مقالة منهجية

اعداد وتطبيق البكتيريا الجرثومية الجديدة للكشف المفترض لبقايا الطلقات النارية

DOI:

10.3791/59471

⸱

مايو 9, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Longwood University, 2Department of Chemistry and Physics, Longwood University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم بروتوكول باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية لتوليف مجموعه من البكتيريا البيولوجية البكتيرية لتحليل بقايا الطلقات النارية ، واختبار أداء الاجهزه لاستخدامها المقصود باستخدام الطيفية الفلورية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbocop هو هو استشعار التي تم تصميمها لتطبيق فريد من نوعه في الكيمياء الشرعية. MicRoboCop هو نظام يتكون من ثلاثه أجهزه التي ، عند استخدامها معا ، يمكن ان تشير إلى وجود بقايا الطلقات النارية (GSR) عن طريق إنتاج اشاره مضان في وجود ثلاثه التحاليل الرئيسية (الإثمد ، والرصاص ، والمكونات العضوية من GSR). ويصف البروتوكول توليف الاجهزه البيولوجية باستخدام القولونية (كولاي) ، وأساليب الكيمياء التحليلية المستخدمة لتقييم الانتقائية وحساسية المستشعرات. ويتجلى أداء النظام باستخدام GSR الذي تم جمعه من داخل غلاف خرطوشه مستهلكه. وبمجرد الاعداد ، يمكن تخزين العناصر البيولوجية حتى الحاجة ويمكن استخدامها كاختبار لهذه التحاليل الرئيسية. وتوفر الاستجابة الايجابيه من جميع التحاليل الثلاثة اختبارا إيجابيا افتراضيا لهذه الاداه ، في حين ان كل جهاز علي حده لديه تطبيقات للكشف عن التحاليل في عينات أخرى (مثل كاشف للتلوث بالرصاص في مياه الشرب). والقيد الرئيسي لهذا النظام هو الوقت اللازم للاشاره الايجابيه ؛ قد يتضمن العمل المستقبلي دراسة الكائنات الحية المختلفة لتحسين وقت الاستجابة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز الحيوي هو اي أداه تحليليه تستخدم المكونات البيولوجية (مثل البروتينات أو الأحماض النووية أو الكائنات الحية الكاملة) التي تنتج الاستجابة التي يمكن استخدامها للكشف عن ماده كيميائية أو تحليليه. وكمثال علي ذلك ، استخدمت صناعه تعدين الفحم البيولوجي لفتره طويلة من القرن العشرين للكشف عن وجود غازات ألغام السامة: الكناري في منجم الفحم1. وقد لاحظ عمال المناجم استجابه الكائن البيولوجي (الوفاة أو الكرب) لماده كيميائية (أول أكسيد الكربون) من أجل حماية العمال. في مثال أكثر حداثة وتطورا ، يمكن تغيير البكتيريا باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية للرد علي وجود تحلل كيميائي معين من خلال إظهار استجابه محدده ، مثل التعبير عن بروتين فلوري.

البيولوجيا التركيبية عبارة واسعه النطاق تشير إلى بناء الاجهزه والنظم البيولوجية التي لا توجد بشكل طبيعي ، أو أعاده تصميم النظم البيولوجية القائمة لغرض محدد2. وتتميز البيولوجيا التركيبية بالهندسة الوراثية بمنهجيه قياسيه وبوجود أجزاء موحده (عناصر وراثيه لعلم الاحياء التركيبية القياسية) يمكن استخدامها لتوليف الاجهزه والنظم. يتم إدخال جزء في جينوم الجهاز ، كائن حي مثل البكتيريا ، للتعبير عن سمه معينه من شانها ان تكون بمثابه مؤشر علي وظيفة. علي سبيل المثال ، في العديد من الاجهزه الاصطناعية ، يتم إدخال التعبير عن البروتين الفلوري في كائن واحد الخلية كبروتين مراسل. يمكن دمج أجهزه متعددة في نظام. الجينوم من الكائنات المجهرية مثل البكتيريا من السهل التلاعب بها بهذه الطريقة. وقد ابلغ عن العديد من الامثله علي المواد البيولوجية المحددة لمجموعه واسعه من التحاليل الكيميائية في الأدبيات علي مدي العقد الماضي3,4.

