يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

9.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59497

⸱

مايو 13, 2019

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

هنا، ونحن نصف الجمعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (بول الثاني) المجمعات استطالة تتطلب فقط الحمض النووي الاصطناعية قصيرة وoligonucleotides الحمض النووي الريبي وتنقية بول الثاني. وهذه المجمعات مفيدة لدراسة الآليات التي تقوم عليها المعالجة المشتركة للنسخ من النصوص المرتبطة بمجمع استطالة بولس الثاني.

الملخص

Eukaryotic mRNA التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة تتطلب نسخ من قالب الحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي السلائف من قبل متعددة subunit إنزيم RNA بولميراز الثاني وco-transcriptional السد والربط من الحمض النووي الريبي السلائف لتشكيل mRNA ناضجة. أثناء توليف mRNA، فإن مجمع استطالة الميرنا ً الثاني هو هدف للتنظيم من خلال مجموعة كبيرة من عوامل النسخ التي تتحكم في نشاطه الحفاز، فضلاً عن الأنزيمات المتوجة، والربط، و3'-المعالجة التي تخلق الميرنا الناضجة. وبسبب التعقيد المتأصل في توليف الحمض النووي الريبي، فإن النظم التجريبية الأبسط التي تمكن من العزلة والتحقيق في مختلف مراحلها النسخية المشتركة لها فائدة كبيرة.

في هذه المقالة، ونحن نصف واحد من هذا النظام التجريبي بسيطة مناسبة للتحقيق في تغطية RNA النسخ المشترك. يعتمد هذا النظام على مركبات استطالة RNA Polymerase II المحددة التي تم تجميعها من البلمرة النقية وفقاعات النسخ الاصطناعية. عندما شلت عن طريق الحمض النووي biotinylated، هذه المجمعات الانياطي الحمض النووي الريبي الثاني توفر أداة يمكن المناوية بسهولة لتشريح الحمض النووي الريبي النسخي المشترك السد والآليات التي المجندين مجمع استطالة وينظم الانزيم السد خلال [ك-كّوأيشنل] [رنا] يغطّي. ونحن نتوقع أن يتم تكييف هذا النظام لدراسة التوظيف و / أو تجميع البروتينات أو مجمعات البروتين مع أدوار في مراحل أخرى من نضج mRNA إلى جانب مجمع استطالة الحمض النووي الريبي الثاني.

المقدمة

Eukaryotic رسول RNA (mRNA) التوليف هو عملية كيميائية حيوية معقدة التي تنطوي على توليف الحمض النووي الريبي السلائف غير المجهزة من قبل الحمض النووي الريبي البليمرالثاني وتجهيز الحمض النووي الريبي السلائف لإنتاج mRNA ناضجة. يتم تنفيذ خطوات معالجة RNA من السد، الربط، وpolyadenyly إلى حد كبير co-transcriptionally. يعمل مجمع استطالة Pol II كسقالة تقوم بتجنيد وتنسيق أنشطة العديد من إنزيمات معالجة الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن فهمنا النهائي لكيفية توليد mRNAs eukaryotic ناضجة سوف تعتمد بشكل كبير على تطوير النظم التجريبية للسماح تشريح الآليات البيوكيميائية الكامنة وراء التوظيف في مجمع استطالة و تنظيم الإنزيمات المسؤولة عن الجمع بين النسخ، الربط، وpolyadenylation.

وليس من المستغرب أن يكون تطوير هذه النظم التجريبية صعبا. وكان أحد العوائق الرئيسية هو التعقيد الملحوظ للنسخ السياسي الثاني نفسه حيث يتطلب ببساطة إعادة تشكيل النسخ القاعدي من قبل بولس الثاني في المختبر مجموعة دنيا من خمسة عوامل بدء النسخ العامة: TFIIB، TFIID، TFIIE، TFIIF، وTFIIH 1- وعلاوة على ذلك، فإن إعادة تشكيل أي نوع من النسخ الخاضع للتنظيم في المختبر يتطلب مجموعة أكبر من عوامل النسخ والجهات التنظيمية المشتركة. وهكذا، كان أحد الأهداف الرئيسية هو تطوير نظم تجريبية أبسط تسمح بإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة المناسبة للتحقيقات في الاقتران الوظيفي للنسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي.

وقد ثبت أن إحدى هذه الطرق الأبسط لإعادة تشكيل مجمعات استطالة Pol II النشطة مفيدة للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية للفترة التي تمد فيها Pol II، وفي الآونة الأخيرة، للتحقيق في معالجة الحمض النووي الريبي النسخي المشترك2و3 ،4،5. في هذه المقالة، نبين كيف يمكن استخدام مجمعات استطالة Pol II المعدة من الفقاعات المنقّدة من Pol II والنسخ الاصطناعية بشكل فعال للتحقيق في الآليات الكامنة وراء وضع حد أقصى للنسخ المشترك لنصوص بولس الثانية الوليدة.

يشير الحد الأقصى إلى إضافة "غطاء" 5'-guanosine إلى نهاية 5'-ثلاثي الفوسفات من النصوص الوليدة Pol II. الحد الأقصى مهم للخطوات اللاحقة من النضج mRNA، والنقل، والترجمة، وغيرها من العمليات6،7. يتم إضافة الغطاء بشكل مشترك إلى نسخ بول الثاني بواسطة إنزيم يشار إليه باسم إنزيم السد. في خلايا الثدييات ، يتم احتواء المواقع النشطة المسؤولة عن أنشطة RNA 5'-triphosphatase وguanylyl transferase من إنزيم السد داخل ببتيد واحد8. يتم تجنيد إنزيم السد إلى مجمع استطالة بول الثاني من خلال التفاعلات مع الأسطح التي لم يتم تعريفها بعد على الجسم بول الثاني والمجال Rpb1 كاربوكسي المحطة الطرفية (CTD) فوسفوريلاتيد على Ser5 من البعيبتيدات5. في مجمع استطالة، يحفز إنزيم السد إضافة غطاء 5'-guanosine بمجرد أن يصل النص الوليد إلى طول لا يقل عن 18 نيوكليوتيدات وخرج من قناة خروج الحمض النووي الريبي البوليمر. في الخطوة الأولى من رد الفعل السد، وtriphosphatase تحلل الحمض النووي الريبي 5'-ثلاثي الفوسفات لإنتاج 5'-ثنائي الفوسفات. في الخطوة الثانية، يتم تحلل GTP إلى GMP بواسطة transferase guanylyl، وتشكيل إنزيم GMP-السد المتوسطة. وأخيراً، ينقل guanylyl transferase GMP إلى نهاية 5'-ثنائي الفوسفات من النص الوليد لإنتاج الغطاء.

وهناك سمة ملحوظة من رد الفعل متوجا هو أن تغطية النسخ المشترك (أي، وضع حد أقصى للنصوص المرتبطة بمجمعات استطالة Pol II الوظيفية) هو أكثر كفاءة بكثير من الحد الأقصى من RNAالحرة 5،9. وهكذا، كان السؤال الرئيسي في هذا المجال كيف يتم تحقيق هذا التنشيط الدرامي للتغطية من خلال تفاعلات إنزيم السد مع مجمع استطالة Pol II. في هذا البروتوكول نصف التجمع من المجمعات الاتطالية RNA الثاني النشط باستخدام فقط تنقية RNA بولميراز الثاني وفقاعات النسخ الاصطناعي. تسمح هذه الطرق بإنشاء مجمعات استطالة RNA polymerase II مع نصوص ذات طول وتسلسل محددين. في دراسة حديثة، استخدمنا هذه المجمعات الميرليمرة الثانية تعريف الحمض النووي الريبي كنموذج للتحقيق في جوانب آليات RNA متوجا5. وعلى وجه الخصوص، أظهرنا أن '1' الحد الأقصى لRNA المرتبط بهذه المجمعات الاستطالة كان أكثر من 100 أضعاف أكثر كفاءة من الحد الأقصى للRNA الحرة و '2' تم تحفيزه من قبل الفسفور المعتمد على TFIIH من CTD Pol II. ويمكن من حيث المبدأ تكييف النهج الموصوف هنا لتوليد ركائز لدراسة ردود الفعل الأخرى لمعالجة الحمض النووي الريبي المشترك المرتبطة بمجمع استطالة Pol II.

في القسم 1 من هذا البروتوكول، يتم إنشاء مجمعات استطالة اصطناعية عن طريق صلب قالب اصطناعي حبلا الحمض النووي oligonucleotide إلى oligonucleotide RNA التي هي مكملة في 3'-نهاية إلى ما يقرب من 9 النيوكليوتيدات من الحمض النووي حبلا قالب. ثم يتم تحميل Pol II على الحمض النووي: RNA دوبلكس. ثم يتم الانتهاء من مجمع استطالة بإضافة تكميلية جزئيا، غير قالب حبلا الحمض النووي oligonucleotide التي وصفت مع البيوتين في 3'-نهاية (الشكل1 والشكل 2A). يتم توسيع oligonucleotide RNA من قبل بول الثاني في هذه المجمعات استطالة لجعل النصوص ذات العلامات الراديوية من طول محدد وتسلسل على إضافة تركيبات مناسبة من النيوكليوتيدات ذات العلامات الراديوية. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام مزيج من الإذاج لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة وإضافة أخرى من تركيبات مختلفة من النيوكليوتيدات، يمكن للمرء أن "يمشي" Pol II إلى مواقف مختلفة على طول قالب الحمض النووي وتوليف الحمض النووي الريبي من أطوال محددة. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي وإخضاعه للكتروفوريس في المواد الهلامية اليوريا PAGE denaturing. في القسم 2 من البروتوكول، يتم استخدام مجمعات استطالة اصطناعية لتحليل تغطية الحمض النووي الريبي النسخي المشترك. وقدم المثال تدابير تأثير الفسفورية المعتمدة على TFIIH من CTD Pol II على الرنا النسخي المشترك السد. في هذه التجربة، نقوم بقياس مدى الكبة النسخية المشتركة كدالة لتركيز إنزيم السد (5 و15 و45 نانوغرام لكل رد فعل) والوقت (1 و2 و4 دقيقة).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الجمعية من مجمعات استطالة الاصطناعية وبولس الثاني المشي

