الأشعة السينية الانعراج من العضلات الهيكلية Murine سليمة كأداة لدراسة الأساس الهيكلي لأمراض العضلات

Synchrotron زاوية صغيرة الأشعة السينية الانعراج هو الأسلوب المفضل لدراسة هيكل نانومتر مقياس من التعاقد بنشاط الاستعدادات العضلات في ظل الظروف الفسيولوجية. الأهم من ذلك، يمكن الحصول على المعلومات الهيكلية من الاستعدادات العضلات الحية أو البشرة في تزامن مع البيانات الفسيولوجية، مثل قوة العضلات والتغيرات طول. كان هناك اهتمام متزايد في تطبيق هذه التقنية لدراسة الأساس الهيكلي لأمراض العضلات الموروثة التي لها أساسها في الطفرات نقطة في البروتينات ساركوميريك. وكان مجتمع الفيزياء الحيوية العضلات نشطة جدا في توليد نماذج الماوس المعدلة وراثيا لهذه الظروف الأمراض البشرية التي يمكن أن توفر أسرة اختبار مثالية للدراسات الهيكلية. وقد أشارت المنشوراتالأخيرة من مجموعتنا 1،^2،3 وغيرها^4،5 أن أنماط الأشعة السينية من الماوس الموسعة رقمي longus (EDL) وعضلات السولوس يمكن أن توفر جميع معلومات الانعراج المتاحة من الكائنات الحية النموذجية أكثر تقليدية مثل الضفدع والأرنب psoas العضلات الهيكلية. ميزة إعداد العضلات الهيكلية الماوس هو سهولة تشريح وأداء الأغشية الأساسية سليمة، والتجارب الفسيولوجية العضلات كلها. أبعاد العضلات تشريح لديها كتلة كافية لإنتاج أنماط العضلات مفصلة للغاية في أوقات التعرض الأشعة السينية قصيرة جدا (~ مللي ثانية لكل إطار) على الجيل الثالث من شعاع الأشعة السينية.

تتكون أنماط انعراج الأشعة السينية العضلية من الانعكاسات الاستوائية، والانعكاسات الميرية، فضلا ً عن انعكاسات خط الطبقة. نسبة الكثافة الاستوائية (نسبة كثافة انعكاسات 1,1 و1,0 الاستوائية، I 11/I_10)،ترتبط ارتباطا وثيقا بعدد الجسور المتقاطعة المرفقة، وهو ما يتناسب مع القوة المتولدة في العضلات الهيكلية للماوس ^2.يمكن استخدام الانعكاسات meridional التي تقرير الدورات داخل خيوط سميكة ورقيقة لتقدير خيوط القابلية للتوسعة 1،^3،6،7. دعات إنعراج سمات لا على ال [مووند] والاتّلاو الاستواء طبقة خطوط, أيّ ينشأ من ال تقريبا [هلّيكلّي] يؤمر [موسين] رؤوس على السطح من سميكة خيوط عمود فقريّ [أس ولّ س] ال تقريبا [هلّيكلّي] يؤمر خيوط رقيقة. كثافة خطوط طبقة الموسين ترتبط ارتباطا وثيقا بدرجة ترتيب رؤساء myosin في ظل ظروف مختلفة^2،8. كل هذه المعلومات يمكن استخدامها دراسة سلوكيات البروتينات الساركوميريك في الموقع في الصحة والمرض.