وفي هذا العمل ، يقدم نظام MicRoboCop كمثال علي الاستشعار البيولوجي أو المصمم باستخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية مع تطبيقات جديده في الكيمياء الشرعية والبيئية. MicRoboCop هو نظام من ثلاثه أجهزه منفصلة ، عندما مجتمعه ، وسوف تسمح القولونية للتعبير عن البروتين الفلوري الأحمر (العطاء) في وجود بقايا طلقات ناريه (GSR) التي تم جمعها من ايدي الشخص أو سطح. كل من الاجهزه الثلاثة يستجيب للتحليل الكيميائي المحدد الذي يعرف بأنه مكون من GSR5. التحاليل الثلاثة التي يستجيب لها النظام هي I. 2 ، 4 ، 6-ترينيتروولويني (TNT) والمركبات ذات الصلة ، ثانيا. الرصاص (في شكل أيونات الرصاص) ، وثالثا. الإثمد (أيضا في شكل أيونات).

GSR يتكون من العديد من المواد الكيميائية المختلفة ، ولكن الثلاثة عاده ما تستخدم لتحديد بقايا كما GSR هي الباريوم ، الرصاص ، والإثمد5. اختبار الادله القياسية لتحديد GSR هو استخدام المجهر الكترون المسح الضوئي (SEM) مع التشتت الطاقة الاشعه السينية فلوري (EDX)5. تسمح SEM-EDX للمحللين بتحديد الشكل الفريد والمكونات العنصرية لل GSR. في الحاضر ، هناك عدد قليل من الاختبارات الافتراضية الثنائية المستخدمة علي نطاق واسع المتاحة. ويستخدم أحد الاختبارات الافتراضية التي نشرت مؤخرا التحليل الطيفي للتنقل الأيوني (IMS) ، وهو معدات متخصصة قد لا تكون متاحه في العديد من المختبرات6. وهناك أيضا عدد قليل من ألوان "بقعه" الاختبارات التي يمكن استخدامها ، علي الرغم من انها تستخدم عاده لتحديد المسافة أو لتحديد GSR علي ثقوب الرصاصة والجروح5. بالاضافه إلى ذلك ، كان هناك بعض الاهتمام المحدود في الأدب إلى الاختبارات الكهروكيميائية ل GSR التي توظف تحليل فولتاممتري ، والتي لديها ميزه احتمال كونها الميدانية المحمولة ، أو انوديك تجريد voltammetric ، وهو غاية طريقه حساسة للعناصر المعدنية7. وهناك القليل جدا من الاشاره في أدبيات الاستشعار البيولوجي المصممة خصيصا لغرض الكشف عن GSR ، علي الرغم من نشر بعض المواد البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي الأخرى8.

وترد في الشكل 1العناصر البيولوجية لكل جهاز في نظام microbocop ، وبناء البلازميد. السهم المنحني في الشكل 1b يمثل المنطقة المروج التي يتم تنشيطها في وجود التحليلية ، والبيضاوي هو موقع ربط ريبوسومال الذي يسمح ترجمه البروتين المراسل ، المربع الرمادي المسمي عروض العروض هو الجين الذي يعبر عن الأحمر البروتين الفلوري ، والمثمن الأحمر هو موقع إنهاء النسخ. سيتم استخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا كنظام للكشف عن GSR. سيتم احتضان كل جهاز مع مروج محدد (SbRFP ، PbRFP ، و TNT-عروض العروض) مع العينة التي يتم اختبارها سيتم قياس الفلورية لعروض العروض. ولن يتم التعبير عن تقديم العروض الا إذا كان التحلل الكيميائي المناسب موجودا وينشط منطقه المروج. وقد تم تصميم ثلاثه أجهزه تستجيب لبعض المواد الكيميائية الموجودة في GSR ويتم عرضها في هذا العمل.

