Method Article

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

DOI:

10.3791/59664

⸱

June 7th, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, 2Department of Radiology and Developmental Neuroscience Program, Saban Research Institute, Children's Hospital Los Angeles, 3Keck School of Medicine, Department of Radiology, University of Southern California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نبلغ رسول RNA (mRNA) الكهربائي كوسيلة تسمح للتعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في نظام نموذج الجنين السمان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتسمية الخلايا الفلورية وتسجيل ها في الحركات الحية عن طريق المجهر الفاصل الزمني بعد وقت قصير من الكهربائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نبلغ أن الكهرباء mRNA يسمح البروتينات الفلورية لتسمية الخلايا في الأجنة السمان الحية بسرعة أكبر وعلى نطاق واسع من الكهرباء الحمض النووي. كفاءة الانف بنسبة عالية يسمح ما لا يقل عن 4 mRNAs متميزة لتكون مشتركة مع كفاءة ~ 87٪. وتتحلل معظم الMRNAs الكهربائي خلال أول 2 ساعة بعد الكهرباء، مما يسمح بإجراء تجارب حساسة للوقت في الجنين النامي. وأخيرا، نحن نصف كيفية صورة دينامية الأجنة الحية الكهربائي مع mRNAs التي ترميز مختلف البروتينات الفلورية المستهدفة دون الخلوية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكهربائي هو طريقة التغوط المادي الذي يستخدم نبض كهربائي لخلق المسام العابرة في غشاء البلازما، مما يسمح لمواد مثل الأحماض النووية أو المواد الكيميائية لتمرير في السيتوسول. يستخدم على نطاق واسع الكهربائي لتسليم الحمض النووي في البكتيريا والخميرة والنباتات وخلايا الثدييات1،2،3. يتم استخدامه بشكل روتيني لإدخال الحمولات الوراثية في الخلايا والأنسجة المستهدفة داخل جنين الطيور النامية لدراسة الرقابة الوراثية على التنمية أو تسمية السكان المهاجرين من الخلايا4،5،6، 7. ومع ذلك، توجد عدة قيود تجريبية أيضا مع الكهربة الحمض النووي8. على سبيل المثال، غالباً ما يقدم الكهربة الحمض النووي أرقام متغيرة للغاية من ناقلات التعبير لكل خلية، وبالتالي mRNAs والبروتينات التي ترمز. هذا التباين يمكن أن يؤدي إلى عدم تجانس الخلية الكبيرة التي تعقدكل من تحليل الصورة وتفسير البيانات 9،10. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات من الحمض النووي الكهربائي تبدأ فقط للتعبير عن ~ 3 ساعة بعد الكهربائي ولا تصل إلى أقصى قدر من الكفاءة في عدد الخلايا وكثافة الفلورة حتى 12 ساعة، على الأرجح بسبب الوقت اللازم لنقل إلى النواة وكاملة كل من النسخ والترجمة في الجسم الحي11.

وعلى النقيض من ذلك، تم استخدام التغوط mRNA بشكل فعال في مجموعة متنوعة من النظم النموذجية، بما في ذلك الخلايا الدهنية Xenopus laevis عن طريق الحقن المجهري12،13، إعادة برمجة الخلايا الجذعية البشرية عن طريق الانقبح lipofectamine mRNA14 ، والخلايا الجذعية العصبية المتمردة الكهربائي في الفئران الكبار15. اختبرنا قدرة الكهرباء mRNA لتسمية الخلايا بكفاءة أثناء التطور الجنيني في وقت مبكر من الطيور باستخدام mRNAs في المختبر توليفها التي ترميز البروتينات الفلورية المتميزة (FPs). لدراساتنا, استخدمنا ناقلات pCS2 + , ناقلات التعبير متعددة الأغراض التي تستخدم عادة للتعبير عن البروتينات في Xenopus وحمار وحشي الأجنة. يسمح المروجون للبوليميراز من نوع SP6 وT7 RNA في pCS2+ بتوليف الحمض النووي الريبي والبروتين من أي جين مستنسخ عند استخدامه في نظام النسخ/الترجمة في المختبر.

هنا، نثبت أن الكهربة mRNA يسمح التعبير السريع والفعال من البروتينات الفلورية (FPs) في أجنة السمان الغاز. قمنا بتصميم وإنشاء العديد من ناقلات التعبير المستخدمة في هذه الدراسات. على سبيل المثال، نحن subcloned الجينات LifeAct-eGFP16 في ناقلات pCS2 +17 للتعبير من المروج CMV والمروج SP6. الجين المدرج يكمن المصب من المروج SP6 والمنبع من SV40 بولي (A) الذيل18. في الأجنة التي تم تحويلها إلى كهرباء مشتركة مع الحمض النووي الريبي والحمض النووي، تم الكشف لأول مرة عن الملوثات العضوية الثابتة المرمزة من الـ mRNAs في المختبر في غضون 20 دقيقة من الكهربة، في حين تم الكشف عن الـ FPs من ناقلات تعبير الحمض النووي فقط بعد 3 ح. ترميز mRNAs متعددة للنووي، غولجي، و يمكن أن تكون البروتينات الغشاء الكهربائي في الجنين في وقت واحد، مما أدى إلى التعبير السريع والفعال من البروتينات المتعددة في الخلايا الفردية. وأخيرا، باستخدام انتعاش الفلورة في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) ، ونحن نظهر أن غالبية mRNAs الكهربائي الاضمحلال في غضون 2 ساعة. وهكذا، فإن إنتاج البروتين الأولي السريع جنبا إلى جنب مع ترجمة بروتين جديدة محدودة يجعل mRNA الكهربائي تقنية قيمة عندما يكون التحكم الزمني في التعبير ضروريا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نُفذت جميع الإجراءات الحيوانية وفقاً للمبادئ التوجيهية المعتمدة من مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس ولجان الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانية التابعة لجامعة جنوب كاليفورنيا.

