Method Article

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

DOI:

10.3791/59576

⸱

April 27th, 2019

 ,  ,  , 
1Integrated Science Center, Biology Department, College of William & Mary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السومو هو البروتين المعدل الأساسي والمحفوظ بشكل كبير والصغير الحجم. في هذا البروتوكول ، نقوم بوصف استخدام بروتين التراكب السومو الذي يتسامح مع الإجهاد (kmUTAG) لتصور الاصليه ، وغير الموسومة السومو الاقتران وتوطينها في مجموعه متنوعة من أنواع الخلايا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم طريقه جديده لدراسة البروتينات وتوطينها شبه الخلوي في خلايا الثدييات والبويضات الخيطية. هذا الأسلوب يستخدم المؤتلف تعديل السومو-محاصره جزء من البروتين, kmUTAG, المستمدة من الانزيم البروتيني Ulp1 السومو من الخميرة الناشئة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس. لقد قمنا بتكييف خصائص kmUTAG لغرض دراسة sumoylation في مجموعه متنوعة من النظم النموذجية دون استخدام الأجسام المضادة. لدراسة السومو ، KmUTAG لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع النهج المستندة إلى الأجسام المضادة. يتم إنتاج هذا الكاشف المتسامح مع الإجهاد السومو ريكومبينانتلي ، فانه يعترف ايسواشكال السومو الأصلي من العديد من الأنواع ، وعلي عكس الأجسام المضادة المتاحة تجاريا فانه يظهر انخفاض تقارب لحره ، السومو غير مترافق. وتشمل النتائج التمثيلية المبينة هنا توطين الاقترانات السومو في خلايا ثقافة الانسجه الثديية والبويضات الخيطية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والغرض من هذا الأسلوب هو تسهيل دراسة وتحليل البروتينات المترافقة السومو باستخدام المؤتلف السومو التراكب UTAG (Ulp علامةالمجال) البروتين. كما هو مفصل أدناه ، يمكن استخدام UTAG بدلا من الكواشف الأخرى والنهج لتنقيه وكشف وتصور البروتينات المعدلة السومو. اعتمادا علي ظروف النمو ، قد تحتوي الخلايا علي مئات أو آلاف البروتينات التي يتم تعديلها باستخدام سلاسل السومو أو السومو (للمراجعة انظر Kerscher et al. 20061 و kerscher 20162). وهذا يمثل صعوبة كبيره بالنسبة للتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو محدده, خصوصا ان جزءا فقط من هدف sumoylation معينه هو في الواقع تعديل3. بالاضافه إلى أدوارهم في العمليات الخلوية الاساسيه مثل التنظيم العابر ، توازن البروتين ، والاستجابة للإجهاد الخلوي ، وأعاده عرض الكروماتين اثناء الانقسام والانقسام العصبي ؛ أصبح من الواضح الآن بما فيه الكفاية ان السومو ، السومو-البروتينات المعدلة ، ومكونات مسار السومو أيضا لديها إمكانات كما المؤشرات الحيوية للامراض مثل السرطان واضطرابات الأعصاب4،5،6 ،7. وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قويه وموثوقه ومتاحه بسهوله ونهج مبتكره للكشف والتحليل الوظيفي للبروتينات المعدلة السومو في مجموعه متنوعة من الخلايا والعينات.

في العديد من الانظمه ، الأجسام المضادة الخاصة السومو هي الكواشف المفضلة للكشف والعزل والتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو8،9. ومع ذلك ، فان بعض الأجسام المضادة الخاصة بالسومو المتاحة تجاريا باهظه التكلفة ، ومحدوده الكمية أو التوافر ، وعرضه لإظهار التقارب المتغير بشكل عشوائي والتفاعل التبادلي ، وفي بعض الحالات تنقص استنساخ10. ويتمثل أحد النهج البديلة في التعبير عن العلامات التي تم الوسم بها في الخلايا المتحولة والكائنات الحية ، ولكن ربط علامات المربه إلى السومو قد يخفض بشكل مصطنع اقترانه بأهداف البروتين11. بالاضافه إلى ذلك ، لا تكون المربية مفيده عند تقييم الخلايا أو الانسجه غير المحولة.