المروجين المستخدمة في الاجهزه microbocop الثلاثة هي الزرنيخ والداعم إثمد الحساسة, sbrfp9,10, المروج الحساسة الرصاص, pbrfp11,12 والمروج الحساسة TNT, TNT- عروض العروض 13. لان البحث في الأدبيات كشفت عن اي مروج مصممه للرد علي الباريوم ، تم اختيار المروج TNT بدلا من ذلك لان هذا المروج حساس لعدد من المركبات ذات الصلة هيكليا (علي وجه الخصوص ، 2 ، 4-dinitrotoluene و dinitrobenzene) التي من المعروف انها جزء من المركبات العضوية تركت وراءها في GSR. وقد استخدم هذا المروج بنجاح للكشف علي وجه التحديد كميات دقيقه من TNT و 2, 4-dinitrotoluene (2, 4-DNT) في ألغام الارضيه المدفونة13. باستخدام الاجهزه الثلاثة معا كنظام ، سينتج اختبار إيجابي ل GSR مضان في جميع الاجهزه الثلاثة. اشاره مضان في جهاز واحد أو اثنين فقط سوف تشير إلى مصدر بيئي آخر للتحليل (ق) أو في حاله المروج TNT ، التنشيط من قبل مركب ليس مركب عضوي تركت وراءها في GSR. وباستخدام جميع الاجهزه الثلاثة معا ، يتم التقليل إلى ادني حد من امكانيه حدوث نتائج ايجابيه زائفه بسبب المصادر البيئية. ولا تزال الذخيرة الخالية من الرصاص ، التي تكتسب شعبيه ، لا تمثل سوي 5 في المائة من مبيعات الذخيرة في الولايات المتحدة ؛ التالي ، قد تكون النتائج السلبية كاذبه بسبب عدم وجود الرصاص احتمال ولكن لا يزال هناك فائده في جهاز استشعار يستخدم الرصاص كعلامة ل GSR14. الاضافه إلى هذا التطبيق المحدد للطب الشرعي ، يمكن استخدام كل جهاز بشكل منفصل لأغراض الكشف عن الملوثات البيئية.

وتشمل البروتوكولات المقدمة تقنيات البيولوجيا التركيبية المستخدمة لإنشاء الاجهزه (بكتيريا المستشعر) والتقنيات التحليلية للتحقق من وظيفة الاجهزه وتحليل الإشارات الفلورية التي تم الحصول عليها. ويشمل البروتوكول أيضا جمع أدله الطب الشرعي في شكل مسح اليد لجمع GSR من يد المشتبه به أو مسحه لجمع GSR من السطح. يتم عرض النتائج من جهاز استشعار الرصاص علي سبيل المثال النتائج ، إلى جانب إظهار اختبار إيجابي ل GSR باستخدام غلاف خرطوشه المستهلكة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظه: يتم تقديم التوليف من e. كولاي التعبير عن العروض.

1. اعداد الحمض النووي البلازميد من e. كولاي

  1. ذوبان e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع جين عروض العروض وجين المقاومة الامبيسلين وتنمو e. كولاي علي المرق لوريا (LB) أجار لوحات تحتوي علي 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين في 37 درجه مئوية ل 24 ساعة. علي سبيل المثال ، استخدم J10060 البلازميد من تسجيل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد). يتضمن J10060 البلازميد جين لعروض العروض (البروتين الفلوري الأحمر) تحت سيطرة منطقه المروج pbad وجين مقاومه الامبيسلين. بدلا من ذلك ، تحويل e. القولونية (الرجوع إلى الخطوة 3.2) مع البلازميد قبل النمو علي لوحات أجار LB.
  2. اتبع بروتوكول miniprep القياسية (انظر جدول المواد) لعزل الحمض النووي من 1 مل من الثقافة e. القولونية التي تحتوي علي plasmid J10060. الغرض من البروتوكول التالي هو أزاله المروج pBad واستبداله بالمروج المطلوب للجهاز.
  3. بعد مينيميد البلازما ، تخزين الحمض النووي في الفريزر حتى جاهزه للهضم.

