نحن نقدم طريقة بسيطة وفعالة لزرع 2'-ديوكسيغوانوسين المعالجة E18.5 الغدة الصعترية في كبسولة الكلى من فأر عارية. هذه الطريقة ينبغي أن يساعد في دراسة كل من وظائف الخلايا الظهارية الثيميك ونضج الخلايا T.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الغدة الصعترية هو جهاز مناعي مركزي مهم، والذي يلعب دورا أساسيا في تطوير وتمايز الخلايا T. زراعة الغدة الصعترية هي طريقة هامة للتحقيق في وظيفة الخلايا الظهارية الغدية ونضج الخلايا T في الجسم الحي. هنا سوف نصف الطرق التجريبية المستخدمة في مختبرنا لزرع 2'-ديوكسيغوانوسين (لاستنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة) علاج الغدة الصعترية الجنينية في كبسولة الكلى من فأر ة عارية الكمية. هذه الطريقة بسيطة وفعالة على حد سواء ولا تتطلب مهارات أو أجهزة خاصة. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها من خلال هذه الطريقة البسيطة أن الغدة الصعترية المزروعة يمكن أن تدعم بشكل فعال إنتاج الخلايا T المتلقي. وبالإضافة إلى ذلك، سيتم زيادة توضيح عدة نقاط رئيسية فيما يتعلق بالبروتوكول.
المقدمة
الغدة الصعترية هو الجهاز المناعي المركزي ، داخل الغدة الصعترية تخضع لاختيار إيجابي وسلبي ، وتصبح ناضجة الخلايا T1،2. نتائج اختيار إيجابية أو سلبية غير طبيعية في نقص المناعة أو أمراض المناعة الذاتية على التوالي3،4. لذلك، زرع الأعضاء الغدة الصعترية هو نهج مهم لدراسة عملية اختيار الخلايا T في الغدة الصعترية المانحة. هذه الطريقة حاسمة بشكل خاص عند تحليل وظيفة الظهارية الثيميك بوساطة الطفرات الجينية التي تسبب النمط الظاهري القاتل الجنيني عند تغيير5.
من أجل دراسة نضج الخلايا T المتلقي في الغدة الصعترية المزروعة، استنفاد الخلايا الليمفاوية المانحة داخل الغدة الصعترية أمر ضروري. ولهذا الغرض، عادة ما يتم اختيار الغدة الصعترية الجنينية 14-، 15- أو 16 يوما (E14، E15، E16) الغدة الصعترية6،7. الغدة الصعترية من مراحل أكثر نضجا يمكن أيضا أن تستنفد بنجاح من الخلايا الليمفاوية المانحة عن طريق علاج مع 2'-ديوكسيغوانوسين. ومع ذلك، لم يتم وصف بروتوكول مفصل لاستنفاد الخلايا الليمفاوية واستخدام ثقافة الغدة الصعترية القديمة من قبل8،9. في حين تم إدخال بروتوكولات زرع من قبل العديد من الدراسات10،11، ومن الضروري إجراء مزيد من التعديل وتحسين هذه البروتوكولات.
يتم فصل بروتوكولنا إلى جزأين: '1' استنفاد الخلايا الليمفاوية T من مرحلة النمو المتأخرة E18.5 الغدة الصعترية من قبل الثقافة في 2'-deoxyguanosine التي تحتوي على وسائل الإعلام. '2' زرع الغدة الصعترية المثقفة في المتلقين. في هذا الإجراء، قمنا بتطوير طريقة بسيطة لتسليم الأنسجة الكبيرة (E18.5 thymus) في كبسولة الكلى مع انخفاض فرصة الإصابة في الكلى. في حين تركز على الغدة الصعترية في مرحلة لاحقة، يمكن أيضا أن تستخدم بروتوكولنا مباشرة أو مع تعديلات لزرع الغدة الصعترية في مختلف مراحل النمو أو غيرها من الأنسجة ذات الحجم المماثل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ويلتزم البروتوكول المقدم بالمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات بجامعة جينان فيما يتعلق برعاية الحيوانات.
ملاحظة: المواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. عزل الغدة الصعترية الجنينية
- الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل التجربة، وتعقيم مقاعد البدلاء / هود مع الإيثانول 70٪.