1. توليد ناقلات التعبير المستندة إلى pCS2

  1. لاستنساخ pCS2.Lifeact-eGFP، وإعداد العمود الفقري ناقلات عن طريق هضم 2 ميكروغرام من pCS2.CycB1-GFP (بناء يحتوي على إدراج مختلف) مع BamHI (10 U) و BsrGI (10 U) في المخزن المؤقت الهضم المناسب (انظر جدول المواد) المخففة إلى 1X في رد فعل إجمالي حجم 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية (انظر الشكل 1 للاطلاع على مخطط إجراء الاستنساخ).
    1. Dephosphorylate الحرة 3'OH ينتهي من العمود الفقري ناقلات من رد فعل إنزيم تقييد عن طريق إضافة الجمبري القلوية الفوسفاتيز (1 U). حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. تشغيل الخليط كله في هلام أغاروز 1٪ / 1X تريس خلات EDTA (TAE) العازلة في 90 V لمدة 50 دقيقة ~ ثم وصمة عار هلام في حل 0.5 ميكروغرام / مل من بروميد الإهيديوم في 1X TAE العازلة لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف. أيضا، تأكد من تحميل علامات الوزن الجزيئي في حارة حرة للمساعدة في تحديد أحجام الحمض النووي.
    3. باستخدام الحمض النووي آمنة الأشعة فوق البنفسجية Transilluminator لتجنب شق DNAs، وقطع العمود الفقري ناقلات (حجم الفرقة المتوقعة من 4kb) من هلام أغاروز بسرعة وعزل جزء الحمض النووي من قطعة هلام باستخدام مجموعة تنقية هلام باستخدام تعليمات الشركة المصنعة.
  2. في وقت واحد مع الخطوة 1.1، وإعداد إدراج عن طريق هضم 2 ميكروغرام من pEGFP-N1-Lifeact مع BglII (10 U) و BsrGI (10 U) في العازلة الهضم المناسب المخفف إلى 1X في حجم التفاعل الكلي من 50 ميكرولتر لمدة ساعة 1 في 37 درجة مئوية. قم بتشغيل الخليط بأكمله في جل أغاروز بنسبة 1% لعزل النطاق 800 نقطة أساس كما سبق شرحه في الخطوة 1.1.2-1.1.3.
  3. بعد كل من يتم تنقية كل من المتجه وإدراجه وكمية على مقياس الطيف، والجمع بين 50 نانوغرام من المتجه و 38 نانوغرام من إدراج (1:3 نسبة الأضراس من ناقلات لإدراج) في T4 الحمض النووي ligase العازلة قبل إضافة T4 الحمض النووي ligase لتحفيز رد فعل الربط. بالإضافة إلى ذلك، قم بإعداد أي تحكم الحمض النووي، والسيطرة على ناقلات فقط، وإدراج عنصر تحكم فقط. احتضان جميع ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    1. تحويل 1 ميكرولتر من خليط (ق) الربط إلى المختصة E. القولونية DH10. أيضا، تحويل المياه فقط السيطرة السلبية و 20 pg من التحكم الإيجابي pUC19. نشر البكتيريا على المرق لوريا (LB) لوحات أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين وحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. في صباح اليوم التالي، عد المستعمرات على كل لوحة.
      ملاحظة: من الناحية المثالية، لا ينبغي أن تكون هناك مستعمرات على لوحات التحكم السلبية، > 100 مستعمرات على لوحات الربط vector+insert، ومستعمرات أقل على لوحة المتجه فقط.
    3. اختيار ما لا يقل عن 8 مستعمرات بكتيرية من لوحة أجار تحولت مع ناقلات + إدراج خليط الربط وتلقيح لهم باستخدام مسواك معقمة أو نصائح pipet في 2 مل من مرق LB السائل الذي يحتوي على 50 ميكروغرام / مل أمبيسيلين.
    4. استخراج الحمض النووي من كل من الحيوانات المستنسخة باستخدام مجموعات miniprep بلازميد التجارية.
    5. تشغيل ملخص تقييد التشخيص باستخدام 500 نانوغرام من الحمض النووي من كل استنساخ باستخدام نوتي (10 U) وBamHI (10 U) في العازلة الهضم المناسب المخفف إلى 1X لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية وتشغيل الحمض النووي المهضوم على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE العازلة. أحجام الفرقة المتوقعة لاستنساخ pCS2.Lifeact-eGFP إيجابية هي 3.9 كيلو بايت و 978 نقطة أساس.
    6. تحويل 1 pg-100 ng من الحمض النووي من استنساخ إيجابي إلى المختصة E. القولونية DH10، وإعداد 3-4 ردود الفعل miniprep كما هو مفصل في الخطوات السابقة للحصول على كمية كافية من الحمض النووي لرد الفعل النسخ في المختبر (10 ميكروغرام الحد الأدنى).