وقد تم تاريخيا أنعراج الأشعة السينية Synchrotron من العضلات من قبل فرق من الخبراء المتخصصين للغاية ولكن التقدم في التكنولوجيا وتوافر أدوات جديدة للحد من البيانات تشير إلى أن هذا ليس دائما هو الحال. وBioCAT Beamline 18ID في مصدر الفوتون المتقدم، مختبر أرغون الوطني لديها الموظفين وأجهزة الدعم المخصصة لإجراء تجارب الانعراج بالأشعة السينية العضلات التي يمكن أن تساعد الوافدين الجدد إلى الميدان البدء في استخدام هذه التقنيات. يختار العديد من المستخدمين التعاون رسميا مع موظفي BioCAT، ولكن عددا متزايدا من المستخدمين يجدون أنهم يستطيعون القيام بالتجارب وتحليل أنفسهم مما يقلل من العبء على موظفي خط الحزمة. الهدف الرئيسي من هذه الورقة هو توفير التدريب الذي يوفر للتجارب المحتملة مع المعلومات التي يحتاجونها لتخطيط وتنفيذ التجارب على نظام العضلات الهيكلية الماوس إما في خط الحزمة BioCAT أو في غيرها من خطوط الحزم تدفق عالية حول العالم حيث هذه التجارب سيكون من الممكن.

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات التجارب الحيوانية من قبل معهد إلينوي للتكنولوجيا المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها لجنة (بروتوكول 2015-001، تاريخ الموافقة: 3 نوفمبر 2015) واتبع المعاهد الوطنية للصحة "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية"⁹ .

1. التحضير قبل التجربة

1. إعداد 500 مل من حل رينجر (يحتوي على: 145 مل NaCl، 2.5 مل كيلوكل، 1.0 مليون متر م غسو 4، 1.0 مليون متر CaCl_2،10.0 مليون متر HEPES، 11 مليون الجلوكوز، درجة الحموضة 7.4) طازجة لكل يوم من التجربة.
2. ملء 200 مل من محلول رينجر في زجاجة رذاذ وتخزينها في الثلاجة 4 درجة مئوية. ملء طبق بيتري (10 سم في القطر) مع حل رينجر وperfuse مع الأكسجين 100٪ عن طريق ربط الأنبوب من اسطوانة الأكسجين إلى حجر الهواء حوض السمك. كانت أطباق بيتري ("تشريح الأطباق") مغلفة في السابق بمركب الاستومر للسماح بإدراج دبابيس أثناء التشريح.
3. إعداد السنانير المعدنية تصاعد. قطع قطعتين من أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ، 0.5 ملم في القطر، إلى الطول المناسب وثني السلك في كلا الطرفين لتشكيل السنانير. ترتيب جميع أدوات تشريح، مقص، خياطة ربط ملقط، مقص صغير مفيد للاستخدام.
   ملاحظة: يجب أن يكون جزء هوك حوالي 3 ملم طويلة. يجب أن يكون السلك الأطول (الذي ينتهي بخطاف) بطول حوالي 5 سم، وينبغي أن يكون السلك الأقصر (الذي ينتهي أيضًا في الخطاف) بطول حوالي 1 سم من أجل احتواء الغرف المخصصة المستخدمة في BioCAT والسماح بمجموعة كافية من الحركة لذراع محول الطاقة.
4. قم بتوصيل جميع المعدات وتشغيله. ويشمل ذلك محول محرك/قوة مدمج، وجهاز تحكم في محول المحرك/القوة، ومحفزتيار ثنائي الطور عالي الطاقة، ونظام اكتح/تحكم في البيانات يتم التحكم فيه بالحاسوب.
   1. قم بتشغيل نظام الحصول على البيانات ومعايرة قبل بدء التجربة¹⁰. باختصار، معايرة القوة عن طريق إضافة مجموعة من الأوزان المعروفة، وتغطي ما يصل إلى 50٪ من القوة القصوى التي تقاس من قبل محول القوة في تطور خطي، على محول القوة وتسجيل التغييرات الجهد الناتج. معايرة طول عن طريق تطبيق مجموعة من الجهد الناتج المعروفة على ذراع رافعة وقياس تغيير طول الذراع.
   2. قم بتوصيل الخراطيم من الكتلة الحرارية على حامل العينة إلى حمام متداول مبرد وقم بتعيين درجة الحرارة للحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة في الغرفة إلى ما بين 10 درجة مئوية و40 درجة مئوية. تحديد هذا تجريبيا في وقت مبكر عن طريق وضع الحمام تعميم لمجموعة من درجات الحرارة وقياس درجة الحرارة في الغرفة مع الحرارية.

