يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

10K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59454

⸱

يناير 16, 2020

 ,  ,  , 
1Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People's Hospital, 2Department of Anatomy of Physiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نحن نقدم بروتوكولا لفحص ألوان من النشاط synthase سيترات للقياس الكمي من كتله الميتوكوندريا سليمه في الانسجه المتجانسة .

الملخص

الميتوكوندريا تلعب الأدوار الأكثر بروزا في الأيض الخلوية عن طريق إنتاج ATP من خلال فوسفولات الاكسده وتنظيم مجموعه متنوعة من العمليات الفسيولوجية. خلل الميتوكوندريا هو السبب الرئيسي لعدد من الامراض الايضيه والعصبية. الميتوكوندريا سليمه هي حاسمه لأداءها السليم. يتم تعريب سيترات الانزيم synthase في مصفوفة الميتوكوندريا التالي يمكن استخدامها كعلامة انزيم الكمية من كتله الميتوكوندريا سليمه. النظر إلى ان العديد من الجزيئات والمسارات التي لها وظائف هامه في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين البشر و دروفيسيلا، وان هناك مجموعه من الاداات الجينية القوية متوفرة في دروفيا، فان دروفيسيلا تعمل كنظام نموذجي جيد لدراسة وظيفة الميتوكوندريا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لقياس سريع وبسيط من النشاط synthase سيترات في المتجانسات الانسجه من الذباب الكبار دون عزل الميتوكوندريا. هذا البروتوكول هو أيضا مناسبه لقياس النشاط synthase سيترات في اليرقات, الخلايا المستزرعة, وانسجه الثدييات.

المقدمة

الميتوكوندريا هي المعروفة باسم العضوية المنتجة للطاقة في معظم الكائنات الحية النواة ، والتي تنتج العملة الطاقة ، ATP ، من خلال دوره حمض تريكاربوكسيليك (اي ، دوره كريبس) والاكسده فوسفولات. ووجدت الميتوكوندريا أيضا للعب ادوار هامه في الكثير من العمليات الفسيولوجية الأخرى, مثل تنظيم المبرمج1, Ca2 + التوازن2,3, أنواع الاكسده التفاعلية (ROS) جيل4, والشبكية إندوبلازمي (ER)-استجابه الإجهاد5. الخلل الميتوكوندريا يمكن ان تؤثر علي اي عضو في الجسم في اي عمر وهو السبب الرئيسي لاستقلاب, الشيخوخة المرتبطة6, وامراض الأعصاب7. الميتوكوندريا سليمه ذات الصلة ميكانيكيه إلى وظيفة الميتوكوندريا. التالي, التحديد الكمي السليم للكتلة الميتوكوندريا سليمه مهم جدا لتقييم وظيفة الميتوكوندريا8. Synthase سيترات, انزيم الحد من معدل في الخطوة الاولي من دوره حمض تريكاربوكسيليك9, مترجمه في مصفوفة الميتوكوندريا داخل الخلايا النواة, التالي يمكن استخدامها كعلامة كميه لوجود كتله الميتوكوندريا سليمه9,10. سيترات synthase النشاط يمكن أيضا ان تستخدم كعامل تطبيع للبروتينات الميتوكوندريا سليمه11,12.

ذبابه الفاكهة ، دروكوفيلا ميلغاستر، هو نظام نموذجي ممتاز لدراسة وظيفة الميتوكوندريا ، كما العديد من الجزيئات والمسارات التي تلعب دورا محوريا في الميتوكوندريا يتم الحفاظ عليها تطوريا من دروفيبيلا إلى البشر13،14،15. هنا ، نقدم بروتوكولا لطريقه سريعة وبسيطه لقياس النشاط synthase سيترات بواسطة فحص الملونة في الانسجه دروفيا المتجانسات16 في شكل لوحه جيد 96. في اختبار النشاط سينثاز سيترات ، synthase سيترات في الانسجه المتجانسة في دروفيسيلا يحفز رد فعل اوكسالوخلات مع انزيم اسيتيل A (اسيتيل coa) لتشكيل سيترات COA-SH وH +. CoA-SH يتفاعل لاحقا مع 5 ، 5 '-dithiobis-(2-حمض نيتروبنزويك) (DTNB) لتوليد منتج ملون ، 2-نيترو-5-ثيوبنزواتي (TNB) ، والتي يمكن قياسها بسهوله فوتومتر في 412 nm. يمكن ان ينعكس نشاط synthase سيترات بمعدل إنتاج ألوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. القياس اللوني سيترات Synthase النشاط المقايسة ل d. الميلاغوجاستر16

