مقالة منهجية

ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) لعزل الحمض النووي الريبي عن الخلايا البطانية في الجسم الحي

DOI:

10.3791/59624

⸱

مايو 25, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Blood Research Institute, Blood Center of Wisconsin, 2Department of Medicine, Medical College of Wisconsin, 3Department of Surgery, The University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, The University of Alabama at Birmingham, 5GBS Program, Graduate School, The University of Alabama at Birmingham

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم نهجا ً لتنقية الرَّناة الرَّاقيزة المنوّجة الوعائية من الخلايا البطانية الوعائية (ECs) مباشرة في أنسجة الدماغ والرئة والقلب باستخدام الأنسجة الوراثية الخاصة بالجماعة الأوروبية للبروتين الفلوري الأخضر المعزز (EGFP) في ريبوسوسوم بالاشتراك مع تنقية الحمض النووي الريبي .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اقتصرت العديد من الدراسات على استخدام الاختبارات الخلوية في المختبر والأنسجة الكاملة أو عزل أنواع محددة من الخلايا عن الحيوانات لتحليل هامدة في المختبر للتعبير الجيني عن طريق تسلسل qPCR وRNA. تحليل شامل للنسخ والتعبير الجيني لأنواع محددة من الخلايا في الأنسجة والأعضاء المعقدة سيكون حاسما لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي يتم تنظيم الجينات وارتباطها مع التوازن الأنسجة والجهاز وظائف. في هذه المقالة، نقوم بتوضيح منهجية عزل الحمض النووي الريبي المرتبط مباشرة في الجسم الحي في بطانة الأوعية الدموية من الرئتين الحيوانية كمثال. وسيتم وصف المواد والإجراءات المحددة لمعالجة الأنسجة وتنقية الحمض النووي الريبي، بما في ذلك تقييم نوعية الحمض النووي الريبي والغلة، فضلا عن qPCR في الوقت الحقيقي لتجارب الجينات الشريانية. ويمكن استخدام هذا النهج، المعروف باسم ترجمة تقنية تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP)، لتوصيف التعبير الجيني وتحليل النسخ لبعض أنواع الخلايا مباشرة في الجسم الحي في أي نوع محدد في الأنسجة المعقدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الأنسجة المعقدة مثل الدماغ الثدييات والقلب والرئة، والمستويات العالية من التباين الخلوي تعقيد تحليل بيانات التعبير الجيني المستمدة من عينات الأنسجة بأكملها. لمراقبة ملامح التعبير الجيني في نوع معين من الخلايا في الجسم الحي، تم تطوير منهجية جديدة مؤخرا، والتي تسمح باستجواب كامل mRNA المترجمة تكملة من أي نوع الخلية المعرفة وراثيا. وتعرف هذه المنهجية باسم ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) تقنية1،2. وهو أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا الخلايا البطانية وتكوين الأوعية الدموية عند الجمع بين التلاعب وراثيا الجينات الأخرى المرتبطة بتكوين الأوعية الدموية في الحيوانات.

