مقالة منهجية

إنشاء وتوصيف ثلاثة خطوط الخلايا المضادة للأدينوسرطان الرئة مقاومة للأفاتينب PC-9 مع جرعات متزايدة من Afatinib

DOI:

10.3791/59473

⸱

يونيو 26, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Advanced Cancer Translational Research Institute, Showa University, 2Division of Breast Surgical Oncology, Department of Surgery, Showa University School of Medicine, 3Division of Allergology and Respiratory Medicine, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة لإنشاء خطوط الخلايا المقاومة للأفاتينيب من خلايا سرطان الغدة الرئوية PC-9، وتميزت الخلايا المقاومة. يمكن استخدام الخلايا المقاومة للتحقيق في مستقبلات عامل النمو البشرة التيروزين كيناز آليات مقاومة مثبطات، تنطبق على المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقاومة المكتسبة لمثبطات الهدف الجزيئي هي مشكلة خطيرة في علاج السرطان. ولا يزال سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفاة المرتبطة بالسرطان في معظم البلدان. اكتشاف "طفرات السائق الأنسيجينية"، مثل مستقبلات عاملنمو البشرة (EGFR) - تنشيط الطفرات، والتطور اللاحق للعوامل المستهدفة الجزيئية من مثبطات كيناز التيروزين EGFR (TKIs) (gefitinib، erlotinib، afatinib, dacomitinib, وosimertinib) قد غيرت بشكل كبير علاج سرطان الرئة في العقود الأخيرة. ومع ذلك، لا تزال هذه الأدوية غير فعالة في المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC) تحمل EGFR-تفعيل الطفرات. بعد المقاومة المكتسبة، لا يزال التقدم المنهجي لNSCLC عقبة كبيرة في علاج المرضى الذين يعانون من الطفرة الإيجابية EGFR NSCLC. هنا، نقدم طريقة تصعيد الجرعة التدريجية لإنشاء ثلاثة خطوط خلايا مستقلة مقاومة للأفاتينيب المكتسبة من خلايا NSCLC PC-9 التي تأوي طفرات EGFR-تفعيل من 15 قاعدة حذف الزوج في EGFR exon 19. يتم عرض طرق لتوصيف خطوط الخلايا الثلاثة المستقلة المقاومة للعفاتينيب لفترة وجيزة. إن آليات المقاومة المكتسبة للمعارف التقليدية في إطار الـ EGFR غير متجانسة. ولذلك، يجب فحص خطوط الخلايا المتعددة التي لها مقاومة مكتسبة للمعارف التقليدية في مصر. هناك حاجة إلى عشرة إلى اثني عشر شهرا للحصول على خطوط الخلايا مع المقاومة المكتسبة باستخدام هذا النهج تصعيد الجرعة stepwise. وسيسهم اكتشاف آليات جديدة للمقاومة المكتسبة في وضع استراتيجيات علاجية أكثر فعالية وأمانا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خمسة مثبطات كيناز التيروزين, استهداف مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR), بما في ذلك gefitinib, erlotinib, afatinib, dacomitinib, وosimertinib متاحة حاليا لعلاج المرضى الذين يعانون من الطفرة EGFR إيجابية الرئة غير الصغيرة الخلية السرطان (NSCLC). على مدى العقد الماضي، شهدت العلاجات لهؤلاء المرضى تطورا كبيرا مع اكتشاف إمكانات جديدة EGFR-TKIs. بين المرضى الذين يعانون من سرطان الغدة الدرقية في الرئة، يتم تحديد الطفرات الجسدية في EGFR في ما يقرب من 50٪ من الآسيويين و 15٪ من المرضى القوقازيين1. الطفرات الأكثر شيوعا في EGFR هي طفرة نقطة L858R في EGFR exon 21 و 15 زوج قاعدة (BP) الحذف في EGFR exon 192. في المرضى الإيجابية ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنشاء ثلاثة خطوط خلية مستقلة مقاومة للأفاتينيب PC-9