Ulp1 هو الانزيم البروتيني السومو المحفوظة من s. سيريفيسياي ان كلا العمليات السلائف السومو و desumoylates السومو البروتينات مترافق12. قمنا بتطوير كاشف UTAG استنادا إلى الملاحظة صدفه ان طفرة من السيستين الحفاز (C580S) في Ulp1's السومو معالجه Ulp domain (UD) لا يمنع فقط السومو الانقسام ولكن أيضا الفخاخ السومو-البروتينات مترافق مع ارتفاع الغرائب12. للبساطة ، أشرنا إلى هذه القطعة الطرفية Ulp1 (C580S) الخاصة بالجهاز الذي يشبه الكربوكسي باسم UTAG (اختصار ل UD TAG). UTAG هو بروتين التراكب عموم السومو التي تمثل بديلا مفيدا لمكافحه السومو الأجسام المضادة المستخدمة للعزل والكشف عن البروتينات المعدلة السومو. الأهم من ذلك ، فانه يعترف علي وجه التحديد-مطوية أصلا ، السومو مترافق وليس فقط واحد أو عده المردة علي السومو. لتحسين كل من الاستقرار البروتين و السومو قوه ملزمه من UTAG ، ونحن ولدت البديل من UTAG من الخميرة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس (كم). KmUTAG باحكام يربط السومو-الاقتران مع نانومولار تقارب13. بالاضافه إلى ذلك ، kmUTAG مقاومه لدرجات الحرارة المرتفعة (42 درجه مئوية) ، والحد من العوامل (5 مم TCEP-تريس (2-كربوكسيايثيل) هيدروكلوريد فوسفونين) ، المسخ (ما يصل إلى 2 م اليوريا) ، والعوامل المؤكسدة (0.6 ٪ بيروكسيد الهيدروجين) ، والمنظفات غير الايونيه. هذا التحمل الإجهاد مفيد خلال حاله تنقيه قاسيه وأوقات الحضانة لفترات طويلة ، وضمان الاستقرار والنشاط السومو المحاصرة. ومع ذلك ، ليس من المستغرب ان يكون نشاط KmUTAG لمحاصره السومو غير متوافق مع الكواشف المعدلة من السيستين والمنظفات الايونيه ومستخلصات البروتين المشوهة تماما. التقارب الملحوظ وخصائص KmUTAG تشير إلى ان هذا الكاشف قد تصبح جزءا من المرجع القياسي لدراسة البروتينات sumoylated في أنواع متعددة.

هنا نقدم طريقه بسيطه للكشف عن البروتينات المعدلة السومو في الخلايا الثديية والديدان الخيطية باستخدام بروتين الانصهار الفلورية mCherry-كموتاغ المؤتلف (kmUTAG-fl).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الكشف عن السومو في خلايا الانسجه الثابتة الثقافة باستخدام المؤتلف KmUTAG-FL السومو البروتين الملائمة

