يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد

12.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59508

⸱

مايو 20, 2019

 ,  , 
1Wistar Institute

في هذه المقالة

ملخص

نماذج xenograft المستمدة من المريض (PDX) أكثر قوة تلخيص الميزات الجزيئية والبيولوجية الورم الميلانيني وأكثر تنبؤا من استجابة العلاج مقارنة مع الاختبارات التقليدية القائمة على ثقافة الأنسجة البلاستيكية. هنا نقوم بوصف بروتوكول التشغيل القياسي الخاص بنا لإنشاء نماذج PDX جديدة وتحديد خصائص/تجريب نماذج PDX الموجودة.

الملخص

تشير الأدلة المتراكمة إلى أن الخصائص الجزيئية والبيولوجية تختلف في خلايا الورم الميلانيني التي تنمو في أوعية زراعة الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد مقابل في الجسم الحي في المرضى البشر. ويرجع ذلك إلى اختيار عنق الزجاجة من السكان clonal من خلايا الورم الميلانيني التي يمكن أن تنمو بقوة في المختبر في غياب الظروف الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابات للعلاج في الثقافات الأنسجة ثنائية الأبعاد عموما لا تعكس بأمانة الاستجابات للعلاج في مرضى الورم الميلانيني، مع غالبية التجارب السريرية فشل في إظهار فعالية تركيبات العلاجية أظهرت أن تكون فعالة في المختبر. على الرغم من أن xenografting خلايا الورم الميلانيني في الفئران يوفر الفسيولوجية في سياق الجسم الحي غائبة عن اختبارات زراعة الأنسجة ثنائية الأبعاد، خلايا الورم الميلانيني المستخدمة للتطعيم قد خضعت بالفعل لاختيار عنق الزجاجة للخلايا التي يمكن أن تنمو تحت ثنائي الأبعاد الظروف عندما تم تأسيس خط الخلية. وتشمل التعديلات التي لا رجعة فيها التي تحدث نتيجة للاختناق التغيرات في خصائص النمو والغزو، فضلا عن فقدان مجموعات فرعية محددة. ولذلك، فإن النماذج التي تُزيّن بشكل أفضل الحالة الإنسانية في الجسم الحي قد تتنبأ بشكل أفضل بالاستراتيجيات العلاجية التي تزيد بشكل فعال من البقاء الكلي للمرضى الذين يعانون من الورم الميلانيني النقيلي. تتضمن تقنية xenograft (PDX) المشتقة من المريض الزرع المباشر للخلايا السرطانية من المريض البشري إلى متلقي الماوس. وبهذه الطريقة ، تنمو الخلايا السرطانية باستمرار تحت ضغوط فسيولوجية في الجسم الحي ولا تخضع أبدا ً للاختناق الثنائي الأبعاد ، الذي يحافظ على الخصائص الجزيئية والبيولوجية الموجودة عندما كان الورم في المريض البشري. ملحوظة، نماذج PDX المستمدة من مواقع الأعضاء من الانبثاث (أي الدماغ) عرض قدرة النقيلي مماثلة، في حين نماذج PDX المستمدة من المرضى السذاجة العلاج والمرضى الذين يعانون من مقاومة المكتسبة للعلاج (أي BRAF / MEK العلاج المانع) عرض حساسية مماثلة للعلاج.

المقدمة

النماذج ما قبل السريرية حاسمة لجميع جوانب أبحاث السرطان الترجمة، بما في ذلك توصيف المرض، واكتشاف نقاط الضعف القابلة للتنفيذ فريدة من نوعها للسرطان مقابل الخلايا الطبيعية، وتطوير العلاجات الفعالة التي تستغل هذه نقاط الضعف لزيادة البقاء على قيد الحياة عموما للمرضى. في مجال الورم الميلانيني، تم استخدام عشرات الآلاف من نماذج خط الخلية بشكل كبير لفحص المخدرات، مع > 4000 ساهمت بها مجموعتنا وحدها (سلسلة WMXXX). تم اشتقاق نماذج خط الخلية هذه من مرضى الورم الميلانيني الذين يعانون من أشكال مختلفة من الورم الميلانيني الجلدي (أي، الآكر، أوفيال، وانتشار السطحية) والأنماط الجينية المتنوعة (أي BRAFV600-متحولةوالورم الأرومي العصبي RAS الفيروسية الأنكيوجينية المتجانسة [ فى الانمازى Q61R-متحولة)،والتي تمتد طيف من الأمراض الموجودة في العيادة1،2.