- باستخدام ثاني أكسيد الكربون، والتخدير والرحيم الماوس الإناث الحوامل (18.5 يوما بعد التزاوج الناجح). ثم مسح منطقة البطن مع الإيثانول 70٪.
ملاحظة: هنا نحن التزاوج Insm1+/lacZ الإناث وInsm1+/lacZ الذكور. وقد تم حقن البنتوباربيتال داخل المشيمة قبل عزل الأجنة عن الرحم، وتم قطع الرأس لكل جنين. - باستخدام مقص، وجعل "V" على شكل قطع على البطن بدءا من المثانة وتشغيل حتى كل قرن من الرحم.
- باستخدام المقص، وقطع mesometrium وعنق الرحم / المهبل، وجمع الرحم. ضع الرحم في طبق بيتري يحتوي على ملح بارد بالفوسفات (PBS) على الجليد. بعد ذلك، فضح الأجنة التي هي في decidua المغلفة، عن طريق قطع جدار الرحم الأمامي من قرن الرحم واحد إلى الآخر. باستخدام ملاقط غرامة، قشر مرة أخرى الأنسجة المغلفات المغلفة وقطع الحبل السري للإفراج عن الأجنة. ضع جميع الأجنة في طبق بيتري جديد على الجليد حتى عزل الغدة الصعترية.
- مسح الجنين مع الكحول 70٪ ووضعها في طبق بيتري جديد. من هذه الخطوة على، تأكد من الحفاظ على الظروف العقيمة.
- عن طريق قطع قريبة من الفك السفلي مع مقص، وإزالة رأس الجنين واستنزاف الدم مع منشفة ورقية. بعد ذلك، إصلاح الجنين على نفس طبق بيتري في موقف supine.
ملاحظة: قطعنا قطعة من ذيل كل جنين لInsm1 وlacZ علم الوراثة. - باستخدام مقص، وقطع جدار الصدر الجانبي أفقيا على طول الجبهة الإبطية، ومن ثم قطع الحجاب الحاجز لفتح الصدر. يجب أن يكون الغدة الصعترية الآن مرئية كفصوص بيضاء تقع أمام القصبة الهوائية والمتاخمة للقلب.
- ضع ملقط عازمة طرف وراء الغدة الصعترية ومن ثم سحب قبالة الغدة الصعترية بلطف. تأكد من التحقق من سلامة الغدة الصعترية للتأكد من أنه يحتوي على فصوص مشتركة اثنين.
- غسل الغدة الصعترية مع 1X PBS وتقليم قبالة الأنسجة الضامة والأوعية الدموية تحت مجهر مجسم.
2- ثقافة الغدة الصعترية الجنينية المعزولة
- إضافة 500 درجة مئوية من وسط الثقافة (RPMI1640 + 15٪ مصل البقر الجنيني (FBS) + 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربيوميسين) إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. نقل الثيمي نظيفة في الآبار مع واحد الغدة الصعترية لكل بئر. يعرض الشكل 1 الغدة الصعترية المعزولة في وسائل الإعلام الثقافية.
- إلى كل الغدة الصعترية التي تحتوي على جيدا إضافة 2'-ديوكسيجرانوسين إلى تركيز نهائي من 1.25 mM.
- ثقافة الغدة الصعترية المعزولة لمدة ثمانية أيام، ومنعش كل من وسائل الإعلام الثقافة و2'-ديوكسيجرانوسين كل يومين.
3. إنشاء الفضاء تحت القبعات في كبسولة الكلى
- لإعداد الإبرة وأنبوب التسريبالمقطوع (الشكل 2)، وقطع إبرة الوريد فروة الرأس على جزء الأنبوب في زاوية 45 درجة باستخدام مقص.
- وزن الماوس عارية ومن ثم التخدير مع pentobarbital (1.5٪) حقن (75 ميكروغرام / ز وزن الجسم).
- عندما لا يتم ملاحظة أي رد فعل بعد قرصة اصبع القدم، ضع الماوس على طاولة التشغيل في وضع جانبي الحق.
- مع مسحة اليود البوفيدون 0.5٪، تطهير الجلد مرتين في المنطقة الجراحية من الداخل إلى خارج الجسم.
- باستخدام مقص، جعل شق الجلد 5-9 ملم موازية للعمود الفقري في منطقة الكلى اليسرى (بين الضلع الأخير وقمة الحرقفي). بعد ذلك، افتح تجويف البطن عن طريق قطع الأنسجة والعضلات تحت الجلد وفضح الكلى.
- مع تعرض الكلى، استخدم زوجًا من الملقط في يد واحدة لرفع العضلات والأنسجة الدهنية من حافة الشق على جانب العمود الفقري. مع اليد الأخرى، اضغط بلطف على الكلى خارج (بدلا من ذلك، يمكن الضغط على الكلى باستخدام أصابع كلتا اليدين).
- للتأكد من أن كبسولة الكلى رطبة أثناء الجراحة، بلل سطح الكلى مع محلول ملحي (0.9٪ حمض الكلى).
- إنشاء شق في كبسولة الكلى، وخدش بلطف كبسولة الكلى على الجانب الأيمن السفلي باستخدام طرف إبرة أعدت في الخطوة 3.1. يجب أن يكون حجم النك 1/2-2/3 عرض الكلى; لا خدش على الكلى.
- حرك أنبوب التسريب المعد في الخطوة 3.1 إلى شق على كبسولة الكلى. فكّن الكبسولة الكلوية بلطف مع الكلى على طول الجانب الطويل للكلية حتى تصل إلى 3-4 ملم داخل كبسولة الكلى. سحب مرة أخرى أنبوب التسريب. يتم تأسيس المساحة تحت القبعات الكلى.
4. زرع الغدة الصعترية المورين الجنينية
- غسل الغدة الصعترية المستزرعة في الخطوة 2.3 مرتين في المالحة لاستنزاف وسائل الإعلام الثقافية.
- قم بتوصيل أنبوب التسريب المقطوع المعد في الخطوة 3.1 بحقنة في واجهة توصيل الحقنة الخاصة به. يستنشق الغدة الصعترية المعدة في أنبوب التسريب ببطء.
- أدخل أنبوب التسريب المقطوع برفق في كبسولة الكلى ووصل إلى القطب العلوي. تسليم الغدة الصعترية في كبسولة الكلى. سحب الأنبوب ببطء في حين دفع في وقت واحد الغطاس من الحقنة بلطف.
- باستخدام مصباح الكحول، تسخين قليلا الإبرة المعدة في الخطوة 3.1. بعد التأكد من أن الغدة الصعترية كلها داخل الفضاء تحت القبعات، استخدم الإبرة ساخنة لكي النك.
- بعد الكي ، استعادة الكلى في تجويف البطن. خياطة الصبغة والعضلات.
- باستخدام خياطة فراش عمودي ة معدلة توقف، أغلق شق الجلد (ربط ما لا يقل عن ثلاثة عقدة وقطع أي خيط الزائدة).
- باستخدام مسحة اليود البوفيدون، تطهير الشق. لتخفيف الألم، تم إجراء حقن تحت الجلد من الفلونيكسين (2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم) خلال الجراحة ثم لمدة 3 أيام بعد الجراحة.
- حتى يتعافى تماما من التخدير، والحفاظ على الماوس الحارة تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء.
- الحفاظ على الغدة الصعترية في كبسولة الكلى المتلقي لمدة 8 أسابيع قبل تشريح الغدة الصعترية المزروعة وإجراء تحليل الفينوتيبيك كما سبق وصفه5،8،9.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا نُظهر الغدة الصعترية E18.5 المعزولة التي تحتوي على فصوص كاملة (الشكل1). بالإضافة إلى ذلك، نعرض إبرة الوريد فروة الرأس التي تمقصها لتشكيل شطبة على أنبوب التسريب (الشكل 2). بعد ذلك، نعرض أيضًا صورة تمثيلية عن موضع الغدة الصعترية التي تم زرعها في كبسولة الكلى (الشكل3A)والغدة الصعترية بعد 8 أسابيع من النمو داخل الفئران المتلقية (الشكل3B). لتحديد ما إذا كانت الخلايا T قد تم إنتاجها في الفئران عارية المزر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
زرع الكُبسة الكلوية للمُدَدَدَيّة الجنينية هو طريقة هامة لدراسة وظيفة الخلايا الظهارية الثيميك وعملية نضج الخلايا التائية في الجسم الحي. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات التجريبية على زراعة الأعضاء الغدة الصعترية الجنينية وزرع6،7، بروتوكولنا يوفر إجراء بديل بسيط على ثقافة الغدة الصعترية الجنينية وsubcapsular الكلى زرع لأنسجة الغدة الصعترية القديمة.