  1. تنمو الخلايا ثقافة الانسجه المفضلة علي 22 مم الغطاء المستدير ينزلق في لوحات TC 6-حسنا حتى 70 ٪-80 ٪ متموج. قم بتنفيذ الخطوات 1.2 – 1.8 في اللوحة 6 جيدا.
  2. تغسل الخلايا لفتره وجيزة مع 1 مل من DPBS (المالحة دولبيكو الفوسفات مخزنه)
  3. للتثبيت ، واعداد حل جديد من 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) حل (المخفف في DPBS). لإصلاح الخلايا ، أضافه 2 مل 4 ٪ PFA في DPBS لكل بئر. احتضان الخلايا لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. ملاحظه: يجب اجراء كافة الخطوات باستخدام PFA في غطاء أمان المختبر ويجب التخلص من PFA بشكل صحيح.
  4. غسل الخلايا الثابتة 3x في 1 مل DPBS في حين البندق لوحه ، 5 دقيقه كل غسل.
  5. لتتخلل الخلايا ، احتضان لمده 15 دقيقه مع 0.1 ٪ تريتون X-100 في DPBS
  6. غسل الخلايا 3x في 1 مل DPBS في حين البندق لوحه ، 5 دقيقه كل غسل
  7. احتضان الخلايا مع 500 μL من 0.1 M الجليسين-HCL (pH 2.0) لمده 10 ثانيه ، ثم تحييد الأس الهيدروجيني علي الفور مع 500 μL من 10x سومو العازلة البروتياز (SPB).
  8. غسل الخلايا 3x في 1 مل DPBS في حين لوحه البندق ، 5 دقيقه كل غسل
  9. أزاله الشفتين من البئر ووضعها في غرفه الرطوبة. ثم المضي قدما في احتضان علي كوفيرسليب علي النحو التالي:
    1. ل UTAG-fl تلطيخ فقط: مزيج 1 ميكروغرام UTAG-fl مع 100 μL من 1x SPB التي تحتوي علي 5 مم TCEP في أنبوب ، ماصه المزيج علي الخلايا علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة في غرفه الرطوبة.
    2. اختياريا ، ل UTAG-FL ومكافحه SUMO1 الأجسام المضادة المشترك تلوين ، والمضي قدما في ما يلي:
      1. مزيج في أنبوب 1 ميكروغرام UTAG-FL و 0.5 μL SUMO2/3 8A2 (تم الحصول عليها للدراسات التنموية الهجين البنك9) مع 100 μl من حجب العازلة ، ماصه المزيج علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
      2. يغسل الخلايا علي الشفة 3 مرات مع 200 μL DPBS ، 5 دقيقه كل غسل.
      3. مزيج في أنبوب 0.5 μL مكافحه الماوس اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة مترافق مع 100 μL حجب العازلة ، ماصه المزيج علي coverslip ، واحتضان في درجه حرارة الغرفة لمده 1 ساعة.
  10. لغسل الشفتين ، ماصه 200 μL DPBS علي كل coverslips ويترك في مكان لمده 10 دقيقه. كرر الغسيل 2 مره أخرى.
  11. أزاله كوفيرسليب من غسل الماضي وعكس ذلك علي شريحة المجهر التي تم تنظيفها مسبقا مع قطره من المتوسطة المتصاعدة (انظر جدول المواد).
  12. يخزن بين عشيه وضحيها في الفريزر-20 درجه مئوية قبل العرض تحت المجهر. تصور باستخدام مجموعات مرشح المناسبة ل DAPI (DNA) ، تكساس الحمراء (kmUTAG-fl) ، و اليكسا فلور 488 (إذا تم تنفيذ اختياري SUMO2/3 المشتركة تلطيخ).

2. الكشف عن السومو في الغدد الخيطية الثابتة باستخدام UTAG-fl

  1. نقل خنثى الكبار إلى قطره 8 μL من البيض العازلة14 علي شريحة زائد المشحونة التي تم المغلفة مع بولي-L-يسين. الإفراج عن الغدد التناسلية من الديدان باستخدام 27.5 G الابر. المضي قدما اما وسم الأجسام المضادة أو UTAG-fl وضع العلامات.
  2. للحصول علي عينات وسم الأجسام المضادة ، المضي قدما علي النحو التالي:
    1. تجميد العينات الكراك في النيتروجين السائل ومن ثم إصلاح بين عشيه وضحيها في-20 درجه مئوية الميثانول في جره Coplin.
    2. أيضا في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 3 مرات في 1x تلفزيوني ، ثم كتله لمده 20 دقيقه في التلفزيونية التي تحتوي علي 0.5 ٪ بوسني و 0.1 ٪ توين 20.
    3. أضافه 30 μL من مكافحه السومو 6F2 الأجسام المضادة (1:10) لكل شريحة تغطي العينات. احتضان بين عشيه وضحيها في غرفه الرطوبة في 4 درجه مئوية.
      ملاحظه: تم الحصول علي سومو 6F2 من الدراسات التنموية الهجين البنك15.
    4. في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 2 دقيقه في 1x تلفزيوني ، ثم تغطيه واحتضان العينات مع 30 μL من DyLight 488 الأجسام المضادة الماوس الثانوية الماعز مكافحه (1:200) لمده 1.5 ساعة في غرفه الرطوبة في درجه حرارة القاعة.
    5. في الجرار Coplin ، وغسل الشرائح لمده 2 دقيقه في 1x تلفزيوني ، واجراء تراجع سريع في dH20 ، ومن ثم تحميل الشرائح مع تصاعد المتوسطة (انظر جدول المواد).
  3. ل KmUTAG-fl وضع العلامات ، والمضي قدما في ما يلي:
    1. لإصلاح الخلايا ، أضافه 1 حجم من 8 ٪ PF إلى عينات للتركيز النهائي من 4 ٪ PF. إصلاح لمده 10 دقيقه في غرفه الرطوبة ومن ثم إخماد رد الفعل عن طريق نقل الشرائح إلى جره Coplin تحتوي علي 1x التلفزيونية مع 0.1 M الجليسين لمده لا تقل عن 5 دقيقه.
    2. في الجرار Coplin ، وغسل الخلايا لمده 5 دقائق في 1x تلفزيوني ، ثم يتخلل العينات في 1x التلفزيونية التي تحتوي علي 0.1 ٪ تريتون-X لمده 10 دقيقه.
    3. يغسل في جره Coplin علي الأقل 5 دقيقه في 1x تلفزيوني ، ثم أضافه 200 μL من 0.1 M غليسين-HCl (pH = 2.0) إلى العينات علي الشريحة لمده 10 ثانيه. فورا أضافه 200 μL من SPB 10x لتحييد الأس الهيدروجيني.
    4. غسل الشريحة في 1x التلفزيونية في جره Coplin لمده 5 دقائق.
    5. أزاله الشريحة من غسل وماصه 100 μL من 1x SPB + 5mM TCEP التي تحتوي علي 2 ميكروغرام من UTAG-fl إلى الديدان الخيطية علي الشرائح ، واحتضان في غرفه الرطوبة ل 1 h دون هزاز.
    6. أعاده الشريحة إلى جره Coplin ويغسل لمده 15 دقيقه في 1x تلفزيوني
    7. أزاله الشريحة من الغسيل ، واستخدام مسح المختبر لتجف حول العينة ، ومن ثم تحميل الشرائح مع 5 μL من المتوسطة المتصاعدة (انظر جدول المواد). تخزين الشرائح في 4 درجه مئوية. تصور باستخدام مجموعات التصفية المناسبة ل DAPI (DNA) ، تكساس الحمراء (kmUTAG-fl) ، و DyLight 488 (SUMO2/3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KmUTAG-fl هو المؤتلف ، mCherry الموسومة البروتين السومو المحاصرة. لإنتاج kmUTAG-fl ، ونحن المستنسخة codon الأمثل مككرز-kmUTAG في pSPOT1 التعبير الفوقي البكتيري (الشكل 1). بعد الاستقراء ، تم تنقيه بروتين kmUTAG-fl علي بقعه فخ ، والتملص ، والمجمدة حتى مزيد من الاستخدام. لضمان النشاط السومو-المحاصرة من KmUTAG-fl ، أكدنا ملزمه لSUMO1-الخرز مترافق وهطول الامطار من البروتين الانصهار السومو-CAT (البيانات لم تظهر ، ولكن انظر العمل السابق13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم استخدام kmUTAG-fl ، بروتين المؤتلف ، للدراسات الوظيفية من السومو في خلايا الثدييات الثابتة وتشريح الغدد الديدان الخيطية. KmUTAG-fl هو كاشف خاص بعموم السومو متسامح مع الإجهاد يتعرف علي البروتينات الاصليه المترافقة مع السومو وسلاسل السومو ويوقعها. وبما ان الهيكل الثالث لشركه السومو مصان بشكل كبير ، فمن المحتمل جدا ان يتم تحليل أنواع السومو من النماذج الاضافيه والانظمه غير النموذجية باستخدام كاشف kmUTAG-fl. وعلي هذا النحو ، قد تمثل KmUTAG-fl كاشفا بديلا أو ثانويا مفيدا لبروتوكولات تلطيخ الأجسام المضادة التقليدية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير الكواشف kmUTAG المؤتلف لمجتمع البحوث عبر Kerafast.com.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود ان نشكر جميع أعضاء مختبر كيرشر علي دعمهم ، ناتالي نغوين للقراءة النقدية للمخطوطة ، وليديا سيب للتسلسل. وقد دعم هذا العمل صندوق الكومنولث لتسويق البحوث MF16-034-LS إلى OK. وقدم الدعم البحثي لطلاب W & M من قبل صندوق بحوث بيلي-هوستون ، ومركز تشارلز يكرم زمالات لري و CH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16٪ محلول مائي بارافورمالدهيد (الفورمالديهايد)علوم المجهر الإلكتروني30525-89-4
ألواح زراعة الخلايا ذات 6 آبارجينيسي العلمية / أوليمبوس بلاستيك25-105
أليكسا فلور 488 AffiniPure Goat المضاد للفأر IgG (H + L) JacksonImmunoResearch115-545-003يستخدم كجسم مضاد ثانوي للجسم المضاد أحادي النسيلة
DPBS ، بدون كالسيوم ، لا المغنيسيومفيشر ScientificGibco 14190144
Dylight 488 المترافق AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch115-485-146يستخدم كجسم مضاد ثانوي للجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر
Fisherbrand Coverglass لنظارات غطاء النموFisherbrand12545101
FLUORO-GEL II مععلوم المجهر الإلكترونيDAPI 50-246-93)تركيب الوسائط في الخطوة 1.11
FLUORO-GEL مع DABCOElectron Microscopy Sciences17985-02مع إضافة DAPI إلى 1 & micro ؛ جم / مل ؛ وسائط التركيب في الخطوة 2.2.5
Glycine-HClFisher BioRecodesBP3815
Glycine-HClACROS Organics6000-43-7
KmUTAG-flKerafastKmUTAG متوفرة على Kerafast.com
المخزن المؤقت للحجب Oneblock Western-CLPrometheus20-313
PBS ، محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، 10X SolutionFisher الكواشف الحيويةBP3994
PNT2 خط الخلاياسيجما ألدريتش95012613ظهارة البروستاتا الطبيعية الخليدة مع SV40.
تم إيداع pSPOT1(ChromoTek GmbH)ev-1https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf
SUMO 6F2DSHBSUMO 6F2 SUMO6F2 في DSHB بواسطة Pelisch، F. / Hay، R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)
SUMO protease buffer [10x]500 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 2٪ NP-40 ، 1.5 M كلوريد الصوديوم
SUMO-2 الأجسام المضادة 8A2DSHBSUMO-2 8A2تم إيداع SUMO-2 8A2 في DSHB بواسطة Matunis، M. (منتج DSHB Hybridoma SUMO-2 8A2)
TCEP-HCLGoldBio51805-45-9يستخدم كعامل اختزال بتركيز 5 ملي مولار
Triton X-100Fisher BioReagents9002-93-1يستخدم للنفاذية بنسبة 0.1٪ في DPBS / PBS (للديدان)
كواشف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
  2. Kerscher, O. SUMOylation. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-11 (2016).
  3. Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
  4. Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
  5. Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
  6. Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
  7. Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477(2017).
  8. Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
  9. Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
  10. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
  11. Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
  12. Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
  13. Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391(2018).
  14. Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
  15. Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769(2014).
  16. Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
  17. Ruckman, J., et al. 2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
  18. Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005(2017).
  19. Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572(2018).
  20. Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
  21. Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SUMO trapping ProteinFluorescent UTAGSUMO DetectionMammalian CellsNematode OocytesAntibody free MethodSUMO ConjugatesNuclear LocalizationParaformaldehyde FixationMicroscopy Visualization

Related Articles