لقد أظهرنا أن إشارات PKD-1 الوعائية ونسخ الجينات الوعائية CD36 أمران حاسمان للتمايز في الخلايا البطانية (EC) وتكوين الأوعية الدموية الوظيفي3و4و5 و6. لتحديد الآليات الجزيئية للإشارات الوعائية والأيضية في نسخ الجينات والتحويل عبر EC، أنشأنا فئران TRAP المهندسة وراثيا مع الجينات الوعائية المحذوفة على وجه التحديد على أساس تقنية TRAP1 , 2.وعلاوة على ذلك، في الحيوانات TRAP لدينا، ليس فقط لديهم pkd-1 أو cd36 نقص الجينات في بطانة الأوعية الدموية أو الحذف العالمي للجين cd36، ولكن يتم أيضا وضع علامة وراثيا على بروتين الفلورة الخضراء المعززة (EGFP) وراثيا على المفوضية الأوروبية تترجم الريبوسوسوم. يسمح TRAP بتنقية الرصانة الرائية الريبوسومية مباشرة من بطانة الأوعية الدموية للأنسجة المستهدفة، مما يتيح تحليل التعبير الجيني وتحديد النسخ الجديدة المرتبطة بالتمايز مع الجماعة الأوروبية و تكوين الأوعية الدموية مباشرة تحت في ظروف الجسم الحي. لقد نجحنا في عزل الحمض النووي الريبي من بطانة الرحم في هذه الحيوانات المهندسة وراثيا. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي النقي لمزيد من التوصيف للجينات الوعائية أو الشريانية في تنظيم تمايز الجماعة الأوروبية ووظائفها. يوفر هذا البروتوكول دليل خطوة بخطوة لتنفيذ نهج TRAP لعزل mRNA في ECs مباشرة في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة للتجارب الحيوانية، تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في كلية الطب في ويسكونسن.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد العازلة الليسيس لتركيزات 10 M HEPES، درجة الحموضة 7.4، 150 ملككل، 5 م مغكل 2، 0.5 م م DTT، 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد، مثبطات البروتياز، ومثبطات RNase المؤتلف إلى تركيزات كما هو موضح أدناه.
    1. إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من المياه منزوعة الأيونات خالية من RNase: 1.19 غرام من HEPES،5.59 غرام من KCl، 0.24 غرام من MgCl 2، 35 ملغ من DTT، 0.5 مل من سيكلوهيكسميد، وهيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة حتى درجة الحموضة 7.4، مثبطات البروتياز الخالية من EDTA (قرص صغير واحد لكل 10 مل) ومثبطات RNase (1 0 ميكرولتر / مل).
    2. يُحفظ في ثلاجة بزاوية 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. إعداد حاجز غسل متعدد الجوانب عالي الملح لتركيزات 10 MHePES، ودرجة الحموضة 7.4، 350 مل كيلوكل، 5 مل مغكل2،1٪ vol/vol CA-630، 0.5 mM DTT، و 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد.
    1. إضافة الكواشف التالية إلى 500 مل من المياه منزوعة الأيونات الخالية من RNase: 1.19 غرام من HEPES، 13.05 غرام من KCl، 0.24 غرام من MgCl2، 5 مل من المنظفات غير الأيونية، غير denaturing، 5 من 7.7 ملغ أنابيب DTT، و 0.5 مل من cycloheximide، وهيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة حتى درجة الحموضة 7.4.
    2. يُحفظ في ثلاجة بزاوية 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. ربط الأجسام المضادة للGFP إلى الخرز المغناطيسي البروتين G قبل بدء التجربة.
    1. إضافة 10 ملغ من الأجسام المضادة للGFP المخففة في 200 مل من PBS إلى الخرز G البروتين.
    2. الحضانة مع نهاية أكثر من نهاية التناوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. وضع الخرز على رف مغناطيسي وإزالة supernatant.
    4. تعليق الخرز في 200 مل من PBS وتخزينها في الثلاجة 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
  4. إعداد الجليد الباردة PBS مع 100 ملغ / مل سيكلوهيكسميد.
    1. أضف مجلدًا واحدًا من محلول سيكلوهيكسميد (100 ملغم/مل) إلى 99 مجلدًا من PBS المثلج.

2. عزل وlyse الأنسجة المطلوبة

  1. قتل الفئران عن طريق حقن IP من الكيتامين (500 مغ/كغ/وزن الجسم) وزيلازين (10 مغ/كغ/وزن الجسم) وعزل الأنسجة المطلوبة (أي القلب والرئة). انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
  2. ضع الأنسجة المطلوبة في 500 مل من الـ PBS المثلج مع 100 ملغم/مل سيكلوهيكسميد.
  3. الأنسجة الرخوة في تعليق الخلية مع المجانسة التي يحركها المحرك أو المجانسة الزجاج إزالة صغيرة. إذا كنت تستخدم المجانسة التي يقودها المحرك، حد من التجانس إلى أقل من دقيقة واحدة عند التردد المنخفض (<15,000 هرتز) لتجنب إزالة الحمض النووي الريبي.
  4. تعليق بيليه الخلية في 200 مل من العازلة lysis عن طريق الأنابيب وإعادة رسم حتى العازلة عدة مرات. مزيد من التجانس تعليق الخلية مع 10 السكتات الدماغية في المجانسة الزجاج إزالة صغيرة أو لمدة 15 ثانية في تردد منخفض (<15,000 هرتز) في المجانسة محرك يحركها.
  5. تتجانس أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 2000 × ز عند 4 درجة مئوية إلى نواة بيليه وحطام الخلايا الكبيرة، والحفاظ على supernatant.
  6. إضافة المنظفات غير المنوّقة غير الناطورة إلى 1% vol/vol وDHPC إلى 30 mM إلى supernatant. حضانة على الجليد لمدة 5 دقائق.
  7. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 16،000 × ز إلى بيليه المواد غير القابلة للذوبان. نقل والحفاظ على 15٪ من lysate واضحة كمدخلات للخطوات المستقبلية.

3. عزل مجمعات ريبوسم / ميرنا

  1. أضف 50 مل من الخرز المربوط بالأجسام المضادة إلى خليط الخلايا والحضانة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية مع دوران نهاية النهاية لمدة 30 دقيقة. هذا هو المكان الذي سوف تربط الأجسام المضادة لGFP ريبوسوسومز ذات العلامات GFP، مما يسمح لنا بعزل الحمض النووي الريبي من هذه الريبوسوسوم.
  2. جمع الخرز على رف المغناطيسي وغسل 5 مرات مع عالية الملح متعدد الغطاء العازلة.
    1. رسم وتجاهل السائل مرة واحدة وقد جمعت الخرز على جانب الأنبوب. ثم ماصة وإعادة رسم ما يصل 200 مل من الملح العالي polysome غسل العازلة عدة مرات. كرر هذه الخطوة 5 مرات وتجاهل كافة المخزن المؤقت بعد التكرار النهائي. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.

4. عزل ميرنا

  1. وضع الخرز في المخزن المؤقت RLT. يتم اتخاذ الخطوات التالية مباشرة من بروتوكول مجموعة صغيرة RNeasy ولم يتم توسيعها بأي شكل من الأشكال.
    تحذير: يحتوي المخزن المؤقت RLT على أملاح الغوانيدين. لا تخلط مع التبييض.
  2. جهاز الطرد المركزي lysate لمدة 3 دقائق بأقصى سرعة 13,000 دورة في الدقيقة أو 16,000 غرام عند 4 درجة مئوية. إزالة بعناية supernatant من 350 مل عن طريق الأنابيب ونقلها إلى أنبوب ميكروفوج جديد. استخدم فقط هذا التراكب (lysate) في الخطوات اللاحقة.
  3. إضافة حجم متساو من الإيثانول 70٪ في أنبوب microfuge.
  4. نقل ما يصل إلى 700 مل من العينة، بما في ذلك أي عجل التي قد تكون شكلت، إلى عمود تدور وضعت في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال.
  5. إضافة 350 مل من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال وإعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية.
    تحذير: يحتوي BUFFER RW1 على أملاح الغوانيدين. لا تخلط مع التبييض.
  6. إضافة 350 مل من المخزن المؤقت RW1 إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز. تجاهل التدفق من خلال.
  7. إضافة 500 مل من RPE المخزن المؤقت إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة 15 s في ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. تجاهل التدفق من خلال.
  8. إضافة 500 مل من RPE المخزن المؤقت إلى عمود الدوران. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة دقيقتين عند ≥ 8000 × ز لغسل غشاء عمود الدوران. ثم إزالة بعناية العمود تدور من أنبوب جمع، وضمان أن العمود لا يتصل تدفق من خلال.
  9. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد بـ 2 مل وتجاهل الأنبوب القديم مع التدفق من خلال. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة لإزالة المخزن المؤقت المتبقي.
  10. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد بـ 1.5 مل. إضافة 30-50 مل من المياه الخالية من RNase مباشرة إلى غشاء عمود تدور. أغلق الغطاء بلطف والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 8000 × ز لelute الحمض النووي الريبي.
  11. إذا كان العائد المتوقع من الحمض النووي الريبي >30 ملغ، كرر الخطوة 4.10 مع 30-50 مل أخرى من المياه الخالية من RNase، أو باستخدام elute من الخطوة 4.10 (إذا كان هناك حاجة عالية [RNA] ). إعادة استخدام أنبوب جمع من الخطوة 4.10.