2. إعداد الحمض النووي الريبي عن طريق النسخ في المختبر

  1. خطي 10 ميكروغرام من pCS2.LifeAct-eGFP على نهاية 3 ' من إدراج مع نوتي (10 U) في المخزن المؤقت الهضم المناسب المخفف إلى 1X في حجم التفاعل الكلي من 50 درجة مئوية في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لمنع التلوث RNase والحد من تدهور الحمض النووي الريبي، وارتداء القفازات أثناء التعامل مع عينات mRNA.
  2. تنقية الحمض النووي باستخدام خليط من الفينول: الكلوروفورم: كحول isoamyl (25:24:1، v/v).
    1. إضافة 150 درجة مئوية من المياه الخالية من RNase لجعل الحجم الإجمالي لرد فعل الهضم يساوي 200 درجة مئوية. ثم، إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: الكحول isoamyl ودوامة الخليط لمدة 20 ثانية.
    2. الطرد المركزي في ميكروفوج في السرعة القصوى (18,400 × ز)لمدة 2 دقيقة. كرر هذه الخطوة لإزالة شوائب إضافية والحرص على عدم تعطيل الترسيب الأبيض الذي قد يشكل بين مراحل السائل السفلي والعلوي.
  3. يعجل الحمض النووي الخطي عن طريق إضافة 1/10 حجم 3M خلات الصوديوم (RNase خالية) و 2.5 كميات من الإيثانول 100٪. ترك الخليط في -20 درجة مئوية ل > 30 دقيقة، ثم بيليه الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي في السرعة القصوى (18400 × ز).
    1. غسل بيليه الحمض النووي مع الإيثانول 70٪، ثم الهواء الجاف بيليه ل > 5 دقيقة.
    2. إذابة بيليه الحمض النووي في 5 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase. قياس الحمض النووي بواسطة مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: التركيز المتوقع للحمض النووي هو ~ 0.5-1 ميكروغرام / ميكرولتر مع نسبة A260/A280 بين 1.7-2.0.
  4. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الخطي pCS2.LifeAct-eGFP للنسخ في المختبر (IVT). اتبع تعليمات الشركة المصنعة في المجموعة التجارية (انظر جدول المواد) لتشمل 10 ميكرولتر من الغطاء التناظري (التركيز النهائي 0.8 mM) وNTPs (التركيز النهائي 1 mM لATP وCTP وTTP؛ 0.2 mM لGTP)، 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرد 10x (التركيز النهائي 1x)، 2 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي الريبي SP6، والمياه الخالية من RNase تصل إلى 20 ميكرولتر.
    1. احتضان خليط IVT لحوالي 2 ساعة أو أكثر، اعتمادا على حجم النص.
      ملاحظة: 2 ح الحضانة يعمل بشكل جيد لنسخة 3 كيلو بايت، ولكن الحضانة بين عشية وضحاها يعمل بشكل أفضل للنصوص التي هي أكبر من 5 كيلو بايت.
    2. لإزالة النيوكليوتيدات الحرة من رد فعل النسخ، إضافة 30 درجة مئوية من محلول هطول الأمطار الحمض النووي الريبي LiCl (7.5 M كلوريد الليثيوم، 50 MM EDTA) لتسريع mRNA. دوامة الخليط لفترة وجيزة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. حل mRNA توليفها في 15 درجة مئوية من المياه الخالية من RNase. الاستغناء عن mRNA توليفها في 5 ميكرولتر / أنبوب (3 أنابيب المجموع) ووضعها في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل. تحديد الكمية mRNA مع مقياس الطيف الضوئي.
    ملاحظة: العائد المتوقع هو 15-20 ميكروغرام من mRNA (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر). 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام/ميكرولتر) يكفي لإجراء تجربة مع حوالي 10 أجنة، على افتراض أن الحمض النووي الريبي يتم تخفيفه من 1 ميكروغرام/ميكرولتر إلى 500 نانوغرام/ميكرولتر وأن كل جنين يحقن بحوالي 200 نانوغرام. ولذلك، ينبغي أن يحتوي كل أنبوب على ما يكفي من mRNA لتجارب ~ 5.
  6. تشغيل ~ 300 نانوغرام من mRNA على هلام أغاروز 1٪ في 1X TAE العازلة بعد تنظيف جميع معدات هلام مع حل إزالة التلوث RNase (على سبيل المثال، RNase بعيدا) وضمان أن mRNA يظهر كنطاق واحد (نطاقات متعددة قد تكون موجودة إذا شكل الهياكل الثانوية) وأنه لا تشويه ppears في حارة هلام، مما يشير إلى تدهور الحمض النووي الريبي.

3. إعداد مزيج الكهربائي mRNA

  1. ذوبان وتخفيف mRNA في التركيز المطلوب (250-500 نانوغرام / ميكرولتر في المياه الخالية من RNase يعمل بشكل جيد لجميع mRNAs اختبارها في هذا العمل). إضافة 1/10 حجم من صبغ الملونة (انظر جدول المواد، RNAse خالية، 0.1٪ التركيز النهائي) للمساعدة في تصور موقع حقن mRNA ووضع الأقطاب الكهربائية بشكل صحيح.
    ملاحظة:     إذا تم الجمع بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي لإجراء الكهرباء المشتركة، تأكد من أن الحمض النووي خال من تلوث RNases باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم وهطول الأمطار الإيثانول قبل MRNA وخليط الحمض النووي الريبي.
    1. تأكد من إعداد عنصر تحكم سلبي باستخدام حل الكهربائي وهمية (لا يضيف الحمض النووي الريبي). إذا كان ذلك ممكناً، قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي باستخدام mRNA (mRNA معتمد مسبقًا) الذي ثبت أنه ينتج FP بنجاح في التجارب السابقة).
      ملاحظة: والسيطرة السلبية ضرورية لجميع تجارب التصوير لتحديد مستويات الفلورة الخلفية لتطبيع البيانات. التحكم الإيجابي مهم بشكل خاص عند العمل مع mRNA المنقولة حديثا من خلال المساعدة على التأكد من أن إعدادات الكهربائي عملت.
  2. تخزين محلول الكهربائي mRNA على الطين الجليد لمنع التدهور حتى على استعداد للمضي قدما مع الكهربائي.