2. تقييد انزيم الهضم

  1. اعداد رد الفعل التالي في أنبوب الطرد المركزي ل ecori و nhei الهضم: 10 μl من الحمض النووي J10060 البلازميد (معزولة في الخطوة 1) ، 8 μl من الماء ، و 1 μl كل من ecori و nhei الانزيمات قبل مختلطة مع 1 μl من العازلة (انظر جدول المواد).
  2. للحمض النووي المروج ، واعداد رد الفعل التالي في أنبوب الطرد المركزي ل EcoRI و NheI الهضم: 10 μL من متواليات الحمض النووي المروج صلب (8 μL من الماء ، و 1 μL كل من EcoRI و NheI الانزيمات قبل مختلطة مع 1 μL من العازلة.
    1. ل Sb-، الرصاص-، أو TNT-عرض العروض (انظر جدول المواد) ، حل القلة الكريات في العازلة (30 مم Hepes ، pH 7.5 ؛ 100 mm خلات البوتاسيوم) ، احتضان في تركيزات مولي متساوية ، والحرارة إلى 94 درجه مئوية لمده 2 دقيقه ، وتبرد تدريجيا في درجه حرارة الغرفة).
  3. اخلط العينات عن طريق التنضيد برفق لاعلي ولأسفل مع تعيين الماصة إلى 10 μL.
  4. احتضان لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  5. الحرارة إلغاء تنشيط الانزيمات في 80 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  6. يخزن الحمض النووي المهضوم في الفريزر حتى يصبح جاهزا للخطوة التالية.

3-الربط والتحويل

  1. الربط
    1. باستخدام البلازميد والمروج الحمض النووي التي تم هضمها مرتين مع ecori و nhei في الخطوة 2 ، اعداد خليط رد الفعل المبين في الجدول 1 في أنبوب الطرد المركزي علي الجليد. أضافه الحمض النووي T4 Ligase الماضي.
      ملاحظه: يبين الجدول 1 ربطا باستخدام نسبه موليه من 1:3 متجه إلى الادراج لاحجام الحمض النووي المشار اليها.
    2. خلط بلطف رد فعل عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا والميكروطارد لفتره وجيزة.
    3. احتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 10 دقيقه.
    4. الحرارة إلغاء تنشيط في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
  2. التحول
    1. ذوبان أنبوب مع 20 μL من DH5 المختصة e. القولونية الخلايا علي الجليد حتى تختفي بلورات الجليد الماضي.
    2. أضافه 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد إلى خليط الخلية. نفض الغبار بعناية أنبوب 4-5 مرات لخلط الخلايا والحمض النووي.
    3. وضع الخليط علي الجليد لمده 2 دقيقه.
    4. حرارة صدمه في تماما 42 [ك] ل تماما 30 [س.]. لا تخلط.
    5. مكان علي الجليد لمده 2 دقيقه. لا تخلط.
    6. ماصه 380 μL من درجه حرارة الغرفة SOC في الخليط. انتشر علي الفور علي لوحه أجار LB تحتوي علي الامبيسلين (100 ميكروغرام/مل) وحضنت بين عشيه وضحيها عند 37 درجه مئوية.
    7. تحقق من لوحات في غضون 24 ساعة للنمو.
    8. ختم لوحات مع ختم الفيلم وتخزينها في الثلاجة حتى تصبح جاهزه للخطوة التالية.

4. مستعمره PCR

  1. أضافه إلى أنبوب PCR (اعداد 4 أنابيب رد فعل) مخاليط التفاعل المبينة في الجدول 2.
  2. خلط بلطف ردود الفعل عن طريق التنضيد صعودا وهبوطا.
  3. باستخدام طرف ماصه اصفر ، كشط مستعمره (أو منطقه صغيره جدا) من القولونية المتحولة. نقل انتقاد من هذا كولاي علي لوحه LB/ampicillin/أجار الجديدة التي تم تقسيمها ، ومن ثم ادراج طرف ماصه في أنبوب PCR. يهز طرف الماصة لخلط كولاي مع مزيج PCR. كرر ثلاث مرات أخرى لمستعمرات اضافيه. نقل أنابيب PCR إلى اله PCR والبدء في ثيرموسيكلينج باستخدام البرنامج المبين في الجدول 3.
  4. تشغيل هلام الكهربائي باستخدام 2 ٪ هلام اجبرز في تاي لتحديد المستعمرات التي لديها أفضل ربط في البلازميد وتنمو تلك المستعمرات علي لوحه جديده.
  5. خزن الصفائح في الثلاجة حتى تصبح جاهزه للاختبار. اعداد الثقافة السائلة في مرق لوريا مع 100 ميكروغرام/مل الامبيسيلين المضافة للاختبار الكيميائي.