بروتوكولنا يحسن على البروتوكولات السابقة من خلال دمج العد...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يعلن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل من قبل حزمة البداية من جامعة جينان إلى S.J. وبرنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو الصين (منحة رقم 201704020209 إلى S.J.). نشكر إيمي بوتا (قسم البيولوجيا، جامعة يورك، تورنتو، ON M3J 1P3، كندا) على التدقيق والتحرير للمخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.5٪ بوفيدون اليود | شنغهاي Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم | شاندونغ Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 مل حقنة معقمة | Solarbio | YA1090 | |
| 2'-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M في DMSO ، 1: 800 باستخدام (نهائي 1.25 ملم) |
| 24 لوحة بئر | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 إبر خياطة جراحية بخيط | أدوات الجراحة المجهرية NingBo Cheng-He الصين | YY0166-2002 | |
| طبق ثقافة الخلايا 60 مم | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70٪ ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC الأجسام المضادة CD8a المضادة للفأر | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| ملقط ناعم عازمة ، JZ 10 سم | شنغهاي مجموعة الأجهزة الطبية المحدودة | JD1060 | للتعقيم قبل الاستخدام |
| Cefmetazole الصوديوم للحقن | Sichuan Hexin Pharmaceutical co، Ltd | 17062111 079 | 6mg في 0.5 مل 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم ، 7.5ul / g وزن الجسم |
| مقص تشريح ، JZ 10 سم | شنغهاي Medical Devices Group Co.، Ltd. | JC2303 | للتعقيم قبل استخدام |
| مصل الأبقار الجنيني (FBS؟ | GIBCO | 10270-106 | |
| ملقط ناعم ، JZ 10 سم | شنغهاي مجموعة الأجهزة الطبية المحدودة | JD1050 | للتعقيم قبل الاستخدام |
| قياس التدفق | الخلوي BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1 مجم في محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ، وزن الجسم 2 لتر / جم |
| ملقط ، Dumont # 5 | World Precision | Instruments 14098 | للتعقيم قبل الاستخدام |
| مصباح الأشعة تحت الحمراء | OTLAN | MT-810 | |
| حامل إبرة ، JZ 14 سم | شنغهاي مجموعة الأجهزة الطبية المحدودة | J32010 | للتعقيم قبل الاستخدام |
| PE المضاد للفأر CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| خليط البنسلين والستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | 1:100 |
| ملح الصوديوم بنتوباربيتال | Sigma | P3761 | محلول 1.5٪ في PBS ، 75 ميكروغرام / جم وزن |
| الجسم RPMI1640 متوسط | GIBCO | C14-11875-093 | |
| إبرة وريد فروة الرأس | شنغهاي تفضل الأدوات الطبية المحدودة | XC001 | |
| مقص الربيع | VANNAS | S11014-12 | للتعقيم قبل الاستخدام |
| المجهر المجسم | أوليمبوس | SZ61 | |
| معقم 15 سم مسحة قطنية | قوانغتشو Haozheng | 20150014 | |
| معقم 5 سم × 7 سم -8P | قوانغتشو Haozheng | 20172640868 | |
| معقم PBS (1x) | الأنسجة GENOM | GNM20012 | |
| ، JZ 12.5 سم | Shanghai Medical Devices Group Co.، Ltd. | J41010 | للتعقيم قبل الاستخدام |
المراجع
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- T-Cell Development: Methods and Protocols. Bosselut, R., Vacchio, M. S. , Methods in Molecular Biology, vol. 1323 (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2nd, Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709(2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504(2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