4. الكهروبويرات mRNAs في أجنة السمان الحية

  1. جمع بيض السمان المخصبة الطازجة يوميا وتخزينها في 13 درجة مئوية في ثلاجة رطبة لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. حضانة بيض السمان عند 38 درجة مئوية حتى مراحل النمو الجنينية المطلوبة19و20و21.
    ملاحظة: تم استخدام HH3 إلى HH5 في هذه الدراسة لكل من التصوير الثابت والديناميكي. بالنسبة للأجنة HH3، فإن ترك البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة قبل الحصاد يجعل عملية العزل أسهل بكثير حيث أن الأجنة عادة ما تكون أكثر مقاومة للتلاعب البدني عند تبريده.
  2. عزل وإعداد الأجنة وفقا لنظام الثقافة EC22. جمع ما لا يقل عن 5 أجنة لكل حالة، بما في ذلك واحد على الأقل لتكون بمثابة السيطرة السلبية (وليس الكهربائي).
    1. يُكسر البيض برفق ويُسكب في طبق بيتري بحجم 10 سم. إزالة غالبية الزلال سميكة مع ماصة نقل وإزالة الزلال سميكة المتبقية حول الجنين عن طريق مسح بلطف سطح صفار مع مسح الأنسجة لضمان أن الجنين العصي بإحكام على حلقة الورق.
    2. وضع ورقة مرشح precut (انظر جدولالمواد) على الجنين واستخدام مقص لقطع بسلاسة حول محيط الجنين.
    3. استخدام ماصة باستور لتكمن تحت الجنين مع PBS، وذلك باستخدام تيارات لطيف لإخلاء أي صفار التمسك الجنين.
      ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة عند العمل مع الأجنة الأصغر سنا (
    4. سحب ببطء الجنين / ورقة حلقة في زاوية مائلة صعودا وإيقاف صفار في طبق بيتري مليئة PBS لمزيد من التنظيف. مرة واحدة وقد تم إزالة معظم صفار، وضع الجانب البطيني الجنين حتى على طبق بيتري 35 ملم مغطاة خليط شبه صلب من أجار / الألبومين.
  3. إعداد 6-8 10 سم الشعيرات الزجاجية طويلة (O.D. = 1.2 مم) باستخدام آلة سحب ميكروسبيت الزجاج.
  4. ضع الجانب البطني الجنيني في غرفة الكهرباء المليئة بPBS. باستخدام الشعيرات الدقيقة الزجاجية، حقن بولوس من 200 نمل من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي / الحمض النووي / mRNA مزيج الكهربائي في تجويف بين الغشاء إبيبلاست وفيتيلين تغطي المنطقة المطلوبة.
    ملاحظة: تم تخطيط المنطقة الأمامية بأكملها لpellucida وبعض المناطق لopaca في معظم التجارب المبينة في هذه المخطوطة.
  5. ضع الأقطاب الكهربائية الإيجابية والسلبية (قطب مربع مسطح بلاتينيوم؛ طول جانبي قدره 5 مم) على أعلى وأسفل الجنين على التوالي والكهربائي باستخدام تسلسل النبض التالي: خمس نبضات كهربائية مربعة من 5 فولت، مدة 50 مللي ثانية مع فواصل زمنية تبلغ 100 مللي ثانية باستخدام الكهربائي في الجسم الحي. تأكد من أن المسافة بين الأقطاب الكهربائية هي ~ 5 ملم.
    ملاحظة: تحسين معلمات الكهرباء أمر بالغ الأهمية لتجنب الظروف التي يمكن أن تقتل الخلايا الجنينية الهشة. وينبغي النظر في بارامترات الجهد، وطول النبض، وفترات النبض، وعدد النبضات للحمض النووي والحمض النووي الريبي (DNA) لمختلف أجهزة الكهرباء.
  6. احتضان الأجنة الكهربائي في 38 درجة مئوية إلى مرحلة النمو المطلوب.
    ملاحظة: يساعد منظار الاستريو الفلوري (انظر جدولالمواد) على فحص الأجنة غير المنقولة.
  7. إذا كانت الأجنة ليتم تصويرها بشكل ثابت، قم بإصلاحها في 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
    1. إزالة الأجنة من غشاء vitelline عن طريق قطع بسلاسة حول محيط ورقة فلتر مع مقص وتقشير قبالة الغشاء لامعة على السطح الظهري مع ملقط حاد بلطف.
    2. غسل الأجنة الثابتة في PBS / تريتون (0.1٪) 2x لمدة 5 دقائق والاستمرار في التهجين في الموقع أو تلطيخ المناعة إذا رغبت في ذلك.
    3. وأخيراً، وصمة عار الجنين في 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر DAPI في PBS / تريتون (0.1٪) لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. غسل الأجنة في PBS / تريتون 2X لمدة 5 دقائق ومسح الجنين في حل SCALE-U223 بين عشية وضحاها.
  8. لتحليل كفاءة الكهربة (انظر الشكل2)، استخدم أداة تحليل ثنائي والجسيمات وقناة DAPI على ImageJ للحصول على الخطوط العريضة النووية من جميع الخلايا في الصورة.
    1. لاستخدام الأداة الثنائية على ImageJ، استخدم شريحة z واحدة في قناة DAPI التي تحتوي على غالبية الخلايا وانقر فوق عملية > ثنائي > جعل ثنائي. لفصل الخلايا القريبة، انقر فوق معالجة > ثنائي > مستجمعات المياه. الحصول على الخطوط العريضة للخلية عن طريق النقر تحليل > تحليل الجسيمات، حجم تعيين إلى 100-500 (ميكروم2).
    2. تأكد من أن معظم الخلايا موضحة في قناة DAPI وحفظ الخطوط العريضة للخلية بالنقر فوق المزيد > حفظ على النافذة المنبثقة مدير عائد الاستثمار.
    3. استخدم هذه المخططات التفصيلية للحصول على قيم شدة الفلورة لقناة mRNA وDNA عن طريق فتح الملف المحفوظ ة مسبقًا على شريحة z واحدة في قناة mRNA أو DNA ثم انقر فوق قياس على مدير عائد الاستثمار.
    4. وأخيراً، قم بتصفية قيم الكثافة هذه، وحساب الخلايا مع <6,000 كثافة الفلورة كخلايا غير متسربة وخلايا مع > 6,000 كثافة الفلورة كما transfected.