5. تسلسل الحمض النووي

  1. لكل عينه ، أضافه 5 μL من plasmid ، 4 μL من التمهيدي التسلسل ، و 3 μL من الماء منزوع الأيونات.
  2. وضع هذا الخليط في أنبوب وإرساله لتسلسل الحمض النووي (انظر جدول المواد).
  3. تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي للمقارنة بين متواليات الحمض النووي المتوقعة والملاحظة باستخدام برنامج تحليل تسلسل الحمض النووي لضمان عدم وجود طفرة وإدخال الجينات بشكل صحيح.
    ملاحظه: استخدام e. كولاي كجهاز استشعار الكيميائية ويرد أدناه.

6. اعداد الثقافات e. كولاي

  1. اعداد LB مع 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين للثقافات السائلة.
  2. اعداد الثقافات السائلة للبكتيريا الاستشعار ، والسيطرة الايجابيه * البكتيريا والسيطرة السلبية * * البكتيريا.
    ملاحظه: * البكتيريا السيطرة الايجابيه: e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع الجينات لعروض العروض تحت سيطرة المروج التاسيسيه ؛ تم استخدام البلازميد E1010 من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد) في هذا العمل.
    * * بكتيريا السيطرة السلبية: e. القولونية التي تحتوي علي البلازميد مع الجينات لعرض العروض تحت السيطرة من مروج مختلفه ، مثل المروج pbad (بلازميد J10060 من السجل من الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد)) أو البلازميد التي ليس لديها الجينات لعروض العروض.
  3. وضع الثقافات في حاضنه الاهتزاز في 37 درجه مئوية و 220 دوره في الدقيقة لمده لا تقل عن 8 ساعة ، كحد اقصي 18 ح. مرق غائم يشير إلى نمو البكتيريا.

7. معايره e. القولونية للتحقق من وظيفة الجهاز

ملاحظه: مره واحده وقد تم معايره أجهزه الاستشعار للتحقق من وظيفة ، وهذه الخطوة لا تحتاج إلى ان تتكرر. السيطرة الايجابيه في شكل أضافه الرصاص ، الإثمد ، و 2 ، 4-DNT أو 1 ، 3-dinitrobenzene (1 ، 3-DNT) يمكن التحقق من وظيفة الاجهزه لكل استخدام دون الحاجة إلى المعايرة الكاملة.

  1. اعداد حل الأسهم من التحاليل (ق) من الفائدة بتركيز 10 جزء في المليون في الماء. إذا كان الذوبان مشكله ، استخدم خليط الماء/الميثانول 50/50.
  2. باستخدام الجدول 4 كدليل ، تسميه العدد المناسب من أنابيب الثقافة العقيمة ووضع 2 مل من مرق مثقف (من الخطوة بروتوكول 6) في كل أنبوب.
    ملاحظه: من أجل تحديد نطاق التحليلية العامة ، القيام علي الأقل ثلاثه مستويات مختلفه من التحليل مع البكتيريا الاستشعار ، مستوي واحد مع السيطرة السلبية ، ومستوي واحد مع السيطرة الايجابيه. يجب ان يكون هناك أيضا أنبوب واحد من كل من البكتيريا التي ليس لديها المعادن المضافة (نوع آخر من السيطرة السلبية). لتحديد النطاق التحليلي وحدود الكشف بشكل أدق ، استخدم نطاقا أكبر من تركيزات التحليل.
  3. أضافه حل الأسهم التحليلية إلى الأنابيب التي تحتوي علي 2 مل من مرق كما لوحظ في الجدول 4، وضع قبعات المفاجئة علي أنبوب الثقافة بحيث تكون فضفاضة (للسماح تدفق الهواء في الأنبوب) ، ودوامه أنبوب الثقافة.
  4. ترك قبعات المفاجئة فضفاضة علي أنابيب الثقافة ، ووضع في حاضنه الاهتزاز في 220 لفه في الدقيقة و 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة علي الأقل.
  5. أزاله الأنابيب من الحاضنة ، والمفاجئة قبعات علي الأنابيب باحكام ، وتخزين الأنابيب في الثلاجة حتى تكون جاهزه للتحليل مضان.

