Method Article

وظيفية من القوة الذرية مجهر Cantilevers مع خلايا واحدة تي أو الجسيمات واحدة لالمناعية أحادية الخلية قوة مطيافية

DOI:

10.3791/59609

⸱

July 10th, 2019

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and School of Basic Medicine, Peking Union Medical College, 2Institute for Immunology, School of Medicine, Tsinghua University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا ً لتجسيد مجهر القوة الذرية (AFM) مع خلية T واحدة وجسيمات الخرزة للدراسات المناعية. وتظهر إجراءات التحقيق في خلية T خلية واحدة ملزمة من قبل AFM ورصد الاستجابة الخلوية في الوقت الحقيقي من الضامة إلى الجسيمات الصلبة واحدة من قبل AFM مع التصوير الفلوري.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحليل المجهري للقوة الذرية القائم على قوة الخلية الواحدة (AFM-SCFS) هو أداة قوية لدراسة الخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية. تسمح هذه التقنية للتحقق من نقاط القوة والديناميات التفاعل على غشاء الخلية الحية, بما في ذلك تلك التي بين الخلايا, مستقبلات وligands, وجنبا إلى جنب مع العديد من الاختلافات الأخرى. كما أنها تعمل كآلية لتقديم التحفيز الفيزيائي أو البيوكيميائي على الخلايا المفردة بطريقة محكومة زمنياً، مما يسمح بمراقبة تنشيط الخلايا المحددة والأحداث الخلوية اللاحقة في الوقت الحقيقي عندما يتم دمجها مع الخلية الحية التصوير الفلوري. الخطوة الرئيسية في تلك القياسات AFM-SCFS هي AFM-cantilever functionalization، أو بعبارة أخرى، إرفاق موضوع من الفائدة على cantilever. هنا، نقدم أساليب لتعديل cantilevers AFM مع خلية T واحدة وحبة البوليسترين واحدة على التوالي للدراسات المناعية. الأول ينطوي على الغراء متوافق بيولوجيا أن الأزواج خلايا T واحدة إلى غيض من cantilever شقة في حل، في حين أن هذا الأخير يعتمد على الغراء الايبوكسي لالتصاق حبة واحدة في بيئة الهواء. كما يتم توفير تطبيقين مناعيين مرتبطين بكل تعديل في الكانتيلفين. الطرق الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة لأنواع الخلايا المختلفة والجسيمات الصلبة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وجدت مجهرية القوة الذرية (AFM)، أداةمتعددة الاستخدامات، العديد من التطبيقات في أبحاث بيولوجيا الخلايا 1،2،3،4،5. وبصرف النظر عن قدرتها على التصوير عالية الدقة، تسمح ميزة سبر القوة الأصلية بالخصائص البيوفيزيائية للخلايا الحية للتحقيق مباشرة في الموقع على مستوى الخلية الواحدة6و7. وتشمل هذه صلابة الهياكل دون الخلوية أو حتى الخلايا الكاملة8،9،10،....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول تجربة الماوس يتبع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات من جامعة تسينغهوا