5. صورة FPs ترميز من قبل mRNAs الكهربائي

  1. اختيار الجنين الأكثر صحة وأفضل الكهربائي لتجارب التصوير الديناميكي بعد النظر في جميع الأجنة الكهربائي تحت منظار مجسم تشريح الفلورسنت.
    1. الاستمرار في احتضان الأجنة الكهربائية الأخرى والجنين غير الكهربائي (السيطرة السلبية) في حاضنة منفصلة أثناء تصوير الجنين المختار في حالة وفاة هذا الجنين أثناء التجربة.
  2. للتصوير الديناميكي، استخدم ثقافة جنين الطيور ذات التركيب الكامل كما سبق وصفهافي 24و25و26 مع مجهر مقلوب.
    ملاحظة:     تم تجهيز المجهر مع حاضنة على خشبة المسرح (انظر جدولالمواد) التي تحافظ على درجة الحرارة في 36 درجة مئوية أثناء التصوير. وقد لوحظ أثناء إعداد المجهر أن الأجنة الحاضنة عند 36 درجة مئوية تعيش لفترة أطول مما هي عليه في درجات حرارة أعلى، ربما لأن الليزر قد يسبب التدفئة المحلية على الجنين. يجب على القراء تحديد درجة حرارة الحضانة المثلى على خشبة المسرح لإعداد المجهر الخاصة بهم.
    1. صورة ديناميكية وتصور تكوين الجنين، وتنظيف الجنين الكهربائي لفترة وجيزة مع PBS لإزالة أي فقاعات قد تشكل على الجانب الدسير من الجنين أثناء عملية الكهربائي عن طريق تحريك الجنين حول استخدام ملقط في PBS نظيفة حل.
    2. ضع الجنين النظيف مباشرة على طبق تصوير يحتوي على طبق رفيع من الزلال-أجار (~ 150 ميكرولتر) مع التأكد من عدم توليد أي فقاعات على السطح الظهري للجنين22.
    3. لضمان البقاء على قيد الحياة للتصوير على المدى الطويل، إضافة قطعة رطبة صغيرة توالت المتابعة من ورقالأنسجة في الحواف الداخلية لطبق التصوير وختم الطبق باستخدام فيلم البارافين للحد من التبخر أثناء التصوير والحضانة.
    4. نقل هذا الطبق بسرعة إلى مرحلة ما قبل تسخين المجهر البؤري وتحديد موقع الصبغة الملونة في الجنين باستخدام قناة brightfield (PMT الليزر 20٪)، والتي تحدد المنطقة حقن والكهربائي.
  3. تعيين برنامج التصوير إلى الهدف المطلوب (10 أو 20X)، مرآة ثنائية الأبعاد (488 نانومتر لGFP نانومتر، 561 لRFP)، أطياف الانبعاثات (499-562 نانومتر لGFP، 570-695 نانومتر لRFP)، وبدوره على الليزر المناسب (488 نانومتر لGFP، 561 نانومتر لRFP).
    ملاحظة:     تمت ترجمة mRNA الكهربائي إلى بروتينات شوهدت في غضون 20 دقيقة (انظر الشكل3). وكانت البيانات الوصفية التصوير المستخدمة لمعظم الصور في هذه الورقة: مجهر مقلوب مع هدف 20X (انظر جدولالمواد)؛ بكسل يسكن الوقت، ~ 1.5 μs؛ يعني من 4-خط المسح الضوئي.
    1. انقر فوق Live على برنامج التصوير وضبط قوة الليزر إلى إعداد مناسب لشدة الفلورة اعتمادا ً على كل قوة ليزر مجهر. ابدأ بتصوير الجنين باستخدام قوة الليزر بنسبة 1%، وربح 800، وزيادة قوة الليزر ببطء بنسبة 1% حتى يتم رؤية البيكسلات المشبعة.
    2. اتبع هذا عن طريق خفض قوة الليزر قليلا حتى لا ينظر إلى بكسل المشبعة بعد الآن.
      ملاحظة: قد تكون قوة الليزر التي تم اختيارها لبداية جلسة تصوير الجنين جيدة لنقاط زمنية سابقة ولكنها ليست مثالية في نقاط وقت لاحق إذا أصبحت الفلورة في الخلايا أكثر إشراقاً أو باهتة مع مرور الوقت. ولمعالجة هذا الأمر، يمكنك تصوير الجنين في إعدادات طاقة أقل قليلاً في البداية لأن الخلايا الكهروية عادة ما تصبح أكثر إشراقاً خلال الساعات الست الأولى بعد الكهربة (انظر الشكل 3A-E للاطلاع على التحديد الكمي لزيادة الإشارة). إذا كانت الصور اللاحقة مشبعة، فاستمر في التصوير باستخدام إعدادات التصوير الأصلية، ولكن خذ صورة إضافية بعد ذلك مباشرة باستخدام إعدادات التصوير الأضعف (ثقب أصغر أو قوة ليزر أضعف).
    3. صورة الجنين كل 3-5 دقيقة من أجل تتبع هجرة الخلايا الفردية عبر نقاط زمنية مختلفة. لهذا العمل، كانت الصور z-مكدسات (~ 50 ميكرومتر سميكة) من المنطقة الكهربائية بأكملها، بالإضافة إلى بعض غرفة إضافية نحو الجزء السفلي من كومة z في حالة غرق الجنين في سرير أغاروز طوال جلسة التصوير.
    4. لاحظ مدى سرعة تحرك الخلايا عن طريق التحقق من النقاط الزمنية القليلة الأولى من الفيلم الأول. إذا كانت الخلايا تتحرك بمعدل سريع (بمعنى أنها سوف تخرج من منطقة المنطقة المصورة في غضون بضع نقاط زمنية إضافية)، والنظر في توسيع نطاق التكبير من المنطقة المصورة (1x à 0.8x) أو تصوير منطقة مختلفة.
      ملاحظة: المناطق الجنينية في منطقة pellucida تتحرك بسرعة أكبر بكثير من تلك الموجودة في منطقة opaca. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما تحتوي الأجنة الأصغر سناً (HH3، HH5) على خلايا تمر بحركة أسرع مقارنة بالأجنة القديمة (>HH7).
    5. بعد تصوير المنطقة الكهربائية للجنين، صورة منطقة غير كهربائية من نفس الجنين لتحديد مستويات الفلورة الذاتية (يجب أن تكون ضئيلة إذا تم استخدام قوة الليزر المنخفضة <10٪ لتصوير الجنين).