8. استخدام كولاي كجهاز استشعار الكيميائية ل gsr

  1. باستخدام المسح القائم علي الايثانول المصمم لأزاله الرصاص (انظر جدول المواد) ، امسح جميع أسطح اليدين ، بما في ذلك بين الأصابع. استخدم مسحه منفصلة لكل يد. خزن المناديل في الحقيبة القابلة للإغلاق بشكل مناسب حتى التحليل.
  2. بالنسبة للأسطح التي سيتم اختبارها: استخدم مسحا قائما علي الكحول للأسطح الكبيرة أو مسحه قطنية مبلله بالايثانول للأسطح الصغيرة.
    ملاحظه: لإظهار استجابه أجهزه الاستشعار إلى GSR ، داخل التي تم انفاقها. تم مسح غلاف خرطوشه العيار 40 بمسحه من القطن المبلل من الايثانول.
  3. ارتداء قفازات نظيفه واستخدام المقص التي تم تنظيفها بالكحول ، وقطع ما يقرب من 1 سم2 القسم من وسط المسح.
  4. ضع قطعه قطع من مسح اليد أو مسحه القطن مباشره إلى أنبوب الثقافة الذي يحتوي علي 2 مل من البكتيريا الاستشعار ، وضمان ان يتم غمرها في مرق.
  5. المضي قدما كما هو موضح أعلاه في الخطوات 7.4 – 7.5.

9. تحليل مضان باستخدام مطياف المحمولة (انظر جدول المواد)

  1. استخدام خلاط دوامه لهز الأنابيب.
  2. اعداد مطياف لجمع الانبعاثات فلوري في الطول الموجي المناسب للخيار الخاص بك لعروض العروض مع الطول الموجي الاثاره من 500 نانومتر.
  3. استخدم مرق لوريا لتسجيل طيف فارغ.
  4. نقل بعناية كل ماده طافي إلى حجم منخفض كوفيت وجمع كثافة الانبعاثات.

10. تحليل مضان باستخدام 96 القارئ لوحه جيدا (انظر جدول المواد)

  1. استخدام خلاط دوامه لهز الأنابيب.
  2. نقل 200 mL من مرق إلى بئر في لوحه جيدا. سجل العينات التي ذهبت إلى كل بئر من لوحه.
  3. اعداد مقياس الفلور لجمع كثافة الانبعاثات عند الطول الموجي المناسب لمتغير عروض العروض.

11-تحليل البيانات

  1. باستخدام الاشاره التي تم الحصول عليها من جميع الضوابط السلبية (البكتيريا السلبية لعروض العروض أو البكتيريا الاستشعار مع عدم أضافه التحليلية) ، وحساب متوسط اشاره فلوري للخلفية.
  2. طرح متوسط اشاره الخلفية من كل اشاره الفلورية التي تم الحصول عليها للبكتيريا الاستشعار للحصول علي خلفيه تصحيح كثافة مضان.
  3. تقدير نسبه الاشاره إلى الضوضاء (S/N) عن طريق قسمه الخلفية علي كثافة الفلورية المصححة بواسطة اشاره الخلفية المتوسطة. إذا كانت نسبه S/N أكبر من 3 ، يكون الاختبار موجبا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 2الأطياف الفلورية للخيار الخاص بعروض العروض المستخدمة في هذا العمل. هذه البيانات هي من جهاز PbRFP كما انه يستجيب للرصاص والجهاز TNT-العطاء كما انه يستجيب لاثنين من التحاليل ، 2 ، 4-DNT و 1 ، 3-DNT. يظهر هذا الرقم طيف السيطرة السلبية (لم تتم أضافه التحاليل) ، والأطياف في مستويين مختلفين من التحاليل المضافة. لوحظ الحد الأقصى للاشاره الفلورية لمتغير عروض العروض المستخدمة في 575 نانومتر (الاثاره الطول الموجي 500 nm). وتمثل البيانات الواردة في الشكل 3