  1. تحديد التركيز الأولي للتعرض للأفاتينيب لخلايا PC-9 باستخدام الفحص 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
    1. ثقافة خلايا PC-9 في وسط النمو تحتوي على مصل البقر الجنيني (10٪)، البنسلين (100 U/mL)، والعقدية (100 ميكروغرام / مل) في خلية الثقافة علاج طبق 10 سم في حاضنة CO2 5٪ في 37 درجة مئوية.
    2. إعادة تعليق خلايا PC-9 في 4 × 104 خلايا / مل في متوسط النمو ومن ثم البذور في 50 درجة مئوية / جيدا في ميكروبليت 96 جيدا. التركيز النهائي للخلايا هو 2.0 × 103 خلايا / 50 ميكرولتر / جيدا. حضانة بين عشية وضحاها في حاضنة CO2 5٪ في 37 ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر في الشكل 1مخطط إنشاء ثلاثة خطوط خلايا مقاومة للأفاتينيب من خلايا PC-9 باستخدام إجراء تصعيد الجرعة التدريجية . ويبين الشكل 2 انخفاضاً في انتشار الخلايا في خلايا PC-9 الأبوية مع زيادة تركيز الأفاتينيب، مما يشير إلى أن خلايا PC-9 حساسة للتعرض للأفاتينيب. ويبين الشكل 3 مقاومة أفاتينيب لخطوط الخلايا الثلاثة. ولم يظهر أي من خطوط الخلايا الثلاثة المقاومة للأفاتينيب، وهي AFR1 وAFR2 وAFR3، قمعاً لانتشار .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، وصفنا طريقة لإنشاء ثلاثة خطوط الخلايا المستقلة مقاومة للأفاتينيب وتميزت هذه الخلايا بالمقارنة مع الخلايا الأبوية PC-9. من خلال التعرض لتصعيد الجرعة التدريجية، اكتسبت خلايا PC-9 الأبوية مقاومة لafatinib على مدى فترة 10-12 شهرا. سريريا، آليات المقاومة لEGFR TKIs غير متجانسة، وبالتالي، بعد العلاج الأولي مع afatinib، تم تقسيم خلايا PC-9 إلى ثلاثة أطباق P100 مستقلة وتعرض كذلك إلى afatinib. في البداية، لم يكن نمو الخلايا بطيئاً بشكل ملحوظ، ولكن مع اقتراب تركيز الدواء من قيمة IC50، تباطأ انتشار الخلايا. هذه خطوة.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر عضو معهد أبحاث الترجمة المتقدمة للسرطان على تعليقاته المدروسة وتحريره على مساعدتهم في تحرير اللغة الإنجليزية. وقد دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI (رقم المنحة: 16K09590 إلى T.Y.).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
afatinibSelleckS1011
إشارات الخلاياأحادية النسيلة أحادية النسيلة المضادةل EGFR 4267S
فحص حمض bicinchonincسيجماB9643
زراعة الخلايا المعالجة طبق 10 سمفيولامو2-8590-03
خلية BANKER1 TakaRaCB011وسائط الحفظ بالتبريد
CellTiter 96Promega  ؛ G4100  فحص تكاثر الخلايا غير المشعة. محلول الصبغة وحل الذوبان / الإيقاف
DMSOWako043-07216
حل ECLPerkin ElmerNEL105001EA
FBSgibco26140-079
GeneAmp 5700نظامالكشف عن RT-PCR القائم على الفلورة الحيوية التطبيقية  
GraphPad Prism v.7  شركة GraphPad، Inc.برنامج إحصائي
NanoDrop Lite مقياس الطيفالحراري
إشارات خلاياالحليب الجاف الخالية من الدسم9999S
القلم Strepgibco15140-163
كوكتيل مثبط الفوسفاتيز 2الفوسفاتيز سيجماP5726
3سيجماP0044
قارئ الألواح الدقيقة Powerscan HTBioTek
  باور SYBR الأخضر ماستر ميكس الأنظمة الحيويةSYBR Green Master Mix
مثبط البروتياز كوكتيلسيجماP8340
QIAamp DNA Mini KitQiagen51306طقم تنقية الحمض
QIAquick PCR طقم تنقيةPCR طقم تنقيةQIAGEN
RPMI-1640   ؛واكو189-02025مع L-Glutamine و Phenol
Red TBST مسحوقسيجماT9039
Trans-Blot SD خلية نقل كهربائية شبه جافةBio-Radجافة t4ransfer جهاز
96 بئر ميكروبليتحراري130188
تقنية برنامج الضوئي تقنية كوكتيل مثبط التطبيقية النووي QIAGEN PCR شبه

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chan, B. A., Hughes, B. G. Targeted therapy for non-small cell lung cancer: current standards and the promise of the future. Translational Lung Cancer Research. 4 (1), 36-54 (2015).
  2. Mitsudomi, T., Yatabe, Y.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PC 9 EGFR MTT EGFR

مقالات ذات صلة