6. الفلورة الانتعاش بعد تبييض الصور (FRAP) لـ Asay mRNA النزاهة

ملاحظة: يمكن استخدام الانتعاش الفلوري في الجسم الحي بعد حقن الصور (FRAP) لتحديد المدة التي يمكن أن تترجم فيها mRNA المنقولة إلى FPs. يحدد البروتوكول التالي تجربة FRAP للكشف عن نصف عمر H2B. السترين ميرنا في جنين كهربائي.

  1. إجراء تجارب FRAP على المجهر المقلوب باستخدام هدف 20x 0.8 NA وفتح ثقب مفتوح تماما.
    1. بعد التأكد من الكهربائي من H2B-السترين على المجهر المجسم ووضع الجنين على مرحلة ما قبل ساخنة على المجهر البؤري المقلوب (انظر الخطوة 5.2.4)، تبييض الصور معظم الفلورة الخلوية من H2B-السترين في مجموعة متنوعة من الوقت نقاط (45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ح بعد الكهربائي) باستخدام الليزر 405 نانومتر مع قوة الليزر 70٪، 100 التكرارات، سرعة المسح الضوئي 4، مما يترك فقط 5٪ من الفلورة المتبقية.
      ملاحظة: وينبغي أن تستغرق هذه العملية بضع دقائق.
    2. الاستمرار في احتضان الأجنة على خشبة المسرح في 36 درجة مئوية بعد تبييض الصور.
  2. تأكد من الانتباه إلى تقسيم الخلايا بنشاط داخل المنطقة ذات التبييض الضوئي، والتي تشير إلى أن الخلايا المبيضة ضوئيا لم يمت تماما بعد العلاج.
  3. الحصول على صور ما بعد التبييض (z-مكدسات من المنطقة الكهربائي) لمدة تصل إلى 30 دقيقة على فترات زمنية منتظمة (3 أو 5 دقائق) باستخدام المجهر البؤري.
    ملاحظة: إذا كان متوفراً، استخدم خط H2B-XFP المعدل وراثياً كتحكم إيجابي لضمان بقاء الخلية في المنطقة ذات التبييض الضوئي. يجب أن ينخفض معدل استرداد الفلورة لFP المشفرة بواسطة mRNA الكهربائي، ولكن أن FP ترميز عن طريق transgene ينبغي أن تبقى متسقة طوال الفيلم بأكمله.
  4. للتأكد من أن ظروف التصوير لا تؤثر بشكل محذف على بقاء الجنين، في نفس الوقت احتضان الأجنة الكهربائية التي لا تبيض ضوئيا، والتي قد تكون بمثابة عنصر تحكم في التصوير.
  5. لتكميم نتائج ابيضاض الصور لتسوس mRNA بعد الكهربة، وتتبع الفلورة الخلية مع مرور الوقت (3 أو 5 دقائق) عن طريق قياس شدة الفلورة للمركز (دائرة 7.5 ميكرومتر) من كل خلية باستخدام ImageJ. قياس هذا لجميع الخلايا داخل المنطقة الضوئية التي لا تخضع للميثوس وقد تم تبييضها تماما.
    ملاحظة: النظر في حذف الخلايا الميتوتيكية من الكم منذ النوى الميتوتيكية لديها الفلورة أقوى من النوى بين المراحل بسبب تكاثف الكروماتين.
  6. رسم كثافة الفلورة مع مرور الوقت بعد التبييض في مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية (45 دقيقة، 2 ساعة، و 5 ح).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA الكهربائي هو أكثر كفاءة من الكهرباء الحمض النووي