بشكل لا لبس فيه، ظهرت استراتيجية العلاج الأكثر نجاحا والمستهدفة في مجال الورم الميلانيني من 1) التوصيف الجيني لأورام المرضى تحديد طفرات BRAF في ~ 50٪ من الأورام الميلانينية3 ومن 2) التحقيق قبل السريرية الاستفادة من نماذج خط الخلية الميلانوما4. وكان مزيج مثبطات BRAF / MEK إدارة الغذاء والدواء (FDA) المعتمدة في عام 2014 لعلاج المرضى الذين الأورام الميلانينية ميناء تفعيل الطفرات BRAFV600E / K وتفتخر > 75٪ معدل الاستجابة5. على الرغم من هذه الفعالية الأولية، والمقاومة تنشأ بسرعة في كل حالة تقريبا بسبب آليات المقاومة الجوهرية والمكتسبة متعددة والتباين داخل الورم. لسوء الحظ، نماذج خط الخلية لا تلخص التغاير البيولوجي التمثيلي عندما تزرع في ثقافة ثنائية الأبعاد في الأوعية البلاستيكية، والتي تخفي إمكاناتها التنبؤية سريريا عندما يحاول المحققون تحديد تجريبيا العلاجات التي قد تكون فعالة في المرضى الذين يعانون من شكل معين أو النمط الجيني من الورم الميلانيني6. إن فهم كيفية تحسين عدم تجانس المريض داخل الأورام سوف يسمح للمحققين بتطوير الطرائق العلاجية التي يمكن أن تقتل التجمعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج التي تدفع الفشل في العلاجات الحالية لمعيار الرعاية.

ومن الأهمية بمكان بالنسبة للقيمة التنبؤية المحدودة لنماذج خطوط الخلايا كيفية إنشائها في البداية. تحدث تعديلات لا رجعة فيها في المشهد الكلوني الورم عندما يتم زراعة تعليق خلية واحدة من ورم المرضى على ثنائي الأبعاد، والأوعية زراعة الأنسجة البلاستيكية، بما في ذلك التغيرات في إمكانات التكاثر والغازية، والقضاء على محددة التجمعات السكانية الفرعية، وتغيير المعلومات الوراثية7. Xenografts في الفئران من هذه النماذج خط الخلية الورم الميلانيني تمثل الأكثر استخداما في منصة الجسم الحي للدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك، فإن هذه الاستراتيجية تعاني أيضا من التلخيص الفقراء من عدم تجانس الورم معقدة لوحظ سريريا. وللتغلب على هذا القصور، كان هناك اهتمام متزايد بدمج نماذج أكثر تطوراً قبل السريرية للميلانوما، بما في ذلك نموذج PDX. وقد استخدمت نماذج PDX لمدة [30 عاماً)، مع دراسات أساسية في مرضى سرطان الرئة مما يدل على التوافق بين استجابةالمرضى للعوامل السامة للخلايا واستجابة نموذج PDX المستمدة من نفس المريض 8. في الآونة الأخيرة، كان هناك حملة لاستخدام نماذج PDX كأداة الاختيار للتحقيقات ما قبل السريرية سواء في هذه الصناعة وفي المراكز الأكاديمية. نماذج PDX، بسبب تلخيصها متفوقة من عدم تجانس الورم في المرضى البشر، هي أكثر ملاءمة سريريا لاستخدامها في جهود تحسين العلاج من خط الخلية xenografts9. في الورم الميلانيني ، هناك عقبات هائلة أن الحدة من الإدارة العلاجية للمرض المتقدم10. وقد استخدمت نماذج PDX ذات الصلة سريريا لنموذج المقاومة السريرية وتحديد الاستراتيجيات العلاجية مع العوامل المتاحة سريريا لعلاج الأورام المقاومة للعلاج11،12. باختصار، يتطلب البروتوكول المعروض هنا لتوليد نماذج PDX زرع تحت الجلد من الأنسجة الطازجة من الأورام الميلانينية الأولية أو النقيلية (التي تم جمعها عن طريق خزعة أو جراحة) في NOD / scid / IL2 مستقبلات فارغة (NSG) الفئران. وتستخدم مجموعات مختلفة تباينات مختلفة في النهج المنهجي؛ ومع ذلك، يوجد جوهر أساسي13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتبع البروتوكولات الحيوانية التالية المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات الإنسانية في معهد ويستار والمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات.

