يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية

29.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59683

⸱

يوليو 1, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine, 2Division Experimental Retinal Therapies, Department of Clinical Sciences and Advanced Medicine, University of Pennsylvania School of Veterinary Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا التقرير الطرق الشاملة لإعداد أقسام شبكية العين المجمدة للكيمياء المناعية (IHC). وتشمل الأساليب الموصوفة تشريح كوب العين الخلفي، تثبيت البارافورمالديهايد، وتضمينها في درجة الحرارة القطع الأمثل (OCT) وسائل الإعلام واتجاه الأنسجة، وتقسيم ومناعة.

الملخص

يعد إعداد أقسام عين الفأر عالية الجودة للكيمياء المناعية (IHC) أمرًا بالغ الأهمية لتقييم بنية شبكية العين ووظيفتها وتحديد الآليات الكامنة وراء أمراض الشبكية. الحفاظ على السلامة الهيكلية في جميع أنحاء إعداد الأنسجة أمر حيوي للحصول على بيانات IHC الشبكية القابلة للاستنساخ ولكن يمكن أن يكون تحديا بسبب هشاشة وتعقيد الهندسة الشبكية السيتوالية. المثبتات قوية مثل 10% formalin أو محلول Bouin الحفاظ على الأمثل بنية الشبكية, أنها غالباً ما تعوق تحليل IHC عن طريق تعزيز الفلورسنت الخلفية و / أو تقليل التفاعلات الأجسام المضادة-epitope, عملية تعرف باسم تجسيد اخفاء. المثبتات أكثر اعتدالا، من ناحية أخرى، مثل 4٪ بارافورمالديهايد، ويقلل من الفلورسنت الخلفية ومثال اخفاء، يجب استخدام تقنيات التشريح الدقيق للحفاظ على بنية الشبكية. في هذه المقالة، نقدم طريقة شاملة لإعداد أكواب خلفية العين الماوس لIHC التي هي كافية للحفاظ على معظم التفاعلات الأجسام المضادة-الشبه دون فقدان السلامة الهيكلية الشبكية. نحن تشمل IHC تمثيلية مع الأجسام المضادة لمختلف علامات نوع الخلية الشبكية لتوضيح الحفاظ على الأنسجة والتوجه في ظل الظروف المثلى ودون الأمثل. هدفنا هو تحسين الدراسات IHC من شبكية العين من خلال توفير بروتوكول كامل من تشريح الكأس الخلفي العين يالأيه.

المقدمة

الكيمياء المناعية (IHC) هي تقنية قوية لتوطين بروتينات محددة والهياكل الخلوية في الأنسجة في الموقع1،2،3. طرق التثبيت غير المناسبة وتقسيم دون الأمثل من الأنسجة المعقدة يمكن أن تعطل بنية الأنسجة، وتوليد تلطيخ الخلفية العالية أو يقلل من التفاعلات الأجسام المضادة- الشبه، مما يؤدي إلى تلطيخ القطع الأثرية وما يترتب على ذلك من سوء تفسير بيانات IHC4. كما شبكية العين الفقارية هو جهاز عصبي معقد ومنظم للغاية تتألف من طبقات من مستقبلات ضوئية مترابطة، interneurons والخلايا العقدية، فهي هشة جدا ويمكن أن تتعطل بسهولة أثناء التشريح والقسم. وهناك بروتوكول مفصل وموحد ومصدق عليه من تشريح العين الماوس والتوجه إلى المناعية سوف تساعد على الحد بشكل كبير من التحف IHC، وبالتالي، زيادة موثوقية النتائج والسماح لبيانات مقارنة أكثر دقة تحليل.

هناك العديد من البروتوكولات لإعداد الأنسجة لIHC، ومع ذلك، ليست كلها مناسبة للأنسجة الشبكية. المثبتات قوية مثل 10٪ الرسمية أو محلول Bouin للحفاظ على بنية الشبكية خلال تشريح وتقسيم5. لسوء الحظ، المثبتات قوية غالبا ما يؤدي إلى الفلورسنت الخلفية المحسنة وتجسد اخفاء بسبب التعديل الكيميائي لepitopes6. من ناحية أخرى، يمكن للمثبتات الأكثر اعتدالا، مثل 4% بارافورمالديهايد (PFA) تخفيف بعض هذه القطع الأثرية ولكن تتطلب تشريح دقيق وتقسيم للحفاظ على بنية شبكية العين الأمثل. PFA يخترق الأنسجة بسرعة، ولكن عبر الروابط البروتينات ببطء شديد، والحد من خطر اخفاء مثال. منذ وقت قصير PFA الحضانة هو تثبيت معتدل نسبيا، والأنسجة غالبا ما تتطلب تجميد سريع للحفاظ على المستضدات. من المهم تجنب تشكيل الكريستال الجليدي أثناء تجميد الأنسجة لأنها تشوه وتضر بسلامة الخلايا والأنسجة7.

هنا نحن نوصف بروتوكولات مفصلة وموحدة للتشريح، والتثبيت، والحماية من البرد من الكؤوس الخلفية العين الماوس التي تسفر عن بيانات IHC متسقة وموثوق بها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم تنفيذ جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا ً صارماً للتوصيات الواردة في دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي قدمها معهد الموارد الحيوانية المختبرية، وقد تمت الموافقة عليها من قبل معهد لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية الحيوانية في جامعة بنسلفانيا.

جميع الأدوات والمعدات للأساليب مبينة في الشكل 1 ومدرجة في جدولالمواد.

1 . إزالة الكُمَّة بالعين بالماوس، وتشريح كوب العين، وتضمينها

  1. الإنقى بالفئران بثانيأكسيد الكربون (CO 2) متبوعاً إما بقطع الرأس (الفئران P0 - P11 بعد الولادة) أو خلع عنق الرحم (الفئران البالغة P11). بالنسبة للفئران P0-P14، يتم تغطية العينين بالجلد. تأكد من إزالة الجلد قبل الخطوات اللاحقة.
  2. قم بوضع علامة على الجزء الزمني للعين (الشكل2A)بحرق القرنية قليلاً باستخدام الكي الذيل. تجنب حرق ثقب في القرنية عن طريق لمس القرنية بخفة جدا ً ولا لأكثر من ثانية مع الكي.
  3. على الفور عيون الماوس enucleate باستخدام منحني ة دومونت #5/45 ملقط. احتضان لمدة 15 دقيقة في أنبوب cryotube 1.5 مل مع 1 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) على الجليد.
  4. بعد 15 دقيقة في 4٪ PFA، نقل العين الثابتة باستخدام ملقط منحني ة دومونت #5/45 إلى تعديل 35 ملم طبق تشريح (انظر جدول المواد والشكل 1C)مليئة PBS ومكان تحت المجهر تشريح.
  5. إجراء شق صغير في علامة الحرق، عموديا على وفوق مباشرة (حدود القرنية) باستخدام السكين الصغيرة.
  6. أدخل المقص المنحني في الشق ونفذ قطعاً من القرنية بعد أطرافه (الشكل2B).
  7. إزالة القرنية واستخراج العدسة مع ملقط #5 دومونت رقيقة، (الشكل 2B)ورفعه بدقة بعيدا عن الجزء الخلفي من العين. الجسم الزجاجي، هلام واضح أن يملأ الفضاء بين العدسة وشبكية العين، وسوف يخرج مع العدسة (الشكل2B)وشبكية العين سوف تكون مرئية كسطح أبيض يغطي داخل كأس العين الخلفي. التأكد من عدم وجود أي ضرر واضح على الشبكية، مثل الثقوب أو الدموع (الشكل2C).
  8. اغسل يُغسل أكواب العين مرتين في 1 مل من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. كريوحماية أكواب العين عن طريق التميّز بها في محلول السكروز 15% في PBS بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية حتى يغرق كوب العين
  10. نقل أكواب العين إلى 30٪ السكروز في PBS لمدة 2-3 ح حتى يغرق كوب العين.
  11. تضمين أكواب العين في OCT في 10 × 10 مم cryomolds (الشكل 3A). باستخدام المجهر تشريح، وتوجيه العين في cryomold على طول محورها البطيني (الشكل2D، الشكل 3A)عن طريق تدوير العين حتى علامة حرق على رأس، والعصب البصري على اليسار والجزء قطع التدريجي من القالب يواجه الحق ( الشكل 2دال). الحرص على تجنب فقاعات بالقرب من الأنسجة.
    ملاحظة: لمعالجة كوب العين، استخدم مسبار تيتانيوم مصنوع من سلك تيتانيوم موصول بطرف ماصة.
  12. لتجميد النسيج الشبكي، تزج cryomold لمدة 5 دقيقة على الأقل في كوب معدني يحتوي على isopentane ووضع كوب في النيتروجين السائل أو الثلج الجاف / 100٪ حمام الإيثانول (تصل إلى 1/3 من ارتفاع الكأس المعدنية).
    ملاحظة: يجب أن تكون مغمورة في cryomold isopentane إلى أكبر من نصف ارتفاعه ولكن ليس من الضروري أن تكون مغمورة تماما.
  13. إزالة كتلة المجمدة والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم.
  14. يخزن في -80 درجة مئوية.
  15. وضع علامة على كتلة المجمدة باستخدام قلم أو sharpie لتسجيل اتجاه كتلة (الشكل 3B).

2 . القسمباستخدام كريوستات

  1. بعد ضبط درجة حرارة كريوستات (بين -20 و -25 درجة مئوية)، والسماح للقوالب التي تحتوي على أكواب العين جزءا لا يتجزأ لتوازن إلى درجة حرارة كريوستات لمدة 1 ساعة.
  2. تثبيت كتلة مع التوجه دورسو-البطيني (الشكل3C)وقطع 10 المقاطع التسلسلية سميكة ميكروم. ضع أقسام الشبكية بعناية على شرائح المجهر المشروحة وذات الأرقام.
  3. تخزين الشرائح في مربعات الشرائح في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى إجراءات IHC.

3 . الإنعكاين المناعي باستخدام حامل الشرائح

ملاحظة: نظام حامل الشرائح (مثل سيكوينزا) يحمل الشرائح المجهر الزجاجي مع لوحة غطاء، وخلق فجوة الشعرية 100 μL ~ بين الشريحة ولوحة.

  1. قم بذوبان المقاطع المبردة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2 ساعة إلى 4 ح للسماح لهم بالجفاف وإرفاق الشرائح المجهر.
    ملاحظة: من الممكن أيضا ً تجفيفها عند درجة حرارة 30-37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
  2. ضع الشرائح في حامل الشرائح واغسل أقسام الشبكية مرتين في 100-200 ميكرولتر PBS لمدة 2 دقيقة.
  3. Permeabilize أقسام الشبكية عن طريق احتضان لهم في 0.25٪ تريتون-X / 0.05٪ NaN3في PBS لمدة 5 دقيقة في RT.
  4. إضافة 100 μL من حظر الحل إلى الشرائح.
  5. إضافة 100 μL من الأجسام المضادة الأولية المخفف في حظر الحل إلى الشرائح.
  6. تحضن أقسام الشبكية بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: خلال هذا الوقت، تغطية "حامل الشرائح" لتجنب إزالة المقاطع.
  7. غسل أقسام الشبكية 3 مرات، كل لمدة 15 دقيقة، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر PBS.
    ملاحظة: إضافة 0.001- 0.002٪ تريتون-X100 إلى PBS (PBS-T) تسمح غسل أكثر صرامة ولكن يمكن أن تعطل بعض الأغشية والهياكل الخلوية.
  8. احتضان أقسام الشبكية في الأجسام المضادة الثانوية التي تحمل علامة الفلورسنت لمدة ساعة في RT. من الآن فصاعداً الحماية من الضوء
  9. اغسل أقسام الشبكية 3 مرات، كل منها لمدة 15 دقيقة.
  10. احتضان أقسام الشبكية في RT لمدة 5 دقائق مع علامة نووية مثل Hoechst 33342 أو حل DAPI.
  11. اغسل يُغسل أجزاء شبكية العين 1 مرة لمدة 15 دقيقة.
  12. ضع غطاء على رأس منشفة ورقية على مقعد المختبر.
  13. إضافة 2 قطرات من وسائل الإعلام المضادة للتلاشي تصاعد إلى وسط coverslip.
  14. أدر الشريحة لتواجه قسم التبريد الشبكي لأسفل.
  15. قم بتركيب الغطاء ببطء، بزاوية 45 درجة تقريبًا، قم بقلب الشريحة على الوسائط المتصاعدة.
    ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات كما يمكنك خفض الشريحة في مكان.
  16. تطبيق الضغط حتى، وذلك باستخدام كتاب ثقيل أو الكتالوج (انظر أدناه)، إلى مزيج الشرائح coverslip للقضاء على وسائل الإعلام تصاعد الزائدة.
    ملاحظة: لضمان الاتساق في إعداد العينة، استخدم دائماً نفس الكائن (أي نفس الكتاب أو الكتالوج) لتطبيق الضغط حتى على coverslip أثناء تصاعد الشريحة.
  17. حافظ على الشقة واسمح للتصلب بين عشية وضحاها في RT في الظلام. الشرائح تخزين شقة في 4 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  18. صورة عبر حقل واسع أو المجهر الفلورسنتالبؤري (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتوضيح كيفية هذه البروتوكولات، وضمان الحفاظ على الشبكية الأمثل لIHC، ونحن التحقيق أقسام الشبكية من الفئران P28 WT (C57BL/6N) مع الأجسام المضادة لرودوبسين (علامة مستقبلات ضوئية) 8، حمض الجلوتاميك decarboxylase 65 (Gad65، خلية amacrine علامة)9، غلوتامين سينثتاز (GS، علامة خلية مولر)10،والكالبيندين (علامة خلية أفقية)11 (الشكل4). IHC تشير إلى أن بروتوكولاتنا تنتج باستم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

إن ّ تَتَحَيَمُل شبكية العين بالفأرة عملية دقيقة بسبب صغر حجم وشكل عيون الفأر وهشاشة نسيج الشبكية. على الرغم من أن إجراء تشريح عالي الجودة هو مسألة ممارسة، وجود بروتوكول مفصل، وتوفير طرق فعالة ونصائح هو ضرورة للحصول على أقسام الشبكية وIHC. بالإضافة إلى البروتوكولات الموصوفة هنا، هناك العديد من النصائح التي تسمح لأقسام شبكية العين متسقة عالية الجودة التي هي مناسبة لIHC استنساخها.

قبل البدء بالتشريح، من المهم أن تكون مريحة ومريحة وتعيين إضاءة الغرفة للرؤية المثلى أثناء الميكروديفيس العين الماوس....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا إفصاحات.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعاهد القومية للصحة (RO1-GMO97327) ومؤسسة البحوث الجامعية (UPenn). نشكر سفيتلانا سافينا بشكل خاص على مساعدتها في تطوير بروتوكول الكيمياء المناعية، وغوردون روثل (جامعة بنسلفانيا) وجامعة بن فيت للتصوير الأساسي للمساعدة في الفحص المجهري وليزلي كينغ، دكتوراه للقراءة الحرجة لهذه المخطوطة .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6qt. دورق من الفولاذ المقاوم للصدأ (185 × 218 مم)Gilson & nbsp ؛#MA-48للنيتروجين السائل (الشكل 1E)
رقائق الألومنيوم   ؛
الكي Bovie#AA01لتمييز اتجاه العين (الشكل 1A) ملقط
منحني ، ملاقط Dumont # 5/45 ، عازمة 45 درجة   ؛علوم المجهر الإلكتروني# 72703-Dلاستئصال عين الفأر وصيانتها (الشكل 1 أ) مقص
منحني ، مقص زنبركي فاناس - 2.5 مم حافة القطع   ؛أدوات العلوم الدقيقة # 15002-08لقطع القرنية محيطيا (الشكل 1 ب) طبق
تشريح 35 مم مغطى بالشمع للأسنانلتشريح كوب العين (الشكل 1 ج)
المجهر   ؛Leica, Houston, USA MZ12.5 سكاكين مجهرية مجهرية
الأداء - مقبض بلاستيكي  أدوات العلوم الدقيقة # 10315-12لعمل شق صغير عند علامة الحروق (الشكل 1 أ) شمع
الأسنان الوردي   ؛علوم المجهر الإلكتروني # 72660لطلاء طبق تشريح
رف منزلق وغطاءتيد بيلا# 36107لشبكية العين IHC (الشكل 1G)
دورق من الفولاذ المقاوم للصدأ (89 × 114 مم)Gilson & nbsp ؛#MA-40لحمام الأيزوبنتان (الشكل 1E) صندوق
الستايروفومللمبرد المعزول
ملقط رقيق Dumont # 5   ؛  أدوات العلوم الدقيقة # 11254-20لإزالة القرنية واستخراج العدسة (الشكل 1 ب)
Tissue-Tek cryomold   ؛ (10 مم × 10 مم × 5 مم)علوم التنظير الإلكتروني الإلكتروني # 62534-10قالب لتضمين OCT
<قوي > مخازن مؤقتة وكواشف < / قوي ><قوي > شركة < / strong > Catalog Number < / strong > تعليقات < / strong > حل
حجب2٪ مصل حصان عادي ، 1.5٪ جيلاتين جلد السمك البارد (عند 40-50٪ في H2O ، #G7765 القط) ، 5٪ ألبومين مصل البقر (CAT #AK1391-0100) في المخزن المؤقت للنفاذية.  
Gelvatol (وسائط تركيب مضادة للبهتان)تحت غطاء الدخان ، قم بإذابة 0.337g DABCO (Sigma cat #D2522-25G) في 10 مل Fluoromount G (Fisher cat #OB100-01).  اضبط على درجة الحموضة 8-8.5 مع 12N HCl (~ 5 قطرات).  تخزينها في زجاجة قطرة كهرمانية عند 4 درجات ؛ ج  (8). 
Hoechst 33342 1000x StockThermo Scientific# 622491 مجم / مل في PBS (1000x). Aliquot وتخزينها في الظلام ، عند 4 درجات ؛ C لمدة تصل إلى 1 سنة أو عند -20 درجة ؛ C للتخزين طويل الأجل. تحضير طازجة  عند 1 ميكروغرام / مل (1x)   ؛
إيزوبنتان, 99٪ GFS Chemicals# 2961
النيتروجين
(PFA) في علومالمجهر الإلكتروني PBS   ؛# 15710محضر طازج 4٪ PFA من 16٪ مخزون PFA. قم بتخزين 16٪ المتبقية من PFA عند 4 درجات ؛ C في الظلام. 
النفاذيةPBS + 0.25٪ Triton-X (AMRESCO cat # 0694-1L) + 0.05٪ NaN3.  ؛ تحضير طازجة.
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) Bioworld  ؛# 41620015-200.02 جم / لتر KCl ، 0.02 جم / لتر KH2< / sub>PO4 ، 0.8 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.216 جم / لتر Na2< / sub>HPO4 ، درجة الحموضة 7.4. محضرة من مخزون 10x 
حلول السكروزفيشر العلمية   #S-5-500قم بإذابة الكمية المناسبة من السكروز في  37° C PBS (يستغرق ~ 15 دقيقة ليذوب). يمكن تخزينها لبضعة أيام في 4°C. 
Tissue-Tek OCT-compound Sakura #4583<
strong>AntibodiesCompany Catalog NumberComments
anti-calbindinSigma-AldrichC8666لتسمية الخلايا horinzotal 
anti-GAD65ChemiconAB5082لتسمية خلايا amacrine GABAergic
المضادة ل GSBD Transduction610517لتسمية Mü ller الخلايا
المضادة للرودوبسينMilliporeMAB5316لتسمية قضبان
تشريح عالية بارافورمالدهيد السائلمحلول

المراجع

  1. Coons, A. H. Labelled antigens and antibodies. Annual Review of Microbiology. 8, 333-352 (1954).
  2. Coons, A. H. Fluorescent antibodies as histochemical tools. Federation Proceedings. 10 (2), 558-559 (1951).
  3. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. Journal of Experimental Medicine. 91 (1), 1-13 (1950).
  4. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).
  5. Hartz, P. H. Frozen sections from Bouin-fixed material in histopathology. Stain Technology. 20, 113(1945).
  6. Benerini Gatta, L., et al. Application of alternative fixatives to formalin in diagnostic pathology. European Journal of Histochemistry. 56 (2), e12(2012).
  7. Tokuyasu, K. T. Application of cryoultramicrotomy to immunocytochemistry. Journal of Microscopy. 143 (Pt 2), 139-149 (1986).
  8. Imai, H., et al. Molecular properties of rhodopsin and rod function. Journal of Biological Chemistry. 282 (9), 6677-6684 (2007).
  9. Lee, J. W., Lim, M. Y., Park, Y. S., Park, S. J., Kim, I. B. Reexamination of Dopaminergic Amacrine Cells in the Rabbit Retina: Confocal Analysis with Double- and Triple-labeling Immunohistochemistry. Experimental Neurobiology. 26 (6), 329-338 (2017).
  10. Bringmann, A., Grosche, A., Pannicke, T., Reichenbach, A. GABA and Glutamate Uptake and Metabolism in Retinal Glial (Muller) Cells. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 4, 48(2013).
  11. Nakhai, H., et al. Ptf1a is essential for the differentiation of GABAergic and glycinergic amacrine cells and horizontal cells in the mouse retina. Development. 134 (6), 1151-1160 (2007).
  12. Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

OCT Cryostat
إعداد المقطعين الماهيينيات في شبكية العين للكيمياء المناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.