استخدمنا pCS2 +. H2B-السترين لإعداد في المختبر منقولة mRNA. وبما أن الإلكتروبورات الحمض النووي عادة ما يتم تنفيذها عند 1-2 ميكروغرام/ميكرولتر، استخدمنا تركيز ًا متساويًا من mRNA (محسوبًا على أنه حوالي 0.25-0.5 ميكروغرام/ميكرولتر لـ H2B-Citrine) للكهرباء mRNA. اختبرنا أولا كفاءة الكهربائي من pCS2 +. H2B-السترين الحمض النووي مقارنة مع H2B-سيترين ميرنا (في المخت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، قدمنا تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية الحقن المجهري على وجه التحديد وmRNA الكهربائي في خلايا أجنة السمان الغاز. لقد أثبتنا أن الكهربة المركبة في المختبر تسمح بالتعبير السريع والفعال عن بروتينات الفلورسنت (FPs) في أجنة السمان الغازية(الشكلان 2 و3). ويمكن الكشف عن الفلورة من بروتين H2B-السترين المترجمة من mRNAs الكهربائي عن طريق الفحص المجهري البؤري في غضون حوالي 20 دقيقة وزيادة في الفلورة FP لساعات (الشكل3، الفيلم التكميل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح ليعلنوا عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ديفيد هاس على أفكاره المفيدة في هذا العمل. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة روز هيلز زمالة البحوث الصيفية (2016-2018) وزمالة البحوث تحت التخرج USC لM.T.، وجائزة التدريب الداخلي معهد سابان للبحوث ما قبل الدكتوراه إلى دكتوراه، وجامعة جائزة برنامج شركاء البحوث الجامعية في جنوب كاليفورنيا إلى R.L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BamHI-HFNew England BiolabsR3136L
BglIINew England BiolabsR0144S
BsrG1-HFNew England BiolabsR3575S
NotI-HFNew England BiolabsR3189L
SalI-HFNew England BiolabsR3138L
الفينول: الكلوروفورم: إيزواميل كحولثيرمو فيشر15593031
SP6 mMessage Machine في مجموعة النسخ المختبريThermo FisherAM1340
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Triton X-100Sigma Aldrich934434- (1،1،3،3-Tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول ، t< / em>-Octylphenoxypolyethoxyethanol، بولي إيثيلين جلايكول tert< / em>-octylphenyl ether
DAPISigma AldrichD95422- (4-Amidinophenyl) -6-indolecarbamidine dihydrochloride ، 4 & prime ؛ ، 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride ، DAPI dihydrochloride
ورق ترشيح Whatman No.1Sigma AldrichWHA1001125
glycerolSigma AldrichG9012
UreaSigma Aldrich51457
pmTurquoise2-GolgiAddgene36205pmTurquoise2-Golgi كانت هدية من Dorus Gadella (Adgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID: Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeActNat. طرق 2008 ؛ 5: 605-7. معرف PubMed: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFPAddgeneكانت هذه الورقة
pCS.H2B-citrineAddgene53752pCS-H2B-citrine هدية من Sean Megason (Adgene plasmid # 53752 ؛ http://n2t.net/addgene:53752 ؛ RRID: Addgene_53752)
pCS.memb-mCherryAddgene# 53750pCS-memb-mCherry كانت هدية من Sean Megason (بلازميد Addgene # 53750 ؛ http://n2t.net/addgene:53750 ؛ RRID: Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 المجهر المقلوبCarl Zeiss Microscopy GmbHLSM-780 هو مجهر متحد البؤر ومتعدد الفوتون يوفر الحساسية المطلوبة لأعمال التصوير الحيوية. مزود بمرحلة آلية ، وجهاز ضبط تلقائي للصورة ، وحاضنة تعتيم كاملة على المسرح ، يعد 780 مجهرا ممتازا لتصوير الخلايا الحية / الأجنة المتطورة. يسمح كاشف Quasar عالي الحساسية ذو 32 قناة بالتصوير الطيفي ، والفك الخطي ، والحصول على عدد ألوان مرتفع (>4) للصور. يمكن إجراء الإثارة باستخدام 6 خطوط من ليزر الفوتون الفردي (405 و 458 و 488 و 514 و 564 و 633 نانومتر) ، ليزر الحرباء (متماسك) ثنائي الفوتون (يتراوح من 690 نانومتر إلى 1000 نانومتر) ، ويعمل باستخدام برنامج نظام ZEN 2011 SP7 (Black).
CUY-21 تحرير في الجسم الحي الكهربائيةBex Co.، Ltd.
القطب الكهربائي المربع المسطح البلاتيني ، طول الجانب 5 ممBex Co.، Ltd.LF701P5E
أوليمبوس MVX10 FL مجهر ستيريوأوليمبوس لايف ساينس
XM10 كاميرا أحادية اللونأوليمبوس لايف ساينس
<قوي > محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لهيدروكلوريد الهيدروجين (10 مرات ؛ ، درجة الحموضة 7.4) < / قوي>لتحضير 1 لتر من محلول مخزون 10 مرات ، امزج 80 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich S3014) ، 2 جم من KCl (Sigma-Aldrich P9541) ، 11.4 جم من Na2HPO4 (اللامائية; Sigma-Aldrich S3264) ، و 2.7 جم من KH2PO4 (اللامائية; سيجما ألدريتش ص 9791). اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، واجعل الحجم النهائي يصل إلى 1 لتر باستخدام H2O فائق النقاء. تجنب استخدام CaCl2 و MgCl2 في PBS ل HCR. من المهم أن يتم تحضير PBS ل HCR كمحلول خال من RNase (على سبيل المثال ، عن طريق معالجة ثنائي إيثيل بيروكربونات [DEPC]).
1.37 م كلوريد
27 ملي مولار KCl
80 ملي Na2HPO4< / sub> 20 mM KH2PO4
PBS/Tritonإضافة 1 مل من Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) و 100 مل من 10 & مرات ؛ PBS إلى 890 مل من H2< / sub>O. قم بتصفية المحلول من خلال 0.2 & mu ؛ م تصفية وتخزينها في 4؟ ج حتى الاستخدام.
1 & مرات ؛ محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (معالج ب DEPC ؛ درجة الحموضة 7.4)
0.1٪ تريتون X-100
الصوديوم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal. 1 (7), 841-845 (1982).
  2. Potter, H. Electroporation in biology: methods, applications, and instrumentation. Analytical Biochemistry. 174 (2), 361-373 (1988).
  3. Shillito, R. D., Saul, M. W., Paszkowski, J., Muller, M., Potrykus, I. High-Efficiency Direct Gene-Transfer to Plants. Bio-Technology. 3 (12), 1099-1103 (1985).