  1. جمع عشره الذباب الكبار لكل عينه. جمع علي الأقل عينات ثلاثية لكل النمط الجيني.
  2. اعداد 500 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة التي تحتوي علي 20 مم HEPES (pH = 7.2) ، 1 مم أدتا ، و 0.1 ٪ تريتون X-100 في أنبوب اختبار 1.5 mL لكل عينه.
  3. تخدير الكبار الذباب مع CO2 علي وساده التخدير وعزل الانسجه المطلوبة. لعزل الصدر ذبابه الكبار ، علي سبيل المثال ، إصلاح الصدر ذبابه من قبل زوج من الملقط ، ومن ثم عزل ذبابه بطون عن طريق قطع علي طول الحدود للصدر والبطن باستخدام زوج من المقص. جمع الصدر ذبابه لاختبار النشاط سيترات العضلات synthase.
    ملاحظه: تحديد الوزن الطازج من الانسجه في هذه الخطوة إذا استخدامه لتطبيع سيترات synthase النشاط.
  4. نقل 10 الكبار يطير الصدر إلى 100 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة علي الفور والتجانس مع مدقه علي الجليد. للحفاظ علي عينات الجليد الباردة ، والتجانس عينات ل 5-10 s علي الجليد ، ثم يكون عينات الجلوس علي الجليد لمده 5 ليالي ، وتكرار حتى جميع الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما.
    ملاحظه: الشريط الأنبوب ، والتحقق من تجانس للتاكد من انه لا توجد جلطات في المتجانسات وان الانسجه في الأنبوب متجانسة تماما. وينبغي اجراء جميع العلاجات عينه علي الجليد.
  5. خذ 10 μL من كل عينه متجانسة في أنبوب جديد لقياس محتوي البروتين. الحفاظ علي عينات لقياس البروتين علي الجليد.
    ملاحظه: يمكن تجميد عينات البروتين وتخزينها في-80 درجه مئوية للتحليل في وقت لاحق. تركيزات البروتين بمثابه معلمه داخلية لتطبيع الانشطه synthase سيترات.
  6. أضافه 400 μL من الجليد الباردة استخراج العازلة لكل عينه المتبقية لجعل حجم الكلي من 500 μL. اخلط جيدا عن طريق السحب بلطف صعودا وهبوطا 5x علي الأقل ، وتجنب تشكيل فقاعه. لكل رد فعل, أضافه 1 μl من الخلايا المخففة محلله إلى 150 μl من حل رد فعل أعدت حديثا (20 مم تريس-HCl (pH 8.0), 0.1 mm dtnb, 0.3 مم اسيتيل CoA, 1 مم حمض اوكسالواستيك). تخلط جيدا وعلي الفور عن طريق الأنابيب بلطف ، وتجنب تشكيل فقاعه. قياس الامتصاص في 412 nm كل 10-30 s ل 4 دقيقه عند 25 درجه مئوية باستخدام قارئ لوحه قادره علي قياس الامتصاص في 412 nm علي فترات الحد الأدنى من 10 s.
    ملاحظه: تغيير غيض قبل الأنابيب كاشف مختلفه وتجنب تشكيل فقاعات في الآبار. خلط غير مكتملة من الكواشف قد يسبب اختلافات في القياسات. وينبغي ان يتم فحص النشاط سينثاز سيترات في درجه حرارة الغرفة مباشره بعد جمع العينات ، كما يتم استخدام هذا الفحص لقياس كتله الميتوكوندريا سليمه. يجب اعداد المخزن المؤقت للتفاعل مباشره قبل الاستخدام ويجب عدم تخزينه.
  7. بيانات الرسم كامتصاص الكثافة البصرية (OD) (abs) (المحور ص) مقابل الوقت (بالدقائق) (المحور س). ثم يحسب الميل للجزء الخطي من المنحني ، حيث معدل التفاعل هو