  12. استخدام الحمض النووي الريبي النقي لتحليل المصب بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أو PCR الكمية في الوقت الحقيقي أو تخزين الحمض النووي الريبي المذاب في RNase خالية H2O في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراساتنا السابقة4,7 تشير إلى أن CD36 قد تعمل كمفتاح للتمايز الشرياني والشرايين الشعرية عبر مسار الإشارات LPA /PKD-1. لدراسة ما إذا كان محور الإشارات LPA/PKD-1-CD36 ضروريًا للتكوين الشراييني في الجسم الحي، فقد أنشأنا خطوط TRAP الجديدة التي لا تحتوي فقط على نقص CD36 عالميأو نقص cd36-pkd-1 الخاص ببطانة الرحم، ولكن أيضًا تسمح بعزل انتقائي من الحمض النووي الريبي ملزمة من سلالات الخلايا cre ملحوظ من قبل GFP، ومفيدة كمراسل الفلورسنت cre-activated2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الأوعية الدموية هو عملية معقدة متعددة الخطوات، حيث النسخ الجيني الوعائي الخاص بالجماعة الأوروبية وتعبيره يلعب دورا أساسيا في تمايز الجماعة الأوروبية وإعادة برمجة الأوعية الدموية3،4. للتغلب على الحواجز الناجمة عن التنوع الخلوي والتعقيد المعماري لفهم أفضل لوظيفة نظام الأوعية الدموية الثدييات على المستوى الجزيئي في الجسم الحي، أنشأنا الفئران TRAP الخاصة بالجماعة الأوروبية، مصحوبة cd36 الخاصة بالجماعة الأوروبية ، نقص PKd-1 الخاص بالجماعة الأو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم عمل الدكتور رين من قبل جمعية القلب الأمريكية (13SDG14800019; BR)، مؤسسة أمل آن (FP00011709؛ BR)، والجمعية الأمريكية للسرطان (86-004-26؛ ومركز السرطان MCW إلى BR)، والمعهد الوطني للصحة (HL136423؛ BR)؛ ويدعم الأردن بالمر من قبل 2018 MCW CTSI 500 نجوم برنامج التدريب; P. موران مدعوم من منحة التدريب على البحوث المؤسسية من NHLBI (5T35 HL072483-34).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2100 محلل حيوي للرحلان الكهربائي مع رقائق نانوية ورقائق بيكورقاقة AgilentG2939AA ، 5067-1511 & 5067-1513
كاشطات الخلاياSarstedt83.1832
المجانساتمغناطيس K8855100020
فيشر (Dynamag-2)سيعتمد Invitrogen123-21Dعلى مقياس التنقية ؛ يمكن تركيز العينات في أنابيب 1.5 مل على أ DynaMag-2
جهاز طرد مركزي صغيرفيشر Scientific05-090-100
NanoDrop 2000C مقياس الطيفالضوئي الحراري العلمي   ؛ND-2000C
Eppendorf5430Rمع دوار لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل أنابيب
الطرد المركزي الدقيقة الخالية من RNase 1.5 ملالأنظمة الحيوية التطبيقية   ؛AM12450
مخروطية خالية من الرناس سعة 50 ملأنظمة حيوية تطبيقية AM12501
خالية من RNase 1000-& ل نصائح مرشحRaininRT-1000F
RNase خالية من 200 - & ل نصائح التصفيةRainin RT-200F
RNase خالية من 20-μ ل نصائح التصفيةRainin RT-20F
الدوار للمجانساتYamato LT-400D
أنبوب دوار ، ماركة LabquakeThermo Fisher13-687-12Q
العلميجهاز طرد مركزي مبرد أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
  2. Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
  3. Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
  4. Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
  5. Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).
  6. Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis? Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
  7. Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).
  8. Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
  9. Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
  10. Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TRAP GFP GFP qPCR

مقالات ذات صلة