  4. Cui, C., Rongish, B., Little, C., Lansford, R. Ex Ovo Electroporation of DNA Vectors into Pre-gastrulation Avian Embryos. CSH Protocol. 2007 (24), 4894(2007).
  5. Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos. Nature Protocol. 3 (3), 419-426 (2008).
  6. Voiculescu, O., Stern, C. D. Manipulating Gene Expression in the Chick Embryo. Methods Molecular Biology. , 105-114 (2017).
  7. Chuai, M., et al. Cell movement during chick primitive streak formation. Developmental Bioliogy. 296 (1), 137-149 (2006).
  8. Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Developmental Dynamics. 229 (3), 433-439 (2004).
  9. Momose, T., et al. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 41 (3), 335-344 (1999).
  10. Nakamura, H., Watanabe, Y., Funahashi, J. Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation. Developmental, Growth and Differentiation. 42 (3), 199-201 (2000).
  11. Teddy, J. M., Lansford, R., Kulesa, P. M. Four-color, 4-D time-lapse confocal imaging of chick embryos. Biotechniques. 39 (5), 703-710 (2005).
  12. Green, M. R., Maniatis, T., Melton, D. A. Human beta-globin pre-mRNA synthesized in vitro is accurately spliced in Xenopus oocyte nuclei. Cell. 32 (3), 681-694 (1983).
  13. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology. 770, 55-75 (2011).
  14. Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nature Methods. 13 (5), 446-452 (2016).
  15. Bugeon, S., et al. Direct and efficient transfection of mouse neural stem cells and mature neurons by in vivo mRNA electroporation. Development. 144 (21), 3968-3977 (2017).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes and Development. 8 (12), 1434-1447 (1994).
  18. Krieg, P. A., Melton, D. A. Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs. Nucleic Acids Research. 12 (18), 7057-7070 (1984).
  19. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  20. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: a complementary normal table and a new look at the first stage of the development of the chick. I. General morphology. Developmental Biology. 49, 321-337 (1976).
  21. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3-15 (2010).
  22. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Developmental Dynamics. 220 (3), 284-289 (2001).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neurosciences. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. New, D. A new technique for the cultivation of the chick embryo in vitro. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3, 320-331 (1955).
  25. Drake, C. J., Davis, L. A., Hungerford, J. E., Little, C. D. Perturbation of beta 1 integrin-mediated adhesions results in altered somite cell shape and behavior. Developmental Biology. 149 (2), 327-338 (1992).
  26. Sato, Y., et al. Dynamic analysis of vascular morphogenesis using transgenic quail embryos. PLoS ONE. 5 (9), e12674(2010).
  27. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).
  28. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Golgi polarity does not correlate with speed or persistence of freely migrating fibroblasts. European Journal of Cell Biology. 88 (12), 711-717 (2009).
  29. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Garland Science. (2007).
  30. Arndt-Jovin, D. J., Jovin, T. M. Fluorescence labeling and microscopy of DNA. Methods Cell Biol. 30, 417-448 (1989).
  31. Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. Luminescence digital imaging microscopy. Annu Rev Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).
  32. Heikal, A. A., Hess, S. T., Baird, G. S., Tsien, R. Y., Webb, W. W. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proceedings of the National Academy of Science U S A. 97 (22), 11996-12001 (2000).
  33. Iizuka, R., Yamagishi-Shirasaki, M., Funatsu, T. Kinetic study of de novo chromophore maturation of fluorescent proteins. Analytical Biochemistry. 414 (2), 173-178 (2011).
  34. Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mechanism of Development. 121 (9), 1137-1143 (2004).
  35. Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Developmental Biology. 233 (1), 13-21 (2001).
  36. Meyer, S., Temme, C., Wahle, E. Messenger RNA turnover in eukaryotes: pathways and enzymes. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 39 (4), 197-216 (2004).
  37. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review in Genetics. 50, 235-266 (2016).
  38. Harland, R., Misher, L. Stability of RNA in developing Xenopus embryos and identification of a destabilizing sequence in TFIIIA messenger RNA. Development. 102 (4), 837-852 (1988).
  39. Lippincott-Schwartz, J. The long road: peering into live cells. Nature Cell Biology. 12 (10), 918(2010).
  40. Sato, Y., Lansford, R. Transgenesis and imaging in birds, and available transgenic reporter lines. Development Growth & Differentiation. 55 (4), 406-421 (2013).
  41. Goldman, R. D., Spector, D. L. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

mRNA ElectroporationAvian EmbryosFluorescent ProteinsProtein ExpressionConfocal MicroscopyPhotobleaching AssayTransfection EfficiencyEmbryo ImagingQuail EmbryosDynamic Imaging

Related Articles