1. جمع أنسجة الورم الميلانيني

  1. جمع أنسجة الورم (تسمى ممر 0) من مرضى الورم الميلانيني من قبل واحدة من الجراحة التالية أو طرق خزعة.
    1. بالنسبة لأنسجة الختان الجراحي، حافظ على ما لا يقل عن 1 غرام من الأنسجة (الانبثاث الاستئصالي والآفات الأولية) في وسائل تخزين النقل (RPMI 1640 + 0.1٪ فطريات + 0.2٪ جنتاميسين) عند 4 درجة مئوية أو على الجليد.
    2. بالنسبة لأنسجة الخزعة الجراحية، حافظ على أقل من 1 غرام من الأنسجة (غالبًا ما يتم كلك الخزعات من الانبثاث تحت الجلد [s.c.] والانبثاث اللمفاوي [LN] الانبثاث) في وسائط تخزين النقل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية أو على الجليد.
    3. بالنسبة لأنسجة الخزعة الأساسية، قم بغسل اسطوانة (نواة) من الأنسجة التي تبلغ حوالي 10 مم × 1 مم (غالبًا، خزعات الكبد) في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسائط تخزين النقل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الجليد.
    4. للحصول على الأنسجة الدقيقة لستنشق إبرة (FNAs)، والحفاظ على كمية صغيرة جدا من الأنسجة (أقل من 1 ملم في الحجم) تؤخذ مباشرة من المريض في إبرة وحقنة في 4 درجة مئوية أو على الجليد.
  2. تسليم الأنسجة في وسائل تخزين النقل في 4 درجة مئوية أو على الجليد في نفس اليوم أو مع الشحن بين عشية وضحاها بعد الختان الجراحي أو خزعة. معالجة الأنسجة في غضون 1-2 ساعة من الولادة.