  1. تعطيل 1 نمول من القلة الحمض النووي غير قالب تحتوي على جزيء البيوتين 3 'على الخرز المغناطيسي.
    ملاحظة:     يمكن إجراء الخطوات التالية مسبقاً للتحضير للتجارب المستقبلية. وترد في الجدول 1جميع تسلسلات القلة المستخدمة في هذا البروتوكول. يتم تصنيع oligos RNA مع تعديلات 5'-ثلاثي الفوسفات.
    1. إضافة 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (10 ملغ / مل) إلى أنبوب منخفض البروتين 1.5 مل، ثم وضع على رف مغناطيسي لمدة 2 دقيقة.
    2. في حين أن الأنبوب على الرف المغناطيسي، وإزالة السائل من الأنبوب دون إزعاج الخرز. لغسل الخرز، وإزالة الأنبوب من الرف، إضافة 1 مل من 5 mM تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، والعودة الأنبوب إلى الرف، وإزالة محلول الغسيل بعد 2 دقيقة.
    3. كرر الإذابة مرتين إضافيتين باستخدام 200 ميكرولتر لنفس المخزن المؤقت.
    4. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 400 درجة مئوية من 10 MM تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 1 MM EDTA، 2 M NaCl، العازلة. ثم مزيج مع 380 درجة مئوية من H2O و 20 درجة مئوية من 10 μM غير قالب biotinylated الحمض النووي oligo. وضع الأنبوب على nutator وحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. غسل غير قالب الحمض النووي oligo 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 5 MM تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 7.5، 0.5 mM EDTA، 1 M NaCl، ثم 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 20 مل HEPES-NaOH PH 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل كيلوكلة، 1 mM EDTA، 0.5 ملغ / مل ألبوم مصل البقر.
    6. ترك أنبوب بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية لإنهاء حجب الخرز مع BSA.
    7. في اليوم التالي، وضع الأنبوب في الرف المغناطيسي، وإزالة وتجاهل السائل، وإعادة تعليق الخرز في 200 ميكرولتر من 20 م همه-هيدروكسيد الصوديوم pH 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.5 ملغ / مل الزلال المصل البقري ونقل إلى أنبوب جديد. بالنسبة لقالب الحمض النووي هذا، التركيز النهائي هو حوالي 5 ميكرومتر.
      ملاحظة: وقت الحضانة وتركيز القلة تحتاج إلى تحديد تجريبي لكل oligo الحمض النووي biotinylated. يجب أن يوفر هذا القالب ما يكفي لـ 200 رد فعل، ويستمر لمدة 6 أشهر على الأقل عند تخزينها عند 4 درجة مئوية.
  2. الحمض النووي الريبي الصلب والحمض النووي قالب حبلا oligonucleotide oligos في نسبة الأضراس 2:1 (20 و 10 pmol، على التوالي) للحصول على الحمض النووي: RNA دوبلكس.
    1. إعداد مزيج صلب 10 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 2.
      ملاحظة: 10 ميكرولتر من مزيج الصلب كافية ل10 ردود الفعل. ويمكن توسيع نطاق مزيج الصلب حسب الحاجة إذا كان من المقرر إجراء المزيد من الاختبارات.
    2. أداء ردود الفعل الصلب في دورة الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 5 دقيقة في 45 درجة مئوية، تليها 12 دورات من 2 دقيقة لكل منهما، بدءا من 43 درجة مئوية وخفض درجة الحرارة 2 درجة مئوية لكل دورة. الخمول عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه نقطة زمنية مرنة. يتم الانتهاء من الصلب في غضون ~ 30 دقيقة ولكن يمكن أن تترك في 4 درجة مئوية لفترة أطول. في المختبر، وقد تركت مخاليط الصلب الجلوس لمدة تصل إلى 4 ساعة دون ملاحظة أي انخفاض في كفاءة رد الفعل.
    3. أثناء صلب الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي حبلا قالب، وإعداد المخازن المؤقتة للخطوات اللاحقة من البروتوكول. يتم سرد المكونات المطلوبة لإعداد كل مخزن مؤقت لرد فعل واحد مع كل مخزن مؤقت في الجداول من 2 إلى 8. قم بتوسيع نطاق الوصفات بعامل [Y(X+1) + 1] لـ Wash و (X+1) لكافة المخازن المؤقتة الأخرى. X = عدد ردود الفعل التي يتعين إعدادها؛ Y = عدد خطوات الغسيل المطلوبة (الحد الأدنى 3).
      ملاحظة: تحضير كافة المخازن المؤقتة طازجة في يوم التجربة. لا تضع أنابيب على الجليد بعد إضافة PVA إلى المخازن المؤقتة. إضافة Pol II أو النيوكليوتيدات إلى المخازن المؤقتة مباشرة قبل استخدام.
  3. تحميل تنقية RNA بولميراز الثاني على الحمض النووي: RNA الهجين.
    1. مزيج 1 pmol (1 μL) من الحمض النووي: RNA دوبلكس مع 13 ميكرولتر من المنطقة العازلة Pol II (من الجدول3).
    2. إضافة ~ 0.02 وحدة من الحمض النووي الريبي النقي بول الثاني (1 درجة مئوية) إلى الخليط من الخطوة 1.3.1 ومزيج عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا والتحريك مع طرف pipet، دون إدخال فقاعات. حضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: حجوم يعطى من هنا فوق لواحدة ردّ فعل; توسيع نطاق حسب الحاجة لعدد ردود الفعل في التجربة. الحمض النووي الريبي Pol II تنقية من كبد الفئران كما هو موضح10 يستخدم في هذا المثال; ومع ذلك، RNA Pol II تنقية من مصادر أخرى، بمافي ذلك الخلايا الثدييات المستزرعة أو الخميرة يمكن أيضا أن تستخدم 3،4،5،11،12،13.
  4. إكمال مجمع استطالة عن طريق إضافة الحمض النووي غير قالب biotinylated.
    1. إضافة 5 pmol (1 μL) من القلة الحمض النووي غير القالب المعطلة إلى 14 μL من المخزن المؤقت للحمض النووي غير القالب (من الجدول4)، إضافة إلى أنبوب من الخطوة 1.3.2، وحضانة لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    2. ضع العينة في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين.
  5. توليد مجمعات استطالة تحتوي على RNA 23mers المسمى لاسلكيا.
    1. قم بإجراء جميع الاحتضانات الأخرى عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. إضافة 1 ميكرولتر من 15 ميكرومتر ATP و 10 μCi (1 μL) من [α-32P] UTP (3000 Ci/mmol) إلى 23 ميكرولتر من النبض العازلة واستخدام هذا لإعادة تعليق الخرز المغناطيسي المغسول.
      تحذير: المواد المشعة خطرة. تأكد من ارتداء معدات الحماية المناسبة واتباع جميع المبادئ التوجيهية للمختبر للاستخدام الآمن للمواد المشعة والتخلص منها.
      ملاحظة: استبدال UTP المسمى لاسلكيا مع 15 μM UTP عندما لا تكون هناك حاجة إلى RNA ذات العلامات الراديوية، مثل تجارب اللطخة الغربية.
    2. احتضان رد الفعل لمدة 10 دقيقة للسماح بتوليف 23mers المسمى لاسلكيا.
    3. إضافة 1.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على 100 ميكرومتر ATP و 100 م UTP مزيج إلى 3.5 ميكرولتر من العازلة مطاردة، إضافة إلى أنبوب يحتوي على مجمعات استطالة تجميعها مسبقا، وحضانة لمدة 5 دقائق لمطاردة جميع النصوص الوليدة في 23mers.
    4. ضع العينة في رف مغناطيسي لمدة دقيقتين، وإزالة supernatant، وغسل مرة واحدة مع 30 ميكرولتر من العازلة غسل لإزالة النيوكليوتيدات غير المدمجة، وإعادة تعليق في 30 درجة مئوية من العازلة غسل.
    5. إما إضافة 94 ميكرولتر من مزيج التوقف معبروتيناز K والجليكوجين (الجدول 9) لإنهاء ردود الفعل أو المضي قدما إلى القسم 1.6 لتوليد مجمعات استطالة مع نصوص أطول أو القسم 2 لأداء الاختبارات متوجا.
  6. (اختياري) المشي بول الثاني لجعل 23، 25، و 29 النصوص النيوكليوتيد
    1. اتبع الإجراء الموضح في الخطوات 1-2-1 إلى 1-5-4 لإعداد مجمعات استطالة تحتوي على 23 مركبة تحمل علامة راديوية. توسيع نطاق 4 أضعاف لتوليد 120 درجة مئوية من المجمعات استطالة غسلها، وهو ما يكفي من المجمعات ل4 ردود الفعل.
    2. تسمية 3 أنابيب جديدة "23mer"، "25mer" و "29mer". نقل 30 درجة مئوية من المجمعات استطالة غسلها إلى أنبوب "23mer" وإضافة 94 درجة مئوية من مزيج التوقف مع proteinase K والجليكوجين.
    3. وضع الأنبوب الذي يحتوي على 90 ميكرولتر المتبقية من المجمعات استطالة غسلها في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 90 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 1.2 ميكرولتر كل من ATP 1.5 mM و 1.5 mM CTP. حضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية.
    4. بعد غسل مرة واحدة مع 90 درجة مئوية من العازلة غسل وإعادة تعليق في 90 درجة مئوية من العازلة غسل كما هو موضح في الخطوة 1.5.4، نقل 30 ميكرولتر من المجمعات استطالة إلى أنبوب "25mer" وإضافة 94 ميكرولتر من وقف مزيج مع بروتيناز K والجليكوجين.
    5. وضع الأنبوب الذي يحتوي على 60 ميكرولتر المتبقية من المجمعات استطالة في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 60 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 0.8 ميكرولتر كل من ATP 1.5 mM و 1.5 mM CTP.
    6. الحضانة لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية، وغسل مرة واحدة مع 60 درجة مئوية من العازلة غسل كما هو الحال في القسم 1.5.5، وإعادة تعليق في 60 درجة مئوية من العازلة غسل.
    7. نقل 30 ميكرولتر من عينة 2X إلى أنبوب "29mer" وإما إضافة 94 ميكرولتر من مزيج التوقف مع proteinase K والجليكوجين أو المضي قدما إلى القسم 2 لإجراء الاختبارات السد.
    8. انتقل إلى تنقية وتحليل الحمض النووي الريبي (القسم 3).