2. إعداد العضلات

1. قتل الفأر
   1. قتل الفأر عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بخلع عنق الرحم.
   2. رش الجلد على الطرف الخلفي مع محلول الرينجر الباردة لمنع الشعر من تهب في التحضير. إزالة الجلد عن طريق قطع بعيدا حول الفخذ باستخدام مقص تشريح غرامة وسحب الجلد بسرعة إلى أسفل باستخدام ملقط #5 لفضح العضلات.
   3. قم ببتر الطرف الخلفي ونقله إلى طبق تشريح تم ملئه بحل Ringer المؤكسد، ثم وضعه تحت مجهر تشريح يُحدث منظارًا.
2. تحضير عضلة نعل
   1. ضع يطرف هُنا في طبق التشريح مع العضلات المعدية المعدية التي تواجه الأعلى. قطع الوتر القاصي لمجموعة العضلات الجهاز الهضمي / السولوس ورفع العضلات بلطف وببطء عن طريق قطع اللفافة على جانبي العضلات الجهاز الهضمي باستخدام مقص غرامة. عزل مجموعة العضلات المعدية/اللولبية من الطرف بعد تحرير الوتر القريب من عضلة النعل.
   2. دبوس مجموعة العضلات التي تحتوي على العضلات المعدية والأوتار البعيدة أسفل في طبق تشريح. رفع العضلات soleus بلطف عن طريق الوتر القريب وفصلها عن العضلات المعدية المعدة ترك أكبر قدر من وتر القاصي soleus سليمة قدر الإمكان.
3. إعداد عضلة طول التيكونس (EDL)
   1. ضع يطرف هُنا في طبق التشريح مع العضلات الأمامية التي تواجه الأعلى. قطع اللفافة على طول عضلة الساقية الأمامية (TA) وسحبها واضحة باستخدام ملقط. تحديد وقطع الوتر القاصي للعضلة TA. رفع العضلات TA وقطع بها بعناية دون سحب على العضلات EDL.
   2. قطع فتح الجانب الجانبي من الركبة وفضح الأوتار اثنين. قطع الوتر القريب، وترك أكبر قدر ممكن من الوتر لا يزال تعلق على العضلات، ورفع العضلات EDL (العضلات الوسيطة) عن طريق سحب بلطف الوتر. قطع الوتر القاصي بمجرد أن يتعرض.
4. تركيب العضلات
   1. دبوس أسفل العضلات عن طريق الأوتار، وتقليم جميع الدهون الزائدة، اللفافة والأوتار بعيدا قدر الإمكان. إدراج وتر واحد في عقدة مرتبطة مسبقا وربط خياطة بإحكام مع خياطة ربط ملقط. ربط العقدة الثانية على حول هوك المعدنية.
   2. كرر نفس الإجراء مع هوك طويلة على الطرف الآخر من الوتر. تأكد من أن لا يتم الاتصال بأي من جسم العضلات من قبل الغرز. وهذا سيلحق الضرر بالإعداد.
   3. إرفاق هوك قصيرة إلى الجزء السفلي من الغرفة التجريبية وهوك طويل إلى محول قوة الوضع المزدوج / المحرك. فقاعة الحل في الغرفة التجريبية مع الأكسجين 100٪.
5. تحسين بروتوكولات التحفيز وطول العضلات
   1. تمتد العضلات عن طريق ضبط micromaniators تعلق على محول / المحرك لتوليد التوتر خط الأساس بين 15 إلى 20 mN قبل العثور على أفضل المعلمات التحفيز. تعيين الجهد التحفيز إلى 40 فولت. يتم زيادة التيار التحفيز بشكل منهجي حتى لا يكون هناك زيادة إضافية في قوة نشل. يتم زيادة أعلى التيار وجدت بحوالي 50٪ لضمان التنشيط فوق القصوى.
   2. العثور على الطول الأمثل، L₀، يعرف باسم طول العضلات التي تعطي أقصى قوة نشل، عن طريق زيادة طول العضلات وتفعيل العضلات مع نشل واحد حتى قوة نشطة (قوة الذروة ناقص قوة خط الأساس) يتوقف عن زيادة.
   3. إجراء تقلص الكزاز القصير (1 ق التنشيط) لاختبار تصاعد وتمتد العضلات مرة أخرى إلى قوة خط الأساس الأمثل إذا لزم الأمر. تسجيل طول العضلات في مم مع الفرجار الرقمية.

3. الأشعة السينية الانعراج

ملاحظة: الوصف التالي هو لتجارب الانعراج بالأشعة السينية التي أجريت باستخدام أداة انعراج الأشعة السينية الزاوية الصغيرة على خط الحزمة BioCAT 18ID في مصدر الفوتون المتقدم، مختبر أرغون الوطني ولكن يمكن استخدام أساليب مماثلة على خطوط الحزمة الأخرى مثل ID 02 في ESRF (فرنسا) وBL40XU في SPring8 (اليابان). يتم تشغيل Beamline 18ID في طاقة شعاع الأشعة السينية الثابتة من 12 كيلوفولت (الطول الموجي 0.1033 نانومتر) مع تدفق الحوادث من ~ 10¹³ فوتونفي الثانية في شعاع كامل.

1. اختيار عينة لمسافة كاشف (طول الكاميرا). استخدام طول الكاميرا 1.8 م للتجارب فحص 2.7 نانومتر أكتين وارتفاع ترتيب انعكاسات ميوسين مثل 2.8 نانومتر انعكاسات ميريديونال. استخدام كاميرا 4-6 م لتجارب أخرى، حيث يهتم المرء في المقام الأول بالتفاصيل الدقيقة على خطوط الطول والطبقة
2. تحسين موضع العينة في الحزمة
   1. تحديد موضع الحزمة باستخدام قطعة من الورق الحساس بالأشعة السينية التي تنتج بقعة مظلمة استجابة للأشعة السينية ("حرق"). ثم استخدام مولد الفيديو عبر الشعر لإنشاء الشعر عبر محاذاة مع علامة حرق على الورق أو ببساطة جعل علامة على شاشة الفيديو مع قلم علامة.
   2. استخدم واجهة المستخدم الرسومية التي تم توفيرها من BioCAT إلى موقع العينة لتحريك العضلات ليتم توسيطها على موضع الحزمة. تتأرجح غرفة العينة في ~ 10-20 مم / ث عن طريق تحريك مرحلة العينة من أجل نشر جرعة الأشعة السينية على العضلات أثناء التعرض. مراقبة العينة لأنها تتحرك لتجنب مناطق كبيرة من اللفافة (يحتوي على الكولاجين الذي سوف يلوث أنماط الانعراج) وضمان أن يبقى مضيئة خلال مسار كامل من السفر.
      ملاحظة: والخطوات الدقيقة المطلوبة في الفرعين 3-3 و3-4 لجعل الإعدادات والإجراءات المطلوبة باستخدام واجهة المستخدم الرسومية التي توفرها خطوط الحزمة ستكون محددة في خط الحزمة وكاشف. اسأل موظفي خط الحزمة عن كيفية تنفيذ هذه العمليات.
3. إعداد كاشف CCD (جهاز المقترنة بالشحن) لأنماط عالية الدقة من العضلات في حالات ثابتة محددة (يستريح، أو أثناء الانكماش متساوي القياس)
   1. قم بإعداد وقت التعرض وفترة التعرض في واجهة المستخدم الرسومية إلى برنامج التحكم. التقاط صورة خلفية داكنة قبل اتخاذ التعرض وتكرار هذا الإجراء كل 2 ساعة أو بعد تغيير وقت التعرض لتصحيح أي الانجراف في أجهزة الكشف عن الالكترونيات القراءة.
   2. تخفيف شعاع الأشعة السينية إلى القيمة المطلوبة للتعرض. ثم التقاط صورة. ليس من الممكن التقاط تسلسل من الصور مع هذا الكاشف. كما يحتاج كاشف اتفاقية مكافحة التصحر إلى عدة ثوان ٍ لقراءة صورة فردية.
4. إعداد كاشف صفيف البكسل لتجربة حل الوقت
   1. إعداد عدد الصور ووقت التعرض وفترة التعرض في واجهة المستخدم الرسومية. كاشف صفيف بكسل المستخدمة هنا يحتاج على الأقل 1 مللي ثانية للقراءة. الحد الأقصى لتردد الإطار للكشف عن عد الفوتون هو 500 هرتز. استخدام إشارة إخراج كاشف العد الفوتون للتحكم في مصراع الأشعة السينية.
   2. تخفيف شعاع إلى الكثافة المطلوبة. تسليح كاشف وانتظر الزناد من نظام الحصول على البيانات. مزامنة البيانات الميكانيكية والأشعة السينية عن طريق تشغيلها في نفس الوقت. يتم جمع أنماط الأشعة السينية بشكل مستمر في جميع أنحاء البروتوكول أ مع 1 مللي ثانية وقت التعرض و2 مللي ثانية فترة التعرض.
      ملاحظة: وينبغي تحديد وقت التعرض الدقيق وفترة التعرض على أساس كل حالة على حدة فيما يتعلق بالمعلومات المطلوبة والعمر الملاحظ للعينة في الحزمة. تخفيف الحزمة من أجل استخدام شعاع الأشعة السينية أكثر مما هو مطلوب لتوفير بيانات قابلة للتحليل في فترة التعرض المختارة.

4. علاج العضلات بعد التجربة

1. استعادة ووزن العضلات بعد كل تجربة الميكانيكية والأشعة السينية. حساب المنطقة المقطعية للعضلة باستخدام طول العضلات المقاسة وكتلة العضلات¹¹ على افتراض كثافة العضلات من 1.06 غرام / مل¹².
2. تمتد العضلات إلى الطول التجريبي وإصلاح العضلات في 10٪ فورمالين لمدة 10 دقيقة. فصل العضلات الثابتة إلى سلسلة من حزم الألياف المختارة من المواقع في جميع أنحاء كامل العضلات المقطع العرضي³.
3. قياس طول sarcomere باستخدام نظام قياس طول sarcomere الفيديو.

تقلص الكزاز متساوي القياس. أي نوع من التجارب الميكانيكية العضلات الكلاسيكية، مثل تقلصات متساوي القياس أو متساوي التوتر، يمكن أن يؤديها مع اكتساب في وقت واحد من أنماط الأشعة السينية. الشكل 1 A يظهر الإعداد التجريبي للتجارب الميكانيكية والأشعة السينية. ويرد في الشكل 1باءأثر قوة مثال لتقلص الكزاز متساوي القياس. عقدت العضلات في يستريح لمدة 0.5 s قبل تفعيلها لمدة 1 s. يتوقف التسجيل الميكانيكي 1 s بعد التحفيز. تم جمع أنماط الأشعة السينية بشكل مستمر في جميع أنحاء البروتوكول في وقت التعرض 1 مللي ثانية في 500 هرتز.