2. معالجة أنسجة الورم لزرع الماوس

  1. الختان الجراحي أو جراحة الخزعة معالجة الأنسجة
    1. نقل الأنسجة إلى طبق بيتري معقمة وفصل أنسجة الورم من الأنسجة الطبيعية المحيطة قدر الإمكان.
    2. إزالة الأنسجة النخرية (عادة ما تكون الأنسجة الشاحبة البياضة الموجودة مركزيا داخل الورم) من الورم المتبقي قدر الإمكان.
    3. استخدام مشرط لتقسيم قطعة الورم الأولية إلى قطع متساوية تقريبا (~ 3 مم× 3 مم) لزرع الماوس الجراحي (الشكل 2).
    4. اختياريا، إذا كان ما يكفي من أنسجة الورم متاح، المفاجئة تجميد الأنسجة لالاختبارات المصب (تسلسل RNA [RNASeq]، تسلسل exome كله [WES]، الخ).
    5. جعل الطين الورم عن طريق فرم أنسجة الورم باستخدام تقنية شفرة الصليب مع اثنين من شفرات مشرط. يُقطّع الورم بأكبر قدر ممكن من الدقة لتشكيل الطين، والذي أصبح الآن جاهزًا لزرع الماوس الجراحي.
    6. بدلا من ذلك، إذا كان نسيج الورم من الصعب جدا للانفصال الميكانيكية، واستخدام إجراء تفكك الهضم لتشكيل الطين مثل هلام وتعليق خلية واحدة لزرع و / أو حقن.
      1. يُقطّع الورم بأكبر قدر ممكن من الأننف لتشكيل الطين.
      2. وضع الطين في أنبوب 50 مل مع محلول الملح متوازنة هانك الباردة (HBSS)-/- (دون كاليفورنيا++ وMg++); ثم، الطرد المركزي وبيليه في 220 × ز لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية.
      3. إعادة تعليق الطين في 10 مل من وسائل الإعلام هضم الطازجة الدافئة (200 U / مل كولاجيناز الرابع + 5 مليون CaCl2 + 50 U / ML DNase في HBSS-/-) لكل 1 غرام من أنسجة الورم.
      4. ضع الأنبوب في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واخلط بقوة كل 5 دقائق مع ماصة يمكن التخلص منها.
      5. غسل مع ما يصل إلى 50 مل من HBSS-/-; ثم، الطرد المركزي في 220 × ز لمدة 4 دقائق في 4 درجة مئوية.
      6. إضافة 5 مل من TEG prewarmed (0.025٪ تريبسين + 40 ميكروغرام / مل الإيثيلين غليكول-بيس (β-aminoethyl الأثير) -N، N، N، N'، N'- حمض رباعي الأسيتيك [EGTA] + 10 ميكروغرام / مل كحول البولي فينيل [PVA]) لكل 1 غرام من أنسجة الورم، بلطف تعليق / يهز، ووضع الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة دون خلط.
      7. إضافة ما لا يقل عن 1 حجم متساو من وسائل الإعلام تلطيخ الباردة (1٪ الزلال المصل البقري [BSA] + 10 مل 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينإيثانسولفونيك حمض [HEPES] + 1X البنسلين-ستربيتوماسين في وسائل الإعلام L15) لإرواء التربسين والطرد المركزي في 220 × ز لمدة 4 دقائق في 4 ° ج.
      8. إعادة تعليق العينة في 10 مل من وسائل الإعلام تلطيخ لكل 1 غرام من أنسجة الورم وتصفيتها من خلالمصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على تعليق خلية واحدة لحقن الماوس (الشكل 2).
      9. كما يمكن جمع الطين المتبقي على رأس مصفاة الخلايا لزرع الماوس الجراحي.
  2. جيم خام خزعة معالجة الأنسجة
    1. صب الأنسجة اسطوانة الأساسية في أنبوب نقل الأنسجة في طبق بيتري 5 سم.
    2. إزالة السائل الزائد، وكشط الأنسجة إلى حافة طبق بيتري، ودقيقة ناعما أنسجة الورم، إضافة ~ 100-150 درجة مئوية من HBSS-/- على رأس أنسجة الورم، ورسم بسرعة HBSS / تعليق أنسجة الورم في حقنة 1 مل.
    3. إرفاق إبرة 23 G إلى حقنة 1 مل، وتمرير HBSS / تعليق الأنسجة الورم من خلال الإبرة في أنبوب تدور 1.5 مل.
    4. إعادة رسم تعليق الورم في الحقنة مع الإبرة لا تزال على حتى يمكن أن تمر بسلاسة من خلال الإبرة.
    5. وأخيرا رسم تعليق الورم مرة أخرى في الحقنة وفصل إبرة 23 G.
    6. إرفاق إبرة 27 G ورسم حجم متساو (~ 100-150 درجة مئوية) من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية (انظر جدولالمواد) في الحقنة.
    7. إضافة حجم متساو من مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية ببطء في أنبوب تدور 1.5 مل مع الورم / HBSS-/- تعليق، وتجنب بعناية تشكيل فقاعات.
    8. رسم مرة واحدة أخيرة مرة أخرى إلى الحقنة والأنسجة الورم خزعة الأساسية جاهزة الآن لحقن الماوس.
  3. FNA معالجة الأنسجة
    1. ضع الحقنة التي تحتوي على عينات FNA (المحاصرين في الإبرة) على الجليد.
    2. فصل الإبرة (التي تحتوي على أنسجة FNA) من المحاقن وإزالة الغطاس من المحاقن، إضافة ~ 150-200 درجة مئوية من HBSS-/- إلى الجزء العلوي من الحقنة.
    3. إعادة إدراج الغطاس في المحاقن والإبرة (التي تحتوي على أنسجة FNA)، ودفع خارج HBSS-/- من خلال الإبرة في أنبوب تدور 1.5 مل. هذه الخطوة يزيل الورم FNA من الإبرة.
    4. كرر الخطوة 2.3.3 مع تعليق HBSS-/-/FNA مرتين باستخدام نفس الحقنة لتحقيق أقصى قدر من استعادة أنسجة الورم من الإبرة.
    5. إضافة حجم متساو (~ 100-150 درجة مئوية) من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية إلى أنبوب تدور 1.5 مل يحتوي على تعليق HBSS/FNA.
    6. مزيج كاف عن طريق رسم ببطء مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية / HBSS-/-/ FNA تعليق مرة أخرى في إبرة 23 G وتكرار مرتين.
    7. رسم كامل مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية / HBSS-/-/ / FNA وحدة التخزين مرة أخرى في الحقنة، واستبدال إبرة 23 G مع إبرة 27 G، وعينة FNA جاهزة الآن لحقن الماوس.

3. زرع الورم والحقن في الفئران

  1. زرع الختان الجراحي أو أنسجة الخزعة الجراحية
    ملاحظة: تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية معقمة عن طريق الأوتوكلاف أو استخدام الأدوات التي يمكن التخلص منها مسبقا.
    1. حلاقة الشعر من أسفل الظهر من NSG 6-8 أسابيع الفئران الذكور أو الإناث ترك ما يقرب من 1.5 سم × 3 سم المنطقة مع عدم وجود الشعر. تخدير الفئران باستخدام isoflurane، وتأكيد عن طريق الضغط بلطف على القدم كاختبار للاستجابة. استخدام مرهم الطبيب البيطري على عيونهم لمنع الجفاف.
    2. وضع الفئران الفردية على وسادة الحرارة في مخروط الأنف من آلة التخدير، فرك المنطقة حلق مع الكلورهيكسيدين. ثم تُدوّن مع الإيثانول بنسبة 70% والسماح بالتبخر.
    3. إعداد قطع أو تقسيم الطين الورم في طبق بيتري في أكوام الفردية لزرع الجراحية (أي، إلى ثلاثة أكوام متساوية إذا كان ليتم زرعها في 3 فئران).
    4. باستخدام شفرة المشرط، قم بعمل شق بطول 5 مم تقريبًا على وسط الجزء الخلفي من الماوس، وخذ زوجًا واحدًا من الملقط ورفع الجلد على جانب الشق المقابل للمشغل.
    5. تأخذ مقص في اليد الأخرى وفصل الجلد من طبقة العضلات عن طريق قطع بلطف الغشاء اللفافة مع تخفيضات مقص صغيرة، وبالتالي خلق "جيب" لأنسجة الورم.
    6. التقاط قطعة ورم واحدة أو كومة واحدة فردية من أنسجة الطين الورم مع شفرة مشرط ووضع بلطف الأنسجة في الجيب الذي تم إنشاؤه.
    7. إدارة 100 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على كومة أنسجة الورم في الجيب.
    8. باستخدام اثنين من أزواج من الملقط، وسحب ما يصل شق على كلا الطرفين بحيث حواف الجرح تأتي قريبة من بعضها البعض، وإغلاق الجرح عن طريق تطبيق واحد أو اثنين من مقاطع الجرح.
    9. حقن تحت الجلد 1-5 ملغ / كغ ميلوكسيكام كما مسكن في الفئران بعد الجراحة.
    10. إخراج الماوس من مخروط الأنف ووضعها مرة أخرى في قفصها الأصلي، ومراقبة الماوس أثناء الاستيقاظ. لا تعود إلى القفص حتى تتعافى تماما.
    11. إزالة مقاطع الجرح بعد حوالي 7 أيام. إذا لم يكتمل الشفاء بعد 7 أيام، اترك مقطع الجرح لمدة يوم أو يومين إضافيين.
      ملاحظة: إذا كان استخدام تعليق خلية واحدة من الختان الجراحي أو معالجة الأنسجة خزعة الجراحية، فإنه سيتم خلط مع مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية (بنسبة 1:1) لحقن الفئران.
  2. حقن الأنسجة الخزعة FNA أو الخزعة الأساسية
    1. وضع الماوس NSG على رف شبكة الصلب، وعقد الماوس بحزم من الذيل، وسحب بلطف الماوس مرة أخرى. وسوف فهم الشبكة مع ساقيه اجلنجي بقوة. بدلا من ذلك، تقييد الماوس في اليد غير المهيمنة والسماح لمنطقة الجناح مرئية.
    2. تطهير الجلد من الجناح مع مسحات الإعدادية الكحول، ببطء وبشكل مطرد حقن محتويات الحقنة تحت جلد الماوس.
    3. سحب الإبرة ووضع الماوس مرة أخرى في قفصها.

