف	بصريات المحيط	QE65000	تستخدم لقياس الإخراج الطيفي لنظام المسح الطيفي للإثارة
		Lambda VF-5	وحدة آلية لضبط مرشح الإثارة الآلي / تبديل
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	مصدر الضوء مع إخراج طيفي موحد نسبيا

مكعب مرشح أدوات المضافة أداة المسح الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901(2013).
Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901(2013).
Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901(2014).
Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802(2018).
Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
Hege, E. K., O'Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034(2018).
Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
Gowen, A., O'Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518(2018).
Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Biochemistry. 44 (42), 13771-13782 (2005).
Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207(2005).
Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601(2007).
Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
Spectral Unmixing Plugins. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html (2006).
Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing-plugin.html (2006).
Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
Microscopy Key, Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , https://www.photonics.com/Articles/Microscopy_Key_Considerations_for_Nonlaser_Light/a58212 (2016).
Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , https://www.scientifica.uk.com/Learning-zone/choosing-the-best-light-source-for-your-experiment (2019).
Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614(2014).
Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017(2014).
Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M(2019).
Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B(2019).
Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
Comparison with other microscopy software - Micro-manager. , https://micro-manager.org/wiki/Comparison_with_other_microscopy_software (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Micromanager Image J MATLAB

التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة