نموذج قوي المستحثة التي يسببها اللثة Murine لتقييم العدلات عن طريق الفم

مرض اللثة (PD) هو شرط العظم المرتبطة بالاعتلال المضيف كبيره والعبء الاقتصادي ، والذي يتجلى من التهاب اللثة وفقدان كل من مرفق الانسجه الرخوة والدعم العظمي للأسنان المتضررة^1،2،3،4. وتخضع هذه العملية للتفاعلات بين الميكروبات الفموية والجهاز المناعي الفطري للمضيف. ويرتبط أيضا مع تفاقم الامراض التهابيه الجهازية الأخرى بما في ذلك مرض السكري, امراض القلب والاوعيه الدموية, والسرطان^5,6,7,8. تاريخيا, كان الافتراض ان المرض PD يعتمد علي كميات كبيره من البكتيريا المحددة مثل البوررومناس اللثة⁹. ومع ذلك ، تشير الادله الاخيره إلى ان العنصر الميكروبي من PD هو توسط من قبل biofilm الأسنان. و بيوفيلم هو مجتمع منظم ومعقد من الكائنات المجهرية العديدة التي يمكن ان توجد في التكافلية الصحية والمدمرة dysbiotic الدول^10,11. بيوفيلم عن طريق الفم عاده ما يتيح المقاومة للمضيف من خلال منع إنشاء بؤر البكتيريا المسببة للامراض ويعزز هيكل الانسجه اللثة المثالي ووظيفة من خلال تنظيم استجابه المناعي المضيف^12,13. اضطرابات العلاقة التوازن بين الكائنات الحية المعلقة داخل تجويف الفم والجهاز المناعي المضيف قد يؤدي إلى تغييرات في التوازن الانسجه ، مما ادي إلى دسباقتريوز وتطوير السمات المميزة السريرية والشعاعية من PD^{5،10،12،13،14}.

ومن المثير للاهتمام ، وإنشاء دسباقتريسيس عن طريق الفم ، في حين المطلوبة للشروع في PD ، ليست كافيه لدفع PD في جميع الافراد ، التملص نحو قدره الاستجابة المناعية المضيف لتخريب الانتقال من الجراثيم بين التكافلية والدول dysاحيائي¹⁵. هذا يسلط الضوء بشكل خاص علي الوسائل التي من خلالها التاثيرات PD واحده من الشخصيات الرائدة في الجهاز المناعي الفطري ، وهي الحبيبية الكريات^السبع(pmn) ، أو العدلات ، من منظور المحلية والجهازية^16،17.

في البشر ، يتم تجنيد PMNs من الدورة الدموية بمعدل ~ 2 × 10⁶ خلايا/ساعة في الانسجه الضامة الصحية اللثة ، حيث هم السكان الكريات البيضاء المهيمنة. هنا ، يتم طردهم في وقت لاحق من التلم اللثة في تجويف الفم كعنصر من السائل كريفيكولار اللثة. في وجود PD ، يظهر العدلات داخل الدورة الدموية وتجويف الفم ، حيث تمتلك هذه الخلايا المستجيبة النمط الظاهري التهابي المفرط الذي يؤدي إلى تدمير المذكورة أعلاه من دواعم السن^{17،18،19،20،21،22}. لذلك ، فهم دور PMNs في PD وغيرها من الظروف التهابيه الجهازية ذات اهميه قصوى.

وعلي الرغم من انه من المقبول علي نطاق واسع ان الامراض المزمنة ترتبط ارتباطا متبادلا بالشرطة العامة ، فان أليات الاساسيه لم يتم توضيحها بعد ، مما أسهم في صعوبات في أداره هذه الظروف الجهازية المرضية والتي يحتمل ان تكون مميته. نماذج الحيوانية التجريبية متعددة, كل مع مزايا فريدة من نوعها وعيوب, وقد استخدمت لدراسة الفيزيولوجيا المرضية من PD^23,24. التركيز بشكل خاص علي نماذج murine ، وهناك مجموعه متنوعة من البروتوكولات التي من خلالها يتم تسهيل دراسة PD ؛ ومع ذلك ، فانها تمتلك العديد من العيوب التقنية والفسيولوجية^{25،26،27،28،29،30،31}.

أولا ، يتطلب نموذج الماوس أنبوبي عن طريق الفم العديد من التطعيمات عن طريق الفم من مسببات الامراض اللثة البشرية لتوليد التهاب اللثة وفقدان العظام. بالاضافه إلى ذلك ، فانه عاده ما تسبقه فتره من العلاج بالمضادات الحيوية لتخريب النباتات الفموية المعلقة التي تمت²⁵. هذا النموذج غالبا ما يتطلب التدريب المتخصصة لأداء بأمان gavage عن طريق الفم, يستخدم سوي جزء صغير من مسببات الامراض اللثة من ميكروبيوم الإنسان الأكثر تعقيدا, ويتطلب عده أشهر لتاسيس فقدان العظام السنخيه.

وعلي النقيض من ذلك ، تستخدم نماذج murine المستحثة كيميائيا التسليم عن طريق الفم من حمض السلفونيك trinitrobenzene (TNBS) أو الصوديوم كبريتات ديكسكان (مفاجات صيف دبي) ، وكلاء تستخدم عاده في إنشاء نماذج murine من التهاب القولون علي مدي فتره عده أشهر للحث علي فقدان العظام اللثة²⁶. النماذج القائمة علي الخراج في الفم وخارج الفم متاحه ، والتي تنطوي علي القواطع murine والانسجه من ظهر فضلا عن calvarium ، علي التوالي. في نموذج الخراج السابق ، تدار عده حقن من البكتيريا ، وخلق الخراجات اللثة متعددة وندره فقدان العظام السنخيه ، والحد من استخدامها في دراسة PD. نماذج الخراج الاخيره هي أكثر بكثير عرضه لدراسة ضراوة البكتيرية ، والتهاب ، وارتشاف العظام في مواقع خارج تجويف الفم ، والذي يلغي تقييم دواعم الأسنان والفم الميكروبيوم^{27،28،29،30،31}.

باستخدام نموذج التي يسببها الاربطه من التهاب اللثة ، وقد تم عاده تثبيت خياطه الحرير مضفر حول المولي الثاني. كبديل ، يمكن ادراج قطعه خطيه واحده من المواد خياطه بين الاولي والثانية أضراس^32،33. الهدف من وضع الاربطه هو تسهيل تراكم البكتيريا وتوليد ديسبيوسيس داخل sulci اللثة ، مما ادي إلى التهاب الانسجه اللثة وتدمير الانسجه التي تتكون من دواعم الأسنان. والاهم من ذلك ، هذا النموذج قادر علي إنتاج أكبر بكثير من فقدان العظم السنخيه بالمقارنة مع نموذج أنبوبي الشفوي الأكثر استخداما³⁴. زيادة تعقيد استخدام نموذج أنبوبي عن طريق الفم هو المقاومة الطبيعية من قبل عده سلالات من الفئران (اي ، C57BL/6) لتطوير فقدان العظام السنخيه. هذا هو أيضا إشكاليه, كما ان هذه السلالة هي الأكثر استخداما في البحوث الحيوانية المستندة إلى murine³⁵.

وقد وضعت الإجراءات القائمة التي وصفتها مارتشيسان وآخرون ، وابي وهاجيشينليس لتبسيط القانون التقني الذي يضع الحروف^33،36. ولسوء الحظ ، يتطلب البروتوكول السابق معدات متخصصة مطبوعه بالابعاد الثلاثية ولديه القدرة علي فقدان الاربطه المبكرة ، مما يزيد من استخدام الماشية والتكاليف المرتبطة بالوقت الإضافي الذي يقضيه في غرفه العمليات. وعلاوة علي ذلك ، كلا البروتوكولين توليد مناطق صغيره فقط من دواعم الأسنان المريضة المتاحة للدراسة.

وترتكز المزايا التي تكمن في هذه التقنية علي الدراسة المتزامنة لتشوات الفم والمناعة التي تحكم دواعم اللثة ، واستخدام الماشية منخفضه التكلفة ذات الخلفيات الوراثية المتنوعة ، والممارسات البسيطة للإسكان والتربية. وعلي هذا النحو ، ينبغي ان تكون الأهداف هي تعظيم حجم الانسجه المريضة ، وفي محاولة لممارسه مبادئ الحد من البحوث الحيوانية ، خفض الاستهلاك الحيواني إلى مستوي منخفض قدر الإمكان. وهذا يتطلب ضمان ان جميع الكائنات أليفه قادره علي الادراج في التحاليل التجريبية³⁷. ومع ذلك ، تجدر الاشاره إلى انه بغض النظر عن النموذج الحيواني من الامراض اللثة يتم استخدامها ، لا يوجد نموذج واحد الذي يشمل كل عنصر من عناصر الفيزيولوجيا المرضية PD البشرية.

يستخدم هذا البروتوكول الجديد وضع الربط حول أسنان الفك العلوي متعددة باستخدام الاجهزه والمواد الموجودة داخل معظم المختبرات. فانه يسمح كميه كافيه من الوقت لتثبيت بسهوله وبثقة الاربطه التي من غير المرجح ان تقطع قبل الأوان. وأخيرا ، كما يقدم PMNs تنسيق تدمير دواعم الأسنان في PD ، يتم أيضا تقديم منهجيه جديده لاستعاده العدلات عن طريق الفم بطريقه مماثله للبشر.

وقد امتثلت جميع الدراسات المتعلقة بالmurine للوائح الاخلاقيه ذات الصلة ووافقت عليها لجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه تورنتو ومجلس أخلاقيات البحوث (البروتوكول 20011930).

1. تركيب الاربطه

ملاحظه: هذا هو اجراء العمليات الجراحية غير معقمه التي يمكن القيام بها في مسرح التشغيل القياسية. استخدام الكائنات الخالية من الجراثيم (غير مغطاه هنا) ولايات التعامل داخل مجلس السلامة البيولوجية ، واستخدام الاداات العقيمة ، والتلقيح من تجويف الفم مع مسببات الامراض اللثة للتسبب في المظاهر السريرية للتهاب اللثة.