4. رصد نمو الورم

  1. مراقبة الفئران مرة واحدة أسبوعيا للتحقق من وجود أورام واضحة.
  2. مرة واحدة الأورام في حجم قابلللقياس (ما يقرب من 50 مم 3)، واستخدام الفرجار لتسجيل أبعاد الورم. استخدم الصيغة التالية لحساب وحدات تخزين الورم: (العرض × العرض × الطول) / 2.
  3. حصاد الورم بمجرد أن يصل حجم الورم إلى حوالي 1.5 سم3 (حوالي 4-10 أسابيع). ويسمى الورم الآن ممر الماوس 1 (MP1).

5. ورم الحصاد للأنسجة المصرفية، وإعادة زرع، وتجربة / توصيف

  1. يُقتل الماوس في غرفة CO 2، ويتحقق من العلامات الحيوية لتأكيد الوفاة، ثم يغمر الماوس في محلول فيركون لتعقيم الجلد لمدة 30 ق في مجلس الوزراء الحيوي.
  2. استخدام مقص منحني وملقط الجراحية لرفع الجلد المجاور ة الورم وجعل قطع أفقي.
  3. استخدام تقنية فصل حادة لتعبئة الجلد على جانبي الورم وعلى الورم، وفضح الورم.
  4. استخدام مقص أو شفرة مشرط لفصل الورم عن اللفافة.
  5. استئصال الورم ونقل الورم إلى طبق بيتري معقمة، وقطع الورم إلى قطع صغيرة وإزالة الأنسجة النخرية من الورم.
  6. أنسجة الورم البنكية للزرع في المستقبل.
    1. خذ 2-3 قطع ورم صغيرة أصغر من ~ 10 مم × 10 مم وmince لهم إلى قطع أصغر من ~ 1 مم × 1 ملم.
    2. نقل جميع الأنسجة المفرومة إلى قارورة المبردة 2 مل، إضافة 1 مل من وسائل الإعلام تجميد (10٪ DMSO + 90٪ FBS).
    3. خلط جيدا ووضع قارورة المبردة في حاوية تجميد الخلايا القائمة على isopropanol قبل تبريدها على الجليد الجاف.
    4. تخزين حاوية في -80 درجة مئوية الفريزر بين عشيةوضحاها ومن ثم نقل قارورة المبردة إلى النيتروجين السائل (LN 2) التخزين.
  7. الأنسجة المفاجئة التجميد لالاختبارات المصب (RNASeq، WES، الخ).
    1. وضع قطع أنسجة الورم (~ 3 مم × 3 مم) في قارورة المبردة ووضع قارورة المبردة في LN2 على الفور. تخزين قارورة في -80 درجة مئوية الفريزر.

6. PDX العلاج المحاكمات

ملاحظة: سوف يستغرق مرحلتين التوسع لزراعة ما يكفي من أنسجة الورم لتوليد العدد اللازم من الفئران تحمل PDX للمحاكمة العلاج.