1. Cantilever functionalization مع خلايا T واحدة

  1. إعداد خلايا الطحال الماوس
    1. التضحية الماوس (8-16 أسابيع من العمر (أي من الجنسين)؛ على سبيل المثال، C57BL/6 سلالة) باستخدام ثاني أكسيد الكربون، تليها خلع عنق الرحم.
    2. تنظيف الماوس مع الإيثانول 75٪ وجعل شق الجلد خط الوسط تليها استئصال الطحال.
    3. تجانس الطحال في 4 مل من PBS التي تحتوي على 2٪ مصل البقر الجنيني (FBS) باستخدام الشرائح الزجاجية وإزالة المجاميع والحطام عن طريق تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة النايلون شبكة 70 ميكرومتر.
    4. طرد مركزي تعليق الخلية في 500 × ز ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 4A منحنيات المسافة الفردية من التفاعل الملزم بين الخلية أحادية T ووحدة البيانات أحادية في دورة واحدة للسحب من النهج. منحنى أحمر فاتح هو منحنى التمديد والأحمر الداكن هو منحنى التراجع. منذ يتم استخدام منحنى التمديد عادة للمسافة البادئة أو صلابة تحليل، هنا فقط منحنى التراجع يتعلق التصاق الخلية. الحد الأدنى للقيمة (الدائرة الخضراء) في المنحنى يعطي مقياسا لقوة التصاق الحد الأقصى. تمثل المنطقة الواقعة تحت المنحنى (المنطقة المظللة) العمل (الطاقة) المطلوب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تطور التحليل الطيفي لقوة الخلية الواحدة القائم على AFM ليكون أداة قوية لمعالجة الخصائص الفيزيائية الحيوية للخلايا الحية. وبالنسبة لتلك التطبيقات، تحتاج العلبة إلى أن تعمل بشكل صحيح من أجل سبر تفاعلات أو خصائص محددة على خلايا الاهتمام. هنا، يتم وصف أساليب لاقتران خلية T واحدة وحبة واحدة ميكرون الحجم إلى cantilever تلميح أقل على التوالي. لإرفاق خلية T واحدة إلى cantilever، تم اختيار الغراء متوافق بيولوجيا كمادة لاصقة الخلية. وهو حل بروتين مصاغ خصيصًا مستخلص من بلح البحر البحري. وتنشأ الأدهيسيه من بقايا البوليفينول التي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31370878)، وبرنامج مفتاح الدولة (31630023)، وبرنامج مجموعة البحوث المبتكرة (81621002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > مادة < / قوي >
10 مو ؛ ل طرف ماصةThermo Fisher104-Q
أنبوب 15 ملCorning430791
طبق ثقافة بقطر 6 سمNALGENE nunc150462
لوحة ثقافة 6 آبارJETTCP011006
AFM ناتئNanoWorldArrow-TL1-50ناتئ بدون نشيب
بيتا ؛ -MercaptoethanolSigma7604
غراء متوافق حيوياBD Cell-Tak354240
CD4 + كوكتيل عزل الخلاياالتائية STEMCELL19852C.1
DC2.4 خط خليةهدية من K. Rock (كلية الطب بجامعة ماساتشوستس ، ووستر ، ماساتشوستس)
الجسيمات المغناطيسية المطلية بالديكسترانSTEMCELLSV30010
EDTAGENErayGeneray-E1101-500 مل
إيبوكسيERGO7100
الإيثانولtwbio00019
FBSEx Cell BioFSP500
FcR مانعSTEMCELL18731
غطاء زجاجيبائع محلي (هاي من ليان شنغ)HX-E37قطر 24 مم ، شرائح زجاجية
رقيقة 0.17 ممقسم JinTong لإدارة المختبرات والمعدات ، Haimen & nbsp ؛N / Aمخصص
H2< / sub>O2 < / sub> (30٪)Sino pharm10011218
H2< / sub>SO4< / sub>Sino pharm80120892
HEPESSigma51558
مغناطيسSTEMCELL18000
مصفاة نايلونشبكية BD FalconREF 352350
Moesin-EGFPN / Aمستنسخ في المختبر
طقم عزل خلية ماوس CD25 TregSTEMCELL18782المكون: مانع FcR ، كوكتيل اختيار إيجابي للخلايا التائية التنظيمية ، كوكتيل اختيار PE ، Dextran RapidSpheres ،
ماوس CD4 + < / sup> طقم عزل TcellSTEMCELL19852المكون: كوكتيل عزل الخلايا التائية CD4 + T ، ستربتافيدين RapidSpheres ، مصل الفئران
NaOHLanyi المنتجات الكيميائية المحدودة؟ بكين1310-73-2
PBSSolarbioP1022-500
كوكتيل اختيار PESTEMCELL18151
البنسلين الستربتومايسينHycloneSV30010
PLC & delta ؛ -PH-mCherryAddgene36075
كريات البوليسترين المجهرية 6.0 & mu ؛ مبوليساينس07312-5
البوليسترين أنبوب القاع المستديرBD فالكون352054
مصل الفئرانSTEMCELL13551
RAW264.7  ATCC
المؤتلف البشري Interleukin-2Peprotech Peprotech، 200-02-1000
عازلة تحلل خلايا الدم الحمراءBeyotimeC3702
كوكتيل اختيار إيجابي للخلايا التائيةالتنظيمية STEMCELL18782C
RPMI 1640LifeC11875500BT
غرفة عينةمنزلي الصنع
الجسيمات المغناطيسية المطلية بالستربتافيدينSTEMCELL50001
طقم الإرسالClontech631318
Trypsin 0.25٪ EDTALife25200114
ملاقطJDN / A
NameCompanyCatalog Number< strong>تعليقات< strong>
Equipment
20x objective NA 0.8Zeiss420650-9901Plan-Apochromat
مجهر القوة الذريةJPKcellHesion200
جهاز طردمركزي بيكمان كولترAllegra X-12R
التصويرالفلوريمحلي الصنع من النوع الموضوعي الكلي الانعكاس الداخلي الفلوري المجهري على أساس حامل
مرطب CO2< / sub> حاضنةThermo FisherHERACELL 150i
مجهر ضوئي مقلوبZeissObserver A1 دليل
مجهر زايس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benoit, M., Gabriel, D., Gerisch, G., Gaub, H. E. Discrete interactions in cell adhesion measured by single-molecule force spectroscopy. Nature Cell Biology. 2 (6), 313-317 (2000).
  2. Chen, J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopySingle Cell Force SpectroscopyAFM Cantilever FunctionalizationT Cell AdhesionPolystyrene Bead AttachmentBiocompatible Glue ApplicationEpoxy Glue MethodDendritic Cell InteractionImmune Synapse FormationForce Distance Curves

Related Articles