1. أداره التخدير داخل الصفاق إلى 8 – 12 من العمر الذكور C57BL/6 الفئران ، والتي ينبغي ان يتاقلم إلى مرفق الإسكان الخاصة بهم ، وذلك باستخدام 0.5 "26 G العقيمة ابره المعقمة و 1 مل حقنه وفقا لمؤسسه الرعاية الحيوانية المعتمدة والمبادئ التوجيهية لجنه الاستخدام (IACUC).
   ملاحظه: مزيج من الكيتامين (100 ملغم/كغ) و اكسيليازين (10 مغ/كغ) التخدير بسرعة ويؤدي بشكل موثوق المستوي المناسب من التخدير لمده الاجراء.
2. تقييم عمق التخدير قبل وكل 15 دقيقه خلال العملية كما يتضح من فقدان منعكس دواسة.
3. ضع الماوس علي منصة جراحيه ساخنه (الشكل 1ا). تثبيت فك والفك السفلي في موقف مفتوح باستخدام عصابات مرنه ودعم الرقبة مع لفه من القطن للمساعدة في الحفاظ علي فك في اتجاه أفقي أكثر (الشكل 1ب). تغطيه الجسم والذيل من الحيوانية للتخفيف من فقدان الحرارة اثناء العملية.
4. وضع المجهر الجراحي في التكبير المطلوب والاضاءه (إذا لم شنت مباشره إلى المجهر) علي تجويف الفم لتصور الأسنان. في حين ان التكبير المطلوب يعتمد علي المشغل ، يتم الحصول علي التصور الأمثل لتجويف الفم في 16x.
5. تثبيت العقيمة 5-0 الحرير مضفر خياطه حول الاولي (M1) والثانية (M2) الفك العلوي المتعفنة داخل التلم اللثة باستخدام ملقط شظية.
   ملاحظه: يمكن استخدام الغرز الحريرية مضفر من قياس أصغر لهذا الغرض لتسهيل التثبيت بشكل أسرع والحد من امكانيه تلف الانسجه الرخوة ايتروغينيك.
   1. ضع الذيل البعيد للخياطة علي الجانب الشاحب من العاج وادخل الجزء القريب بين الاتصال M2 و M3 (الشكل 2ا).
   2. التفاف خياطه حول سطح شدق من m2 وادراجه بين الاتصال من M1 و m2. تاكد من ان كلا طرفي الخياطة يتم سحبهما باحكام لدفع الغرز إلى اللثة وأزاله كل الركود (الشكل 2ب).
   3. التفاف الجزء خياطه القريبة حول M1 ، تحت ارتفاعه من كفاف ، وادراجه بين الاتصال من M1 و M2. سحب الذيل القريب من خياطه باحكام لدفع خياطه في التلم اللثة وأزاله كل الركود (الشكل 2ج).
      ملاحظه: إذا لوحظت المقاومة عند ادراج الخياطة بين M1 و M2 أو M2 و M3 ، قد يكون الاتصال مفتوحا قليلا باستخدام مستكشف الأسنان القياسية.
   4. ربط نهايات خياطه مع عقده الجراح وتقليم ذيول قصيرة قدر الإمكان. وضع عقده في اللثة كوة بين M1 و M2 علي الجانب حنكي من الأسنان الفك العلوي (الشكل 2د).
      ملاحظه: الخطوات 1-4-1-1.4.4 يمكن تكرارها علي الجانب المعاكس ، إذا لزم الأمر.
   5. تعقيم الاداات الجراحية في الزجاج الساخن حبه معقم بين كل موضوع الحيوانية.
      تحذير: نصائح الملقط حاده للغاية ويمكن ان تسبب بسهوله الصدمات الفموية والنزيف الكبير. اعداد شرائح صغيره من الشاش لأزاله الدم من تجويف الفم وممارسه الضغط علي الجروح النزيف بنشاط.
6. بعد تركيب الاربطه ، وأزاله الماوس من الجهاز الجراحي ، ووضع في قفص نظيف تحت مصباح الحرارة ورصد حتى تعافي تماما.
7. المنزل بشكل فردي كل الماوس مع إثراء البيئية المناسبة والسماح حسب الإعلان الوصول إلى المياه المصفاة والمهروسة القياسية تشاو في بيئة الحرارة والرطوبة التي تسيطر عليها (12-h ضوء/12-h دوره الظلام) لمده 7-11 يوما.
   ملاحظه: الطعام المهروس يقلل من القوات اللازمة للمصريب التالي تقليل الم المرتبطة بالتغذية ، ويساعد في منع الفقدان المبكر للربطة المثبتة.

