مقالة منهجية

توليد الخلايا الجذعية العصبية المستحثة من الخلايا أحادية النووية الطرفية والتمايز نحو سلائف الخلايا العصبية الدوبامين لدراسات زرع

DOI:

10.3791/59690

⸱

يوليو 11, 2019

 , 
1Cell Therapy Center, Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, and Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education, 2Center of Neural Injury and Repair, Beijing Institute for Brain Disorders

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض البروتوكول إعادة برمجة الخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي للحث على الخلايا الجذعية العصبية عن طريق عدوى فيروس سينداي، والتمايز بين الـ iNSCs في الخلايا العصبية الدوبامينية، وزرع سلائف DA في الآفات من جانب واحد نماذج الماوس مرض باركنسون, وتقييم سلامة وفعالية السلائف DA المستمدة من iNSC لعلاج PD.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون (PD) هو سبب انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM). العلاج باستبدال الخلايا يحمل وعدا كبيرا لعلاج PD. في الآونة الأخيرة، ظهرت الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs) كمرشح محتمل للعلاج استبدال الخلايا بسبب انخفاض خطر تكوين الورم واللدونة التي تؤدي إلى الخلايا العصبية الخاصة بالمنطقة وglia. يمكن إعادة برمجة iNSCs من المصادر الخلوية الجسدية الذاتية، مثل الخلايا الليفية والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا. بالمقارنة مع أنواع أخرى من الخلايا الجسدية، PBMNCs هي نوع خلية كاتب جذابة بسبب سهولة الوصول والتوسع في الثقافة. Sendai فيروس (SeV)، وهو فيروس RNA غير التكاملي، وترميز عوامل إعادة البرمجة بما في ذلك الإنسان OCT3/4، SOX2، KLF4 و c-MYC ، لديه شعور سلبي ، واحد الذين تقطعت بهم السبل ، الجينوم غير مجزأة التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتوفير وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة. في هذه الدراسة، ونحن نصف بروتوكول الذي يتم الحصول على iNSCs عن طريق إعادة برمجة PBMNCs، وتميزها في الخلايا العصبية دي أ VM المتخصصة بطريقة من مرحلتين. ثم يتم زرع السلائف DA في من جانب واحد 6-هيروكسيدوبامين (6-OHDA) -نماذج الماوس PD الآفات لتقييم سلامة وفعالية لعلاج PD. توفر هذه الطريقة منصة للتحقيق في وظائف والآثار العلاجية للخلايا العصبية DA الخاصة بالمريض في المختبر وفي الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون (PD) هو اضطراب عصبي شائع، الناجم عن انحطاط الخلايا العصبية الدوبامين (DA) في substantia nigra pars compacta (SNpc) في mesencephalon البطيني (VM)، مع انتشار أكثر من 1٪ في السكان الذين تزيد أعمارهم عن 60 عاما 1 , 2.على مدى العقد الماضي، والعلاج الخلوي، تهدف إما إلى استبدال الخلايا التنكسية أو التالفة، أو تغذية البيئة الدقيقة حول الخلايا العصبية المتحللة، وقد أظهرت إمكانات في علاج PD3. وفي الوقت نفسه، حققت تكنولوجيا إعادة البرمجة تقدما كبيرا4، والذي يوفر مصدرا الخلوية واعدة للعلاج البديل. وقد ثبت أن الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان (iPSCs) والخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) قادرة على التمييز في الخلايا العصبية DA، والتي يمكن أن البقاء على قيد الحياة، والنضج، وتحسين وظائف المحرك عند تطعيمها في نماذج PD الرئيسيات الفئران وغير البشرية5 ،6،7،8. وتمثل هذه المراكز معلماً بارزاً في تكنولوجيات إعادة برمجة الخلايا ولها إمكانات كبيرة في مجال زرع الخلايا؛ ومع ذلك، لا يزال هناك قلق بشأن خطر تكوين الورم من الخلايا المتمايزة بشكل غير كامل. مصدر خلوي بديل لزراعة الخلايا هو الخلايا الجذعية البالغة الملتزمة بالسلالات التي يتم الحصول عليها من خلال إعادة البرمجة المباشرة، مثل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة (iNSCs)، والتي يمكن اشتقاقها من الوسطاء غير المستقرين، متجاوزين القوى المتعددة المرحلة9،10،11.

يمكن إعادة برمجة كل من iPSCs وiNSCs من المصادر الخلوية الذاتية، مثل الخلايا الليفية، والخلايا أحادية النووية في الدم المحيطي (PBMNCs) وأنواع أخرى مختلفة من الخلايا12،13،14،مما يقلل من مناعة الخلايا المزروعة إلى حد كبير. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع iPSCs، iNSCs هي متأصلة مع انخفاض خطر تشكيل الورم واللدونة الملتزمة النسب، قادرة فقط على التمييز في الخلايا العصبية وglia11. في الدراسات الأولية، تم إنشاء iPSCs الإنسان أو الماوس وiNSCs من الخلايا الليفية التي تم الحصول عليها من الخزعات الجلدية، وهو إجراء الغازية14،15. وفي هذا الصدد، فإن مركبات PBMNCs هي مصدر خلايا بداية جذاب بسبب عملية أخذ العينات الأقل تدخلاً، وسهولة الحصول على أعداد كبيرة من الخلايا في غضون فترة قصيرة من فترة التوسع16. استخدمت دراسات إعادة البرمجة الأولية أنظمة التسليم التكاملي، مثل ناقلات الفيروسات اللينة أو الفيروسات الرجعية، والتي هي فعالة وسهلة التنفيذ في العديد من أنواع الخلايا17؛ ومع ذلك، قد تسبب أنظمة التسليم هذه طفرات وإعادة تنشيط الجينات المتحولة المتبقية، والتي تقدم قضايا السلامة لأغراض العلاج السريري12. فيروس سينداي (SeV) هو فيروس RNA غير تكاملي مع جينوم سلبي، واