تحليل مقياس التدفق لأنواع الأكسجين التفاعلي الميتوكوندريا في الجذعية المكونة للدم وخلايا البروجينوتريو وابيضاض الدم المدفوع MLL-AF9

أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي جزيئات تفاعلية عالية مشتقة من الأكسجين الجزيئي. الموقع الخلوي الأكثر تحديدا من إنتاج ROS هو الميتوكوندريا، حيث يتم امتصاص الإلكترونات التي تمر عبر سلسلة نقل الإلكترون (ETC) أثناء الفسفورية التأكسدية (OXPHOS) عن طريق الأكسجين الجزيئي مما يؤدي إلى تشكيل محددة نوع من ROS يسمى الأكاسيد الفائقة^1. من خلال إجراءات سلسلة من الإنزيمات، تسمى ديسموتاسيس فوق أكسيد أو SODs، يتم تحويل الأكاسيد الفوقية إلى بيروكسيد الهيدروجين، والتي يتم تحييدها في وقت لاحق في الماء بواسطة إنزيمات مثل الكاتالاز أو الجلوتاثيون بيروكسيداسيس (GPX). يمكن أن تؤدي الاضطرابات في آليات تنظيم ROS إلى الإنتاج الزائد من ROS، والتي غالباً ما يشار إليها باسم الإجهاد التأكسدي، والتي لها عواقب خلوية ضارة وقاتلة مثل تلف جزيء الماكرو (أي الحمض النووي والبروتين والدهون). وعلاوة على ذلك، يرتبط الإجهاد التأكسدي إلى العديد من الأمراض، مثل مرض السكري والأمراض الالتهابية والشيخوخة والأورام^2،3،4. للحفاظ على التوازن الأكسدة ومنع الإجهاد التأكسدي، والخلايا تمتلك مجموعة متنوعة من آليات تنظيم ROS^5.

المستويات الفسيولوجية لبعض ROS ضرورية للسلّم الأوّل والبالغين 6^. ومع ذلك، يرتبط ROS الزائدة مع تلف الحمض النووي، والتمايز الخلوي واستنفاد الجذعية المكونة للدم وتجمع السلف. وهناك أيضا أدلة على أن التعديلات في علم الأحياء الأكسدة قد تختلف بين سرطان الدم والخلايا السليمة. على سبيل المثال، مستويات ROS تميل إلى أن تكون أعلى في خلايا ابيضاض الدم النقوي الحاد (AML) نسبة إلى نظرائهم الأصحاء ودراسات أخرى قد اقترحت أن الخلايا الجذعية سرطان الدم الحفاظ على مستوى ثابت منخفض من ROS للبقاء على قيد الحياة^7،8. الأهم من ذلك، وقد أظهرت استراتيجيات للاستفادة العلاجية على هذه الاختلافات الأكسدة الوعد في العديد من إعدادات السرطان البشري^9،10. لذلك، فإن الاختبارات التي تسمح بتقييم مستويات ROS في نماذج الماوس قد تحسن فهمنا لكيفية مساهمة هذه الأنواع في علم وظائف الأعضاء الخلوية ومسببات الأمراض، فضلا عن إمكانية توفير منصة لتقييم فعالية العلاجات الجديدة التي تستهدف السرطان.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) في مركز فوكس تشيس للسرطان.

ملاحظة: وينقسم سير عمل البروتوكول إلى 4 أجزاء كما هو موضح في الشكل 1 ويتم سرد الكواشف المطلوبة في جدول المواد.

1. نخاع العظام (BM) العزلة

ملاحظة: تم إنشاء MLL-AF9 الفئران سرطان الدم كما هو موضح سابقا¹¹.

1. استعادة خلايا نخاع العظام أحادية النووية، كما هو موضح سابقا^{12،13،14،15}، من نوع البرية C57.Bl6 الفئران (التي تعبر عن CD45.2 علامة congenic) وكذلك من C57. الفئران Bl6-SJL (التي تعبر عن علامة CD45.1 congenic) التي تم زرعها مع خلايا سرطان الدم MLL-AF9 التعبير (CD45.2^{+ ).}
   ملاحظة: BM يمكن استردادها من الفئران إما عن طريق سحق^12،13 أو عن طريق مسح العظام^14،15. للتجارب المعروضة هنا، تم استرداد BM من كل من الفئران صحية وسرطان الدم عن طريق التنظيف.

2. الميتوكوندريا ROS الفلورة صبغ تلطيخ

1. مرة واحدة وقد تم استرداد خلايا نخاع العظام أحادية النووية من الفئران صحية و / أو سرطان الدم، وصمة عار aliquot من الخلايا مع الأزرق تريبان وحساب باستخدام مقياس الهيموكيتوميلتحديد عدد البداية من مجموع خلايا BM.
2. طرد مركزي الخلايا في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
3. Aliquot 200 درجة مئوية من تعليق الخلية لكل أنبوب في 9 أنابيب التحكم لون واحد المسمى على النحو التالي:
   لا وصمة عار، B220-Cy5-PE، cKit-Cy7-APC، Sca1-PacBlue، CD150-APC (لHSPCs صحية فقط)، CD45.2-APC (لخلايا سرطان الدم فقط)، CD34-FITC، الميتوكوندريا ROS صبغ ولايف / ميت وصمة عار الخلية.
   ملاحظة: (اختياري) يمكن إعداد مراقبة إيجابية لتحريض ROS الميتوكوندريا عن طريق علاج 2 × 10⁵ خلايا في 200 ميكرولتر مع 20 ميكرومتر من ميناديون الصوديوم Bisulfite (MSB) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪. ويمكن إعداد عنصر تحكم ثان لعكس الحث بوساطة MSB من ROS الميتوكوندريا عن طريق علاج 2 × 10⁵ خلايا في 200 ميكرولتر مع 20 ميكرومتر من MSB بالإضافة إلى 100 μM N-acetyl-L-cysteine (NAC) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ 5٪.
4. Aliquot الخلايا المتبقية في أنبوب (أنبوب تجريبي) والطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
5. إعادة تعليق الخلايا في F-PBS مع وصمة عار خلية حية / ميتة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. الحضانة على الجليد لمدة 30 دقيقة تأكد من إضافة وصمة عار حية / ميتة إلى أنبوب التحكم لون واحد.
6. إضافة 1.0 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) F-PBS إلى كل من لون واحد وأنابيب تجريبية ملطخة بالصبغة الحية / الميتة. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
7. إعادة تعليق 50 ميكروغرام من صبغة ROS الميتوكوندريا في 13 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO) للحصول على محلول مخزون 5 mM.
8. تخفيف صبغة ROS الميتوكوندريا إلى تركيز نهائي من 5 μM في RT F-PBS مع أو بدون فيراباميل (50 درجة مئوية).
9. يستنشق قبالة غسل وصمة عار الخلية الحية / الميتة. إضافة 200 درجة مئوية من صبغة الميتوكوندريا ROS وصمة عار تحتوي على فيراباميل إلى كل أنبوب تجريبي، فضلا عن الميتوكوندريا ROS صبغ أنبوب التحكم لون واحد.
10. دوامة لخلط وحضانة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية في الظلام.
11. إضافة 1.0 مل من RT F-PBS إلى الميتوكوندريا ROS ملطخة التحكم لون واحد والأنابيب التجريبية. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
12. يستنشق قبالة supernatant وغسل الخلايا مع 1.0 مل إضافية من RT F-PBS. الطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.

3. النسب الأجسام المضادة تلطيخ

1. إعداد كوكتيلات الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1.
   ملاحظة: وقد تم تحسين هذه الكوكتيلات الأجسام المضادة سابقا^14،15،16.
2. يستنشق supernatant من الميتوكوندريا النهائي ROS صبغ غسل الأنابيب التجريبية التي تحتوي على BM صحية وإضافة 200 درجة مئوية من كوكتيل الأجسام المضادة #1 إلى كل أنبوب. دوامة للخلط. أيضا إعداد أنابيب التحكم لون واحد. حضانة لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
3. يستنشق supernatant من الميتوكوندريا النهائي ROS صبغ غسل الأنابيب التجريبية التي تحتوي على ابيضاض الدم BM وإضافة 200 درجة مئوية من كوكتيل الأجسام المضادة #2 إلى كل أنبوب. دوامة للخلط. حضانة لمدة 60 دقيقة على الجليد في الظلام.
4. يغسل مع 1.0 مل من الباردة F-PBS والطرد المركزي 5 دقائق في 300 × ز في RT.
5. إعادة تعليق الخلايا في 500 درجة مئوية من F-PBS الباردة وتصفية الخلايا في أنبوب مقياس الخلايا تدفق باستخدام مرشح 40 ميكرومتر لاستبعاد المجاميع.

4. تدفق قياس السيتومتري ة وتحليل

ملاحظة: العديد من المجموعات الفرعية الجذعية المكونة للدم والسلف نادرة، مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل. وهكذا، من الناحية المثالية 3-5 مليون الأحداث ينبغي جمعها لكل أنبوب تجريبي أثناء الحصول على تدفق قياس السيتومتريلتحليل الكافي من ROS الميتوكوندريا في مختلف المجموعات الفرعية HSPC.

1. استخدم أنبوب التحكم بدون وصمة عار لتعيين المؤامرات المبعثرة إلى الأمام (FSC-A) والجانب (SSC-A) استنادًا إلى حجم وتعقيد مجموعة الخلايا التي تم تحليلها.
2. استخدام أنابيب التحكم لا وصمة عار ولون واحد للتعويض عن تدفق مقياس السيتومتر.
3. بوابة من الحطام الدخيل من مؤامرة مبعثر إلى الأمام والجانب(الشكل 2A، B،اللوحة الأولى من اليسار).
4. بوابة خارج doublets باستخدام التمييز المزدوج مثل التمييز إلى الأمام(الشكل 2A، B،اللوحة الثانية من اليسار).
5. اتبع استراتيجية التطفل المقترحة في الشكل 2A،B لتحديد الخلايا الحية ، والخلايا المنخفضة النسب ومختلف HSPC وسرطان الدم الفرعية.
6. لكل مجموعة من السكان من الفائدة، وتحليل متوسط كثافة الفلورة (MFI) من قناة TRPE (محور س) في مؤامرة الرسم البياني لتقييم الاختلافات في إشارة ROS الميتوكوندريا(الشكل 3A-C،لوحات اليسار). يمكن تقييم مستويات ROS الميتوكوندريا على مستوى الخلية الواحدة عن طريق مقارنة تلطيخ ROS الميتوكوندريا مقابل علامات سلالة محددة في مؤامرة مبعثرة.

قدم هو وسيلة لتحليل ROS في الميتوكوندريا من العديد من السكان سرطان الدم صحية وMLL-AF9 التعبير عن. يعرض الشكل 1 طريقة عرض تخطيطية لسير عمل البروتوكول، والذي يتكون من 4 خطوات رئيسية: (1) عزل BM عن الفئران؛ (2) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (3) عزل BM عن الفئران؛ (2) عزل BM عن الفئران؛ 2) تلطيخ خلايا BM مع صبغة فلورية التي تعترف ROS الميتوكوندريا، ولا سيما الأكاسيد الفوقية؛ 3) صورة سطح الجسم المضاد تلطيخ لتحديد مختلف السكان صحية وسرطان الدم المكونة للدم؛ و 4) تدفق السيتومتري ة وتحليلها.

الشكل 2 A,B يصور استراتيجية التطفل ممثل لتحليل مختلف الجذعية المكونة للدم والسكان السلف في الصحة وسرطان الدم BM. يتم تطبيق مؤامرة FSC/SSC للقضاء على الحطام وتستخدم قطعة أرض من FSC-Area (FSC-A) مقابل ارتفاع FSC (FSC-H) لاستبعاد الدوبلات والمجاميع. يتم الجمع بين لوحة من علامات سطح النسب(الجدول 1 والخطوة 3.1) لاستبعاد مجموعة متنوعة من السكان المكونة للدم ناضجة مثل الخلايا الليمفاوية، كريات الدم الحمراء، المحببات والخلايا الأحادية / الضامة (أي نسب منخفضة أو لينمنخفضة). ويشمل كوكتيل النسب أيضا الأجسام المضادة CD48 وبالتالي فإن جميع المجموعات الفرعية من الخلايا المنخفضة النسب هي أيضا CD48-. يستخدم التعبير السطحي للخلية Sca-1 و c-Kit للتمييز بين خليط غير متجانس من HSPCs يسمى CD48- LSKs (Linlow,Sca-1+, c-Kit+, CD48-) من الذرية النخاعية (Linlow, Sca-1- ، ج كيت+، CD48-). لمزيد من التمييز بين مختلف المجموعات الفرعية HSPC، يتم إضافة علامة SLAM، CD150 وكذلك CD3417،18،19،20،21. الشكل 2 B يصور أيضا استراتيجية التغرير ممثل لcKit عالية التعبير عن سرطان الدم الذرية (لينمنخفضة,ج كيتعالية; Sca-1-التي يتم إثراؤها لسرطان الدم بدء الخلايا (LICs)11 وكذلك خلايا سرطان الدم التعبير عن التعبير المتوسط المنخفض من cKit (cKitInt-low).

مقارنة بين الميتوكوندريا ROS تلطيخ بين CD48 صحية- LSK وذرية النخاع يظهر أن الذرية النخاعية عرض مستويات أعلى بكثير من تلطيخ ROS الميتوكوندريا(الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، cKitارتفاع سرطان الدم السلف عرض مستويات أعلى بكثير من الميتوكوندريا ROS تلطيخ بالمقارنة مع CD48- LSK، المتفرعة أو خلايا سرطان الدم منخفضةint كيت(الشكل 3A). كما عرضت خلايا سرطان الدم CKitInt منخفضة أعلى بكثير الميتوكوندريا ROS تلطيخ بالمقارنة مع CD48- خلايا LSK ولكن ليس إلى الذرية النخاعية(الشكل 3A). LSKs أخرى فرعية مقسمة بواسطة CD150 التعبير أظهرت أن تلطيخ ROS الميتوكوندريا لم تختلف اختلافا كبيرا في CD48- خلايا LSK مقسمة من قبل CD150 عالية (CD150عالية)،وسيطة (CD150كثافة في ذلك)أو لا (CD150Neg) (الشكل3باء). ومع ذلك، تم العثور على ثابت الدولة الميتوكوندريا ROS تلطيخ خلايا سرطان الدمcKit عالية أو cKitInT منخفضة لتكون أعلى بكثير من CD48- LSKs-CD150عالية،-CD150كثافة في المائة أو -CD150 خلاياالنق ( الشكل 3باء). يتم إثراء خلايا LSK التي تعبر عن مستويات منخفضة أو معدومة من CD34 لإعادة تشكيل الخلايا الجذعية المكونة للدم على المدى الطويل، ولا سيما خلايا CD48- LSK التي هي CD34- وCD150عالية20،21. ومع ذلك، تقسيم CD48- خلايا LSK بواسطة CD150 وCD34 التعبير لم تكشف عن أي اختلافات كبيرة في تلطيخ ROS الميتوكوندريا بين هذه المجموعات الفرعية HSPC الست(الشكل 3C).

الشكل 1 تمثيل تخطيطي لتدفق العمل للبروتوكول. الخطوة 1) عزل BM من الفئران اللوكيمية الصحية وMLL-AF9؛ الخطوة 2) تلطيخ الخلوية باستخدام صبغة ROS الميتوكوندريا (mROS)؛ الخطوة 3) تلطيخ الخلايا مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة المرتبطة بفلوروكروم للتمييز الجذعية المكونة للدم وخلايا السلف (HSPCs) في الفئران السليمة واللوكيميا؛ الخطوة 4) تدفق السيتومترية وتحليل ROS الميتوكوندريا في العديد من السكان HSPC. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 استراتيجيات قياس التدفق للخلايا لخلايا نخاع العظم الصحية وMLL-AF9.express. (A)كانت خلايا BM معزولة عن الفئران السليمة ملطخة بصبغة حية / ميتة (QDot)، صبغ ة ROS الميتوكوندريا (TRPE). تم تلوين BM من الفئران السليمة في وقت لاحق مع الأجسام المضادة التي تعترف علامات النسب بالإضافة إلى CD48 (Cy5-PE)، ج كيت (Cy7-APC)، Sca1 (PacBlue)، CD34 (FITC)، CD150 (APC). (ب)بالإضافة إلى الخلايا الحية / الميتة والبقع ROS الميتوكوندريا، كانت ملطخة BM من الفئران سرطان الدم أيضا مع الأجسام المضادة التي تعترف علامات النسب بالإضافة إلى CD48 (Cy5-PE)، ج كيت (Cy7-APC)، Sca1 (PacBlue) وCD45.2 (APC)، والتي يتم تطبيقها على التمييز بين خلايا ابيضاض الدم MLL-AF9 من خلايا BM المتلقي السليم (CD45.1). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 مستويات ROS الميتوكوندريا في نخاع العظام صحية وMLL-AF9. اللوحات اليسرى هي الرسوم البيانية التمثيلية لمستويات ROS الميتوكوندريا من السكان المشار إليها واللوحات اليمنى ذات الصلة تمثل تحليلات الرسم البياني شريطي من MFI من ROS الميتوكوندريا للسكان المشار إليها (ن = 4). (أ)مقارنة بين مستويات ROS الميتوكوندريا في CD48 صحية- LSK، ذرية النخاع، فضلا عن MLL-AF9 لينمنخفضة ج كيتعالية وMLL-AF9 لينمنخفضة ج كيت الخلاياالدولية منخفضة. (B)مقارنة بين مستويات ROS الميتوكوندريا في خلايا CD48- LSK صحية استناداً إلى التعبير CD150 مقابل MLL-AF9 لينمنخفضة ج كيتعالية وMLL-AF9 لينمنخفضة ج كيتInt-منخفضة الخلايا. (C)مقارنة بين مستويات ROS الميتوكوندريا في خلايا CD48 - LSK صحية استناداً إلى التعبير CD150 و CD34. (* p≤0.05; ** p < 0.01*** p < 0.001; **** p < 0.0001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4 التغيرات في مستويات ROS الميتوكوندريا باستخدام المركبات المؤيدة والمضادة للأكسدة: الرسوم البيانية لمستويات ROS الميتوكوندريا في خلايا BM الصحية وMLL-AF9 التعبير عن المعالجة مع 20 μM من ثنائيكبريتيد الصوديوم menadione (MSB) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪ (التحكم الإيجابي) أو مع 20 ميكرومتر من MSB في تركيبة مع 100 ميكرو متر N-أسيتيل-L-سيستين (NAC) لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5 تحسين ROS الميتوكوندريا وبقع الأجسام المضادة التي تعترف بالنسب. (أ)مقارنة مستويات ROS الميتوكوندريا (mROS) في MLL-AF9 التي تعبر عن خلايا ابيضاض الدم باستخدام 1 أو 5 ميكرومتر إما لمدة 10 أو 30 دقيقة. (الأحمر = السيارة؛ الأزرق = MSB 20 μM؛ الأخضر = NAC 100 μM; البرتقالي = Msb 20 μM + NAC 100 μM). (ب)مقارنة بين MFI من قناة CD34 (FITC) في LSKs صحية ملطخة لمدة 20، 60 أو 90 دقيقة مع #1 كوكتيل الأجسام المضادة (ن = 4، * ع ≤ 0.05؛ ** ص < 0.01). (C)مقارنة بين الأجسام المضادة تلطيخ قبل أو بعد الحضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6 ترتيب ROS الميتوكوندريا والنسب علامة تلطيخ الأجسام المضادة. (أ)قطع الأراضي نقطة من السكان HSPCs المشار إليها التي تم الحصول عليها باستخدام أوامر مختلفة من تلطيخ. (B)مستويات ROS الميتوكوندريا التي تم تقييمها في المقصورات LSK وMyeloid Progenitors التي تم الحصول عليها تستخدم ترتيب مختلف من تلطيخ (الأحمر = تلطيخ الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية تليها الميتوكوندريا ROS تلطيخ لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية؛ الأزرق = الميتوكوندريا ROS تلطيخ لمدة 10 دقيقة في 37 درجة مئوية تليها الأجسام المضادة تلطيخ 1H في 4 درجة مئوية). (C)القياس الكمي للMFI من ROS الميتوكوندريا (mROS) تلطيخ باستخدام أوامر مختلفة من تلطيخ في السكان المشار إليها (ن = 4، * ع ≤ 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7 تأثير علاج فيراباميل على صبغة ROS الميتوكوندريا تلطيخ في خلايا BM صحية وMLL-AF9-التعبير. (أ)قطع أرض نقطة من مجموعات HSPC المشار إليها في عينات عولجت مع أو بدون 50 ميكرومتر فيراباميل لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 5٪. (ب)الرسوم البيانية من ROS الميتوكوندريا وميتوماس صبغ الأخضر تلطيخ في السكان HSPC المشار إليها في وجود (الأزرق) أو غياب (أحمر) من 50 μM فيراباميل. (C-E) القياس الكمي لمستويات ROS الميتوكوندريا في السكان الخلايا صحية المشار إليها (C & D) وسرطان الدم (E) في عينات BM تعامل مع أو بدون 50 ميكرومتر فيراباميل أثناء تلطيخ ROS الميتوكوندريا (ن = 4، * ص ≤ 0.05). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: كوكتيلات الأجسام المضادة. قائمة كوكتيلات الأجسام المضادة المعدة في الخطوة 3.1. لتحديد مختلف السكان الفرعيين المكونة للدم داخل نخاع العظام صحية وسرطان الدم.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.