2-جمع العينات

1. الفئران موت ببطء وفقا للمبادئ التوجيهية المعتمدة IACUC.
   ملاحظه: القتل الرحيم الفردية باستخدام غرفه₂ CO متبوعا خلع عنق الرحم هو الأسلوب المفضل لهذا البروتوكول. قد يتم تغيير هذا اعتمادا علي التجارب التي تتطلب حصاد انسجه اضافيه.
2. باستخدام ماصه ، شطف علي الفور تجويف الفم مع 100 μL من تعقيم 4 درجه مئوية 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) دون الكالسيوم والمغنيسيوم لمده 10 ليالي.
3. كرر الخطوة 2.2 2x ووضع كل شطف في واحد 15 مل مخروطي أنابيب البولي بروبيلين العقيمة اختبار.
4. نقل المحتويات إلى 50 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه عن طريق تشغيلها من خلال فلتر شبكه نايلون 40 μm.
5. نقل هذه المحتويات إلى 15 مل البولي بروبيلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه.
   ملاحظه: النقل النهائي للعينه إلى أنبوب أصغر يسمح لتحسين التصور من بيليه الخلوية في الخطوات القادمة.
   1. إذا رغبت في ذلك ، وأزاله الاربطه المولي (ق) ومكان في 300 μL من تعقيم 1x تلفزيوني (4 درجه مئوية ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم) في منفصلة 15 مل البولي بروبلين المخروطية أنبوب اختبار معقمه. التحريض بلطف وأزاله خياطه من الأنبوب. يتم التعامل مع هذه العينة بشكل مطابق لعينه شطف عن طريق الفم من هذه النقطة إلى الامام.
6. أضافه 33.3 μL من 16 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) لتسهيل تثبيت العينة.
7. دوامه العينات علي الفور واحتضان علي الجليد لمده 15 دقيقه.
8. ملء أنبوب إلى 15 مل مع 1x تلفزيوني لتمييع PFA ، ثم أجهزه الطرد المركزي في 1000 x g و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
9. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 1 مل من الفرز الخلية المنشطة مضان (facs) المخزن المؤقت في 4 درجه مئوية. عد الخلايا علي مقياس الكريات الدموية أو عداد الخلايا المؤتمت.
10. الطرد المركزي العينة مره أخرى في 1000 الإطار الإقليمي و 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
11. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مناسب من المخزن المؤقت facs للتركيز النهائي من 0.5-1.0 x 10⁶ خلايا/50 μl من المخزن المؤقت facs.

3. تلطيخ الأجسام المضادة لتحليل تدفق الخلوي

ملاحظه: التسمية والبرد جميع أنابيب FACS المطلوبة قبل الاستخدام.

1. أضافه 1 μL من مصل الفئران و 2 μL من مكافحه الماوس الأجسام المضادة مفتش إلى 50 μL من العينة ، دوامه فورا ، وكتله علي الجليد لمده 20 دقيقه.
2. أضافه الأجسام المضادة المناسبة لكل عينه ، دوامه فورا ، واحتضان علي الجليد لمده 30 دقيقه في الظلام.
   ملاحظه: اختيار واحجام الأجسام المضادة تعتمد علي التجارب التجريبية الأمثل السابقة مصممه خصيصا لهذه التقنية المحددة.
3. غسل عينات مع 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، vortexing لفتره وجيزة و يطرد لمده 5 دقائق في 1000 x ز و 4 درجه مئوية. كرر هذه الخطوة 2x.
4. أعاده التعليق عينات في 250 μL من المخزن المؤقت FACS ، وتغطيه أنابيب مع فيلم البارافين ، التفاف في رقائق ألومنيوم ، وعقد في 4 درجه مئوية حتى التحليل.
   ملاحظه: وهو مثالي لتحليل العينات في غضون ساعات من إكمال البروتوكول بسبب فقدان اشاره الفلورسنت خلال فترات طويلة من التخزين. ومع ذلك ، يمكن تحليل عينات 2-3 أيام في وقت لاحق إذا لزم الأمر علي الإطلاق.