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

ويمكن تعديل التجربة الموصوفة في الجدول 4 بأي شكل من الاشكال بما يتناسب مع أجهزه الاستشعار التي تم تصميمها. الجانب الأكثر اهميه في المستشعر الكيميائي هو تقييم حساسيته وخصوصيته. ومن المفيد ضمان تحليل مجموعه واسعه من تركيزات التحليل لتحديد النطاق التحليلي المفيد لجهاز الاستشعار. ومن الجدير أيضا تحديد مستوي الحد الأقصى من التحاليل للخلايا. لان التحليلات المستخدمة في هذه الدراسة هي المعادن السامة (الرصاص و Sb) أو المركبات العضوية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يوجد لدي أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو تضاربات أخرى في المصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرغب المؤلفون في الاعتراف بالطلاب في جامعه لونغوود في 324 BIOL (علم الوراثة) والطلاب في تشيم 403 (المختبر الكيميائي المتقدم لحل المشكلات) الذين شاركوا في الاعداد الاولي واختبار الإثمد والرصاص الحيوي. وقد تم تصور فكره MicRoboCop في ورشه عمل GCAT SynBIO (الصيف 2014) ، والتي يتم تمويلها من قبل NSF ومعهد هوارد هيوز الطبي والتي تستضيفها جامعه ميريلاند مقاطعه بالتيمور. ويعترف المؤلفون أيضا بالتمويل الوارد من كليه كوك-كول للفنون والعلوم بجامعه لونغوود ومنحه خريجي GCAT SynBio.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،3-دينيتروبنزين ، 97٪ألدريتشD194255-25 جم
2،4-دينيتروتولوين ، 97٪ألدريتش101397-5G
أجارفيشر العلميBP1423-500
أمبيسلينفيشر ScientificBP1760-5
الأنتيمون ، الحل القياسي المرجعي (1000 جزء في المليون & plusmn ؛ 1٪ / معتمد)Fisher ScientificSA450-100Standard in مخفف HNO3
Cut Smart BufferNew England BioLabsB7204S
Duplex Bufferتقنيات الحمض النووي المتكاملة11-01-03-00
EcoRI-HF RestrictionNew England BioLabsR3101S
الإيثانول ، درجة HPLC ،Acros OrganicsAC611050040المشوهةلا تحتاج المذيبات إلى أن تكون درجة HPLC أو ACS أو درجة الكاشف ستعمل
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing KitsEurofins GenomicsSimpleSeq Kit التمهيدي القياسي
الأمامي لمستعمرة PCRالحمض النووي المتكاملة5'- GCCCCTTGAATTCGTCATATAT-3'
برايمر أمامي لتسلسل الحمض النوويتقنيات الحمض النووي5 '- GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
IBI Science عالية السرعة البلازميد المصغرIBI ScientificIB47101
مرق LB ، MillerFisher ScientificBP1426-500
Lead ، الحل القياسي المرجعي (1000 جزء في المليون & plusmn ؛ 1٪ / معتمد)Fisher ScientificSL21-100Standard في HNO3
LeadOff المخفف للتنظيف ومناديل ديكون المبللةHygenall45NRCNتباع في عبوات أو ملفوفة بشكل فردي ، أي مناديل تحتوي على الكحول ستعمل.
الميثانول ،Fisher ScientificA452-4HPLC إلى أن تكون درجة HPLC أو ACS أو درجة الكاشف ستعمل
NEB 5-alpha المختص E. القولوني< / em> خلايانيو إنجلاند BioLabsC2987I
NheI-HF إنزيم تقييدنيو إنجلاند BioLabsR3131S
مياه خالية من النوكليسنيو إنجلاند BioLabsB1500S
OneTaq< / em> 2X Master Mix مع العازلة القياسيةNew England BioLabsM0482S
البلازميدات من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبيةسجل الأجزاءالقياسية http://parts.igem.org/Main_Page
تسلسل المروجتقنيات الحمض النوويمروج Sb: 5'-GCATGAATTCA
GTCATATATGTTTTTGACTTATCC
GCTTCGAAGAGAGAGAGAACTACCT
GCAACAATCGCTAGCGCAT-3' < / > 3'-CGTACTTAAGCTCACTATA
TACAAAAACTGAATAGGCGAAGC
TTCTCTCTGTGATGGACGTTG
TTAGCGATCGCGTA-5' < / > مروج الرصاص: 5'-GCATGAATTCG
TCTTGACTCTATAGTAACTAAGGG