أنماط انعراج الأشعة السينية. يمكن لنمط انعراج الأشعة السينية للعضلات أن يعطي معلومات هيكلية عن دقة النانومتر من الهياكل الموجودة داخل الساركومر. تتكون أنماط انعراج الأشعة السينية العضلية من أربعة أرباع مكافئة مقسومة على خط الاستواء وخط الطول. وينشأ النمط الاستوائي من التعبئة الخيوط العضلية داخل السركومر عمودي على محور الألياف، في حين أن الأنماط الميرية تقرير المعلومات الهيكلية من خيوط العضلات على طول محور العضلات. وتسمى الانعكاسات المتبقية ليست على خط الاستواء أو خط الطول خطوط الطبقة. خطوط طبقة (على سبيل المثال، ملامح المسمى MLL4 و ALL6 في الشكل 2A)تنشأ من الترتيب شبه حلزوني من الوحدات الفرعية الجزيئية داخل myosin التي تحتوي على خيوط سميكة والأكتين التي تحتوي على خيوط رقيقة. خطوط الطبقة المستندة إلى myosin قوية وحادة في أنماط من العضلات يستريح (الشكل 2A)، في حين خطوط طبقة المستندة إلى الأكتين هي أكثر بروزا في أنماط من العضلات المتعاقدة (الشكل 2B). أنماط الفرق التي تم الحصول عليها عن طريق طرح نمط يستريح من نمط التعاقد (الشكل2C)يمكن تسليط الضوء على التغيرات الهيكلية أثناء تطوير القوة في العضلات صحية ومريضة. باتباع هذه التغيرات الهيكلية على مقياس الوقت الملي ثانية من الأحداث الجزيئية أثناء تقلص العضلات، وأنماط الانعراج بالأشعة السينية يمكن أن تكشف عن معلومات هيكلية كبيرة (الشكل2D).

تحليل البيانات باستخدام MuscleX. وفيما يلي مثال على تحليل الانعكاسات الاستوائية باستخدام روتين "خطالاستواء" في حزمة MuscleX (الشكل 3). MuscleX هو حزمة برامج تحليل مفتوحة المصدر تم تطويرها في BioCAT13. نسبة الكثافة الاستوائية (I1,1/I1,0)هي مؤشر على قرب الموسين من الأكتين في العضلات يستريح (الشكل3A)، في حين أنها ترتبط ارتباطا وثيقا بعدد الجسور المتقاطعة المرفقة في التعاقد ( الشكل 3B)مورين العضلات والهيكل العظمي2. نسبة الكثافة, أنا1,1/I1,0, حوالي 0.47 في العضلات يستريح وحوالي 1.2 في تقلص العضلات. المسافة بين انعكاس 1,0 اثنين (2 * S1,0) يرتبط عكسيا إلى تباعد بين خيوط. الوثائق التفصيلية وكتيبات MuscleX متاحة على الانترنت13.

الشكل 1 إعداد التجارب الميكانيكية والأشعة السينية والبروتوكول. (أ) يتم تركيب العضلات على نهاية واحدة إلى هوك داخل الغرفة التجريبية والطرف الآخر إلى محرك مزدوج وضع / قوة محول. هو أمسكت بين اثنان [كبتون] فيلم نافذات أن يسمح ال [إكس-ريس] أن يمرّ كلّيّا. تمتلئ الغرفة مع حل رينجر مع الأكسجين 100٪ طوال التجربة. (ب) البروتوكول الميكانيكي لتجارب الأشعة السينية على العضلات أثناء تقلص الكزاز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 أنماط انعراج الأشعة السينية EDL. EDL العضلات نمط الانعراج بالأشعة السينية من يستريح (أ) والتعاقد (B) العضلات. (ج) نمط الفرق بين نمط الراحة والتعاقد. المنطقة الزرقاء تشير إلى كثافة عالية في نمط الراحة، في حين أن المنطقة الصفراء تمثل كثافة عالية في نمط التعاقد. (D) نمط انعراج الأشعة السينية من التعرض 1 مللي ثانية مع عضلة EDL. MLL1 = أول خط طبقة myosin من الدرجة الأولى; MLL4 = خط طبقة myosin من أجل رابع; ALL1 = خط طبقة أكتين من الدرجة الأولى ALL6 = خط طبقة أكتين من الدرجة السادسة؛ ALL7 = خط طبقة أكتين الترتيب السابع; Tm = انعكاس تروبوموسين (المشار إليه من قبل مربع أبيض)؛ M3 = انعكاس meridional من الدرجة الثالثة؛ M6 = انعكاس meridional النظام السادس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 تحليل البيانات من الأنماط الاستوائية باستخدام MuscleX. وطرحت الخلفية لمحة عن نسبة الكثافة الاستوائية (في حين أن المنطقة) والطلبات الخمسة الأولى (الخطوط الخضراء) كانت مناسبة لحساب كثافة كل ذروة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.