ممثل تدفق البيانات الخلوية من عينات شطف عن طريق الفم من ساذج (الشكل 3ا) وملتهبة (الشكل 3ب) murine تجويف الفم الثانوية للتهاب اللثة المستحثة التي يسببها. كما يظهر استرداد PMNs من الاربطه المثبتة (الشكل 3ج). تم معايره الفولتية تدفق القناة الخلوية يدويا ، وتم اجراء التعويض مع حبات التعويض الملون واحد. تم تعريف PMNs كLy6G + veF4/80-ve باستخدام استراتيجية النابضة المبينة38. تم الحصول علي الحد الأدنى من الاحداث PMN بوابات 500 من كل شطف عن طريق الفم وعينه الاربطه. وقد تقرر ان تكون القدرة علي البقاء PMN حوالي 37 ٪ من التلطيخ الأزرق التريان. الصور التمثيلية لمستويات العظام السنخيه مقيسة من قمة العظم السنخي (ABC) إلى تقاطع السيمينمينا (CEJ) للصحة (الشكل 4ا) والفئران المركبة (الشكل 4ب). وترد الفروق النسبية بين هذه القياسات (الشكل 4ج).

الشكل 1: تحديد مواقع الحيوانية لربط المولي. (ا) يتحقق الوصول إلى تجويف الفم عن طريق عقد الفك السفلي في وضع الاكتئاب عن طريق وضع الجر خفيفه علي الفكي والفك القاطعة الأسنان. (ب) يتم وضع الشاش تحت الجمجمة لمنع حركه الراس ووضع فك في وضع أفقي نسبيا. يتم تغطيه الجسم والذيل لمنع فقدان الحرارة قبل تحريك المرحلة الجراحية تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: صوره متسلسلة لتركيب الاربطه. (ا) يتم وضع الذيل البعيد للخياطة علي الجانب الشاحب من الأسنان ، ويتم ادراج الجزء القريب بين الاتصال من M2 و M3. (ب) ثم يتم التفاف خياطه حول سطح البوق من m2 ثم ادراجها بين الاتصال من M1 و m2. (ج) يتم التفاف قطعه الخياطة القريبة حول m1 تحت ارتفاع كفاف ثم ادراجها بين الاتصال من M1 و M2. (د) يتم ربط نهايات خياطه مع عقده الجراح وقلصت أقرب ما يمكن إلى عقده. يتم وضع عقده في اللثة كوة بين M1 و M2 علي الجانب حنكي من الأسنان الفك العلوي. تم الحصول علي جميع الصور علي تشريح فك لتسجيل الخطوات الاجرائيه مع وجهه نظر دون عائق من الأسنان المولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: المؤامرات التمثيلية واستراتيجية الصب التي تظهر وجود العدلات عن طريق الفم. تم انتشال العدلات من العينات التالية وتقييمها بواسطة قياس التدفق الخلوي: (ا) الشطف عن طريق الفم من فاره ساذجه ، (ب) شطف عن طريق الفم ، و (ج) الحروف المركبة المسترجعة من الفاره مع التهاب اللثة المستحث بالاربطه (ثنائيا). وتظهر المؤامرات التمثيلية استراتيجية الصب. الsinglets (SSC-H x SSC-W و FSC-H x FSC-W) و العدلات (Ly6G + ve/f480-ve) كانت بوابات كما هو مبين. وتعكس القيم العددية النسبة المئوية للخلايا داخل كل بوابه. SSC-A = منطقه مبعثر الجانب ؛ SSC-W = عرض الجانب مبعثر; SSC-H = ارتفاع مبعثر الجانب; FSC-A = منطقه مبعثر إلى الامام. FSC-W = عرض مبعثر إلى الامام; FSC-H = ارتفاع مبعثر إلى الامام. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الاختلافات في فقدان العظم السنخي بين التحكم والربط بين الماشية. الصور التمثيلية التي تبين الاختلافات في فقدان العظم السنخي بين (ا) التحكم و (ب) الفئران ligated. (ج) يتم عرض القياسات من تقاطع المركز (cej) إلى قمة العظم السنخي (ABC) ، إلى جانب زوايا الخط المسمارية والمنتفخة من M1 و M2 (يعني ± SEM ، n = 3). تم تحديد قيم P بواسطة ANOVA ثنائيه الاتجاه مع اختبار LSD لما بعد المخصص. (* p < 0.01 ؛ * * p < 0.001 ؛ * * * p < 0.0001). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.