2. استخدام مجمعات استطالة الاصطناعية لAssay Cotranscriptional السد

  1. توليد مجمعات استطالة مغسولة تحتوي على 23 مركبة عن طريق رفع مستوى الإجراء الموضح في الخطوات 1.2.1 إلى 1.5.5 13 أضعاف. هذا يكفي ل12 ردود الفعل + 1 اضافية.
  2. بول II CTD الفسفور
    1. وضع أنبوب يحتوي على مجمعات استطالة غسلها في الرف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة، وإزالة supernatant، وإعادة تعليق الخرز في 377 ميكرولتر من BTB تستكمل مع 13 ميكرولتر من ATP 1.5 mM.
    2. إعداد اثنين من أنابيب جديدة، المسمى +H و -H، على التوالي. إلى أنبوب المسمى + H إضافة 3 ميكرولتر من ~ 300 نانوغرام / ميكرولتر TFIIH، وإلى أنبوب المسمى -H إضافة 9 ميكرولتر من 20 م همه-هيدروكسيد الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 mM EDTA، 0.5 ملغ / مل المصل البقري الألبومين.
      ملاحظة: نحن عادة ما نستخدم TFIIH تنقية من كبد الفئران، ولكن حصلنا على نتائج مماثلة باستخدام ~ 0.6 ميكروغرام / رد فعل من Cdk7 / Cyclin H / MAT1 المتاحة تجاريا (CAK، وهو وحدة كيناز من TFIIH). انظر جدول المواد للحصول على معلومات.
    3. إضافة 87 درجة مئوية من مجمعات استطالة غسلها من الخطوة 2.2.1 إلى أنبوب المسمى +H و 270 درجة مئوية من مجمعات استطالة غسلها إلى الأنبوب المسمى -H. الحضانة 10 دقيقة في 30 درجة مئوية.
    4. وضع عينة في رف المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. لإزالة النيوكليوتيدات الزائدة والبروتين غير المنضم، اغسل مجمعات استطالة في +H و -H مع تفاعلات 90 أو 270 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت، على التوالي.
  3. RNA السد
    1. إعادة تعليق مجمعات استطالة في أنبوب المسمى +H في 87 ميكرولتر من مزيج السد (BTB تستكمل مع 50 μM GTP (الجدول10). إعادة تعليق المجمعات استطالة في أنبوب المسمى -H في 261 درجة مئوية من مزيج السد.
    2. إعداد 4 أنابيب جديدة المسمى 5 نانوغرام CE + H، 5 نانوغرام م، 15 نانوغرام م، 45 نانوغرام م. تمييع الانزيم السد (CE) إلى 20 m HEPES-NaOH درجة الحموضة 7.9، 20٪ الجلسرين، 100 مل ككل، 1 MM EDTA، 0.5 ملغ / مل الزلال المصل البقري لإعداد الحلول التي تحتوي على 5 نانوغرام CE / ميكرول، 15 نانوغرام CE / ميكرولتر، أو 45 نانوغرام CE / μL والاستغناء عن 3 ميكرولتر من الحل المناسب في كل من الأنابيب 4.
    3. إعداد 12 أنابيب جديدة مع 94 درجة مئوية من العازلة وقف (2.1.1) تضاف إلى كل.
    4. بدء كل رد فعل متوجا عن طريق إضافة 87 درجة مئوية من مجمع استطالة تعامل مع TFIIH أو لا إلى أنابيب المسمى التي تحتوي على إنزيم السد. حضانة في 30 درجة مئوية في كتلة الحرارة.
    5. بعد 1، 2، أو 4 دقائق، وقف ردود الفعل عن طريق نقل 30 درجة مئوية من كل خليط التفاعل إلى أنابيب تحتوي على 94 ميكرولتر من وقف العازلة. تنقية وتحليل منتجات رد الفعل كما هو موضح في القسم 3.

3. رنا رنا وتطهيرها

  1. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. احتضان منتجات رد الفعل في وقف العازلة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: التوقف عن الإيقاف. تم الاحتفاظ بالعينات في هذا المخزن المؤقت لمدة تصل إلى 4 ساعة دون فقدان أو تدهور الحمض النووي الريبي.
    2. استخراج مرة واحدة مع 124 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول isoamyl (25:24: 1) ومرة واحدة مع الكلوروفورم: كحول isoamyl (24: 1).
      تحذير: الفينول سام للغاية ويتم امتصاصه بسرعة من قبل الجلد. ارتداء معدات الحماية المناسبة.
      ملاحظة: لتحقيق أقصى قدر من استعادة الحمض النووي الريبي أثناء الاستخراج، استخدم الأنابيب المتاحة تجارياً التي تحتوي على هلام عالي الكثافة، والذي يشكل حاجزاً مستقراً بين المراحل المائية والعضوية. انظر المناقشة وجدول المواد.
    3. نقل المرحلة المائية (الطبقة العليا) إلى أنابيب جديدة تحتوي على 12.4 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم درجة الحموضة 5.2.
  2. هطول الأمطار الإيثانول
    1. إضافة 350 درجة مئوية من الإيثانول 100٪ ومزيج تماما عن طريق الانعكاس.
    2. الحضانة لمدة 10 دقائق على الأقل على الجليد الجاف.
      ملاحظة: التوقف عن الإيقاف. للراحة، يمكن للمرء أن يتوقف هنا وإكمال الإجراء في اليوم التالي. ومع ذلك، فمن الممكن المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 3.3 وتشغيل هلام في نفس اليوم. يمكن الاحتفاظ بالحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية لبضعة أيام قبل المزيد من المعالجة، ولكن لا تترك لفترات أطول.
  3. إعداد عينات الحمض النووي الريبي للهلام الكهربائي
    1. السماح للعينات للذوبان، ومزيج عن طريق عكس 2-3 مرات، والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 21،000 × ز، 4 درجة مئوية، في جهاز طرد مركزي منضدية. وفي الوقت نفسه، إعداد مزيج هلام denaturing (القسم 3.4.1).
    2. إزالة الإيثانول بعناية من العينات دون بيليه مزعجة.
    3. إضافة 500 درجة مئوية من الإيثانول 70٪، أنبوب عكس بضع مرات لغسل بيليه، ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 21،000 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجة مئوية.
    4. إزالة أكبر قدر ممكن من الإيثانول والقيام تدور سريعة (5-10 ق) من الأنابيب في جهاز الطرد المركزي أعلى الجدول. ثم، مع طرف تحميل هلام، وإزالة آخر حجم المتبقية من الإيثانول.
    5. الهواء الجاف بيليه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. حل الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 4 ميكرولتر من H2O إلى الجزء العلوي من كل بيليه. حضانة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. إضافة 4 μL من صبغ RNA 2X (انظر جدولالمواد) إلى المزيج، ومن ثم دوامة كل أنبوب لبضع ثوان لإعادة تعليق تماما RNA.
      ملاحظة: ينصح بصبغ الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على الفورماميد بدلا من اليوريا، لأن هذا الأخير يعجل في درجات حرارة منخفضة.
    8. سريع تدور الأنابيب، ومن ثم احتضانها في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة.
    9. تخزين أنابيب على الجليد الجاف حتى تكون جاهزة لتحميل على هلام.
      ملاحظة:       الحفاظ على الحمض النووي الريبي على الجليد الجاف يسمح المرونة للعمل على تجارب أخرى في حين أن هلام هو البلمرة. العينات لا تحتاج إلى إعادة تسخينها بعد ذوبان. ومع ذلك، يمكن تحميل الحمض النووي الريبي مباشرة بعد التدفئة إذا كان الجل على استعداد لتشغيل.
  4. تحضير جل اليوريا-بيج
    1. لمزيج هلام 40 مل، والجمع بين في أنبوب مخروطي 50 مل: 16.7 غرام من اليوريا، 15 مل من 40٪ مكررا: محلول أكريلاميد (19:1 نسبة)، 4 مل من 10X TBE (1 M Tris-HCl، 1 M بورات الصوديوم، 20 M M EDTA)، و 8 مل من H2O. هذا الحجم يكفي لهلام حجم قياسي واحد (18 سم الارتفاع × 16 سم العرض) مع 1.0 مم الفواصل.
      تحذير: الأكريلاميد سام للغاية. في حين لا يوجد خطر استنشاق عندما يكون في الحل، وارتداء دائما معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة أثناء التعامل مع.
      ملاحظة: هذا الخليط هو لصب هلام بولياكريلاميد 15٪ denaturing، الذي يحل بسهولة RNA بين 15-50 nt. تغيير تركيز مكررا / أكريلاميد حسب الحاجة لحل مختلف النصوص RNA من أطوال مختلفة.
    2. ضع أنبوب مغلق يحتوي على مزيج جل على مُنقّب حتى يذوب اليوريا بالكامل.
    3. إعداد محطة صب هلام مع لوحات زجاجية، 1 ملم الفواصل ومشط 15 جيدا.
    4. تعمل بسرعة، إضافة 40 درجة مئوية من TEMED و 400 ميكرولتر من 10٪ محلول كبريتات الأمونيوم إلى حل هلام ومزيج جيدا. باستخدام الأنابيب 25 مل، صب حل هلام بين لوحات، إدراج مشط، والسماح للهلام لبوليمر لمدة 2 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: إذا سكب الجل أكثر من 2 ساعة قبل الاستخدام، بمجرد أن يكون بلمرة تغطيه مع منشفة ورقية رطبة (ترك المشط في مكانه) والتفاف مع التفاف من البلاستيك لمنعه من التجفيف.
  5. ديناتوريينغ جل RNA الكهربائي
    1. بعد البلمرة، نقل هلام لتشغيل خزان والتشغيل المسبق في 20 مأ في 1X TBE لمدة 15-30 دقيقة.
    2. وفي الوقت نفسه، تذوب عينات (إذا المجمدة)، دوامة، وتدور لهم لمدة 4 دقائق في 2000 × ز، 4 درجة مئوية.
    3. عندما تكون جاهزة، إيقاف إمدادات الطاقة، وشطف بعناية كل بئر مع 1X TBE باستخدام حقنة.
    4. استخدام نصائح تحميل هلام لتحميل العينات على هلام.
    5. تشغيل هلام في ثابت 20-30 مالا لحوالي 2 ساعة أو حتى أقل صبغ (إكسيلين سيانول FF) يصل إلى الجزء السفلي من هلام.
  6. إزالة الجل، وضعه على قطعة من الورق ماصة، والتفاف مع التفاف من البلاستيك.
  7. عرض هلام مسمى لاسلكيا إلى الفوسفور.
  8. مسح الفوسفور باستخدام الفوسفورمج وتحليل الصورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويبين الشكلان 2 و3 ردود فعل نتيجة تمثيلية تستخدم لتوليد مجمعات استطالة اصطناعية تحتوي على نسخ من أطوال مختلفة عن طريق تمديد أو النص الثاني من مصادر مختلفة. يصور الشكل 4 كيف يمكن استخدام هذه المجمعات استطالة لفحص co-transcriptional CTD الفسفور تعتمد RNA السد.

الشكل 2A هو رسم تخطيطي لجزيئات الحمض النووي والحمض النووي الريبي في مجمعات اس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن تسهيل الدراسات التي تسعى إلى تشريح الأحداث إلى جانب مجمع استطالة Pol II مثل معالجة الحمض النووي الريبي وتنظيم استطالة النص نفسه إلى حد كبير باستخدام نظام إنزيم عالي النقاء. إنشاء مثل هذه النظم الإنزيم يمكن أن يكون تحديا. ويتطلب النسخ المعتمد على المروج من قبل الشرطة الثانية خمسة عوامل عامة على الأقل للنسخ. وقد يستغرق إعداد هذه العوامل وتخزينها شهوراً؛ وبالتالي، فإن الخطوة التي تحد من معدل في هذه العملية هي في كثير من الأحيان ببساطة إعداد كادر من عوامل النسخ اللازمة لإعادة تشكيل النسخ القاعدية في أنبوب الاختبار.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر س. شومان على توفير الانزيم اتلاف الثدييات cDNA. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بمنحة لمعهد أبراج للبحوث الطبية من صندوق هيلين نيلسون للبحوث الطبية في مؤسسة مجتمع مدينة كانساس الكبرى.  يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية في Stowers في http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
[&alpha ؛ -32< / sup>P] UTP (3000 Ci / mmol) ، 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCلوضع العلامات الراديوية على صبغة تحميل الحمض النووي
2x RNAبه بشدة. لتحضير الحمض النووي الريبي أثناء تحميل الجل
40٪ مكرر: محلول أكريلاميدBiorad1610144
ألبومين مصل الأبقار (20 مجم / مل) نيوإنجلاند بيولابسB9000S
Cdk7 / Cyclin H / MAT1 (مركب CAK) بروتين ، نشط ، 10 وميكرو ؛ زMillipore Sigma14-476تستخدم لفسفرة Pol II CTD
DNA oligonucleotidesIDTانظر الجدول 8 للحصول على مواصفات
النقاء Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001لقد استخدمنا أيضا Dynabeads M-280 ستريبتافيدين دون مشكلة ولكننا نفضل حبات MyOne Streptavidin لأنها ترسب بشكل أبطأ
GlycoBlue Coprecipitant (15 & thinsp; مجم / مل)بشدة باستخدام Life Technologies InvitrogenAM9516. الأصباغ الحمض النووي بيليه الأزرق تجعل التفاعلات أسهل بكثير في التعامل مع
نظام الرحلان الكهربائي العمودي المزدوج المبرد القياسي Hoefer SE600 مع فواصل 1 مم و 15 مشطبئر HoeferSE600-15-1.5
أنابيب MaXtract عالية الكثافة (1.5 مل)Qiagen129046موصى به بشدة. يحتوي على هلام عالي الكثافة يشكل حاجزا ثابتا بين المراحل المائية والعضوية ؛ يحسن غلة الحمض النووي الريبي أثناء الاستخراج
محلول البروتيناز K (20 & thinsp ؛ ملغ / مل)Life Technologies Invitrogen25530049
النوكليوتيدات الحمض النووي الريبيTrilinkانظر الجدول 8 لمزيد من التفاصيل
الخميرة غير العضوية بيروفوسفاتيز (100 وحدة / مل)England BiolabsNEBM2403Sمطلوب فقط أثناء تفاعلات السد
الريبي يوصى ينصح قليل New

المراجع

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA RNA TFIIH
الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.