  1. التقاط التبريد التي تحتوي على الأنسجة PDX المصارف من LN2، ووضع الفيلة الجليدية في حمام المياه 37 درجة مئوية حتى وسائل الإعلام تجميد تحتوي على أنسجة الورم بدأت للتو في الذوبان.
  2. إفراغ محتويات الكرفية في HBSS قبل تسخينها-/- في أنبوب 50 مل، وغسل الأنسجة.
  3. بيليه الأنسجة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة.
  4. إزالة HBSS-/- من عينة الورم عن طريق الشفط فراغ مع pipet باستور.
  5. حرك أنسجة PDX من أنبوب 50 مل إلى طبق بيتري 5 سم أو 10 سم وضعه على الجليد الرطب.
  6. اتبع بروتوكول الزرع أعلاه لزرع الأنسجة المصارف من قارورة المبردة في 5 فئران NSG للجولة الأولى من توسيع الورم PDX.
  7. مرة واحدة تصل الأورام ~ 600-800 مم3،حصاد 1-2 الأورام للحصول على تعليق خلية واحدة مع البروتوكول المذكور أعلاه لمعالجة أنسجة الورم: التفكك الميكانيكي، الكولاجين عملية فك الهضم.
  8. خلايا بيليه وإعادة تعليق في 6 مل من HBSS-/-/ مصفوفة خارج الخلية الاصطناعية (1: 1 نسبة)، حقن تحت الجلد ~ 50 الفئران NSG، مع 100 درجة مئوية من خليط الخلية لكل فأر للجولة الثانية من توسيع الورم PDX.
  9. قياس حجم الورم مع الفرجار كل أسبوعين.
  10. انتظر حجم الورم من ~ 100 مم3 في 3-5 أسابيع، العشوائية الفئران في مجموعات، والبدء في العلاج.
  11. عندما يصل حجم الورم إلى الحد الأقصى لحجم معتمد من IACUC، توقف عن العلاج.
  12. اتبع بروتوكول الورم الحصاد أعلاه لجمع قطع الورم المجمدة المفاجئة، وقطع الورم لكتل البارافين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أنسجة الورم لنماذج PDX الورم الميلانيني يمكن أن تأتي من مجموعة متنوعة من مصادر مختلفة، ويمكن أيضا أن تعالج وفقا لديناميات النمو من النماذج الفردية والاستخدام المطلوب من أنسجة PDX. وتتمثل الأولوية عند إنشاء نموذج PDX في الحصول على ما يكفيمن المواد لاستخدامها في المستقبل والحمض النووي لتوصيفها (الشكل 1).

بمجرد أن يتم تحويل المواد الكافية إلى بنك، يمكن توسيع أنسجة الورم في واحدة من ثلاث طرق رئيسية لنمو الورم بما فيه الكفاية لإجراء دراسة العلاج الرسمي (الشكل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد وصفنا هنا توليد نماذج PDX من الورم الميلانيني مع أنسجة المريض المستمدة من الأورام الأولية والنقيلية، والخزعات الأساسية، وFNAs. عندما يتم تطعيمها مباشرة في الفئران NSG، والأورام تقديم خصائص مورفولوجية وجينية وبيولوجية مماثلة لتلك التي لوحظت في المريض. في حالة توافر كمية صغيرة فقط من الأنسجة للمحققين، كما يحدث في كثير من الأحيان مع FNAs، فإن تقنية PDX تسمح بتوسيع أنسجة الورم للحمض النووي، الحمض النووي الريبي، وتوصيف البروتين، وكذلك لتجارب العلاج للسماح بالأدوية قبل السريرية التنميه.

ومن الأه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويشكر المؤلفون مرفق معهد ويستار للحيوانية، ومرفق الفحص المجهري، ومرفق التكنولوجيا الهيستوجية، ومركز إمدادات البحوث. تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من المنح المقدمة من U54 (CA224070-01)، وSPORE (CA174523)، P01 (CA114046-07)، والدكتور ميريام وشيلدون ج. أديلسون مؤسسة البحوث الطبية، ومؤسسة أبحاث الورم الميلانيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 م هيبسسيجما-ألدريتش كوربوريشنالقط # H0887-100ML
100x PenStrep InvitrogenCat # 15140163
1x HBSS-/- (بدون Ca ++ أو Mg ++)MEDCat # MT21-023-CV
2.5٪ Trypsin SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCAT # T4549-100ML10 مل مخزونات مخزنة في &NDASH ؛ 20oC
BSASIGMA-ALDRICH CORPORATIONCAT # A9418-500G
ChlorhexidineFisher ScientificCat # 50-118-0313
Collagenase IV (2,000 u / mL)Worthington Cat # 4189Makeup في HBSS - / - من مخزون مسحوق Collagenase IV (Worthington # 4189 ، u / mg المشار إليه على الزجاجة ويختلف باختلاف كل دفعة) ؛ تجميد 1
DMSOSIGMA-ALDRICH CORPORATIONCAT # C6295-50ML
DNaseSIGMA-ALDRICH CORPORATIONCAT # D4527
EGTA (إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N ، N ' N'-tetraacetic acid)MerckCat # 324626.25
FBSINVITROGEN LIFE TECHNOLOGIESCAT # 16000-044
FungizoneINVITROGEN LIFE TECHNOLOGIESCAT # 15290-018
GentamicinFISHER SCIENTIFICCat # BW17518Z
IsofluraneHENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHCAT # 050031
وسائط L15 Leibovitz  InvitrogenCat # 21083027
MatrigelCorningCat # 354230مصفوفة اصطناعية خارج الخلية
MeloxicamHENRY SCHEIN ANIMAL HEALTHRequisition # :: Henry ScheinCat # 0251151-5mg / kg ، كمسكن للألم
NOD / SCID / IL2-receptor null (NSG) الفئرانمعهد Wistar ، منشأةلتربية
PVA (كحول البولي فينيل)SIGMA-ALDRICH CORPORATIONCAT # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X مع L-GlutamineFisher ScientificCat # MT10041CM
ScalpelFeatherCat # 2976-22
VirkonGALLARD-SCHLESINGER INDCAT # 222-01-06
مقاطع الجرحMikRonCat # 427631
حيوانية

المراجع

  1. Garman, B., et al. Genetic and Genomic Characterization of 462 Melanoma Patient-Derived Xenografts, Tumor Biopsies, and Cell Lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
  2. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  3. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  4. Paraiso, K. H., et al. Recovery of phospho-ERK activity allows melanoma cells to escape from BRAF inhibitor therapy. British Journal Of Cancer. 102 (12), 1724-1730 (2010).
  5. Long, G. V., et al. Long-Term Outcomes in Patients With BRAF V600-Mutant Metastatic Melanoma Who Received Dabrafenib Combined With Trametinib. Journal of Clinical Oncology. 36 (7), 667-673 (2018).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  7. Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical and Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
  8. Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results In Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
  9. Izumchenko, E., et al. Patient-derived xenografts effectively capture responses to oncology therapy in a heterogeneous cohort of patients with solid tumors. Annals of Oncology. 28 (10), 2595-2605 (2017).
  10. Shi, H., et al. Acquired resistance and clonal evolution in melanoma during BRAF inhibitor therapy. Cancer Discovery. 4 (1), 80-93 (2014).
  11. Monsma, D. J., et al. Melanoma patient derived xenografts acquire distinct Vemurafenib resistance mechanisms. American Journal of Cancer Research. 5 (4), 1507-1518 (2015).
  12. Das Thakur, M., et al. Modelling vemurafenib resistance in melanoma reveals a strategy to forestall drug resistance. Nature. 494 (7436), 251-255 (2013).
  13. Meehan, T. F., et al. PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models. Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).
  14. Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
  15. De La Rochere, P., et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends in Immunology. 39 (9), 748-763 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

NSG
نموذج Xenograft مشتق من سرطان الجلد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.