    figure-protocol-1

    تقسم القيمة حسب تركيز البروتين العينة لتطبيع نشاط synthase سيترات. يتم احتساب نشاط synthase سيترات كما

    figure-protocol-2

    ملاحظه: يمكن قياس تركيز البروتين العينة بواسطة مجموعه فحص تركيز البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويقدم الشكل 1 مثالا علي المنحنيات الحركية لامتصاص التردد الOD عند 412 نانومتر بمرور الوقت الذي تم الحصول عليه باستخدام الفحص اللوني لنشاط السيترات سيترات لقياس انسجه الصدر الصدرية المتجانسة لمختلف الأنماط الجينية. ومن المعروف جيدا ان PGC-1α هو منظم رئيسي لنشاه الميتوكوندريا الحيوية. يتم الحفاظ علي PGC-1α من الناحية الوظيفية بين دروفيا والبشر. دروفيا RNF34 (dRNF34) هو E3 اوبيكييتين ليتاز لل دروفيبيلا pgc-1Α ، dpgc-1 ، ويعزز ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يجب ان تاخذ الدراسات الايضيه التي تستخدم دروفيسيلا كنموذج في الاعتبار الخلفية الوراثية ، والنظام الغذائي ، وصيانة المخزون من الذباب18. لتجنب اثار الخلفيات الوراثية المختلفة علي قياس النشاط synthase سيترات ، يجب ان تكون السلالات المختلفة من دروكوفيلا إلى سلاله السيطرة لمده 10 أجيال. الخلفية الجينية لجميع سلالات دروفيا المستخدمة في تجاربنا هي w1118، لذلك استخدمنا w1118 كعنصر تحكم. عموما ، ونحن نعتقد w1118 هو الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31401013 و 31471010) ، ولجنه العلوم والتكنولوجيا التابعة لبلديه شنغهاي ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (14PJ1405900) ، ومؤسسه العلوم الطبيعية التابعة شنغهاي (19ZR1446400).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2- [4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيل] حمض الإيثان سلفونيك (HEPES)سيجما ألدريتشV900477
2-أمينو -2- (هيدروكسي ميثيل) -1،3-بروبانديول (قاعدة تريزاما)سيجما ألدريتشV900483
أسيتيل CoAسيجما ألدريتشA2181
حمض ديثيو بيس نيتروبنزويك (DTNB)سيجما ألدريتشD8130
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)سيجما ألدريتشV900106
أوكسالو أسيتاتسيجما-ألدريتشO4126
بيليه مدقةسانجونF619072
بيليه مدقة محركTiangenOSE-Y10
قارئ لوحةBioTekEon
Protein BCA مجموعة الفحصBeyotimeP0010S
مقصWPI14124
Triton X-100SangonA110694-0100

المراجع

  1. Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans. Cell. 157 (4), 897-909 (2014).
  2. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).
  3. Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
  4. Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers! Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).
  5. Kim, H. E., et al. Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response. Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).
  6. Wang, Y., Hekimi, S. Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot. Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).
  7. Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model. Cell Death & Disease. 5, e984(2014).
  8. Tronstad, K. J., et al. Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content. Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).
  9. Wiegand, G., Remington, S. J. Citrate synthase: structure, control, and mechanism. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).
  10. Lopez-Lluch, G., et al. Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).
  11. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).
  12. Gillen, J. B., et al. Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment. PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).
  13. Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein. Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).
  14. Mukherjee, S., Duttaroy, A. Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila. Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).
  15. Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).
  16. Rera, M., et al. Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog. Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).
  17. Wei, P., et al. RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).
  18. Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. Methods for studying metabolism in Drosophila. Methods. 68 (1), 105-115 (2014).
  19. Bosco, G., et al. Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.