TGTATAATCGGCAACGGG
AGCTAGCGCAT-3 ' < / > 3'-CGTACTTAAGCAGAA
CTGAGATATCATTGATCTCCCA
TCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGGCGCGC
GTA-5' < / > مروج TNT: 5 ' GCATTCTAGAT
CAATTTATTTGAACAAGGCGGTCA
ATTCTCTTCGATTTTATCTCGT
AAAAAAACGTGATACTCATCACAT
CGACGAAACACGTCACTTATACA
AAAATCACCTGCGAGAGATTAATT
GAATTCGCAT3' < / > 3 ' CGTAAGATCTAGTTAA
ATAAACTTGTTCCGCCAGTTAAGA
GAAGCTAAAATAGAGAGCATTTTT
TTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGC
TTTGTTGCAGTGAATATGTTTTTA
GTGGACGCTCTCTAATTAACTTAA
GCGTA5'
التمهيدي العكسي لمستعمرة PCRتقنيات الحمض النوويالمتكاملة 5 '- GCCCCTTGAATTCGTCTAGACT- 3'
التمهيدي العكسي لتسلسل الحمض النوويتقنيات الحمض النووي5 '- GGAAACAGCTATGACCATG-3'
T4 DNA Ligaseنيو إنجلاند BioLabsM0202S
Enzyme تقنيات المتكاملة مجموعة لا تحتاج مذيبات من درجة البيولوجية المتكاملة المتكاملة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eschner, K. "The Story of the Real Canary in the Coal Mine.". The Smithsonian Magazine. , Smithsonian Institution. (2016).
  2. The Synthetic Biology Project. , Available from: http://www.synbioproject.org/ (2019).
  3. Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors & Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
  4. He, W., Yuan, S., Zhong, W. H., Siddikee, M. A., Dai, C. C. Application of genetically engineered microbial whole-cell biosensors for combined chemosensing. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (3), 1109-1119 (2016).
  5. Dalby, O., Butler, D., Birkett, J. W. Analysis of Gunshot Residue and Associated Materials-A Review. Journal of Forensic Sciences. 55 (4), 924-943 (2010).
  6. Bell, S., Seitzinger, L. From binary presumptive assays to probabilistic assessments: Differentiation of shooters from non-shooters using IMS, OGSR, neural networks, and likelihood ratios. Forensic Science International. 263, 176-185 (2016).
  7. O'Mahony, A. M., Wang, J. Electrochemical Detection of Gunshot Residue for Forensic Analysis: A Review. Electroanalysis. 25 (6), 1341-1358 (2013).
  8. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent Advances in Biosensor Technology for Potential Applications - An Overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 9(2016).
  9. Fernandez, M., Morel, B., Ramos, J. L., Krell, T. Paralogous Regulators ArsR1 and ArsR2 of Pseudomonas putida KT2440 as a Basis for Arsenic Biosensor Development. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 4133-4144 (2016).
  10. Porter, S. E. G., Barber, A. E., Colella, O. K., Roach, T. D. Using Biological Organisms as Chemical Sensors: The MicRoboCop Project. Journal of Chemical Education. 95 (8), 1392-1397 (2018).
  11. Borremans, B., Hobman, J. L., Provoost, A., Brown, N. L., Van der Lelie, D. Cloning and functional analysis of the pbr lead resistance determinant of Ralstonia metallidurans CH34. Journal of Bacteriology. 183 (19), 5651-5658 (2001).
  12. Hobman, J. L., Julian, D. J., Brown, N. L. Cysteine coordination of Pb(II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter, PpbrA, from Cupriavidus metallidurans CH34. Bmc Microbiology. 12, (2012).
  13. Yagur-Kroll, S., Amiel, E., Rosen, R., Belkin, S. Detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene by an Escherichia coli bioreporter: performance enhancement by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (17), 7177-7188 (2015).
  14. Gorman, M. "Guns in America: The Debate Over Lead Based Bullets.". Newsweek. , (2017).
  15. Yuksel, B., Ozler-Yigiter, A., Bora, T., Sen, N., Kayaalti, Z. GFAAS Determination of Antimony, Barium, and Lead Levels in Gunshot Residue Swabs: An Application in Forensic Chemistry. Atomic Spectroscopy. 37 (4), 164-169 (2016).
  16. Blakey, L. S., Sharples, G. P., Chana, K., Birkett, J. W. Fate and Behavior of Gunshot Residue-A Review. Journal of Forensic Sciences. 63 (1), 9-19 (2018).
  17. Yagur-Kroll, S., et al. Escherichia coli bioreporters for the detection of 2,4-dinitrotoluene and 2,4,6-trinitrotoluene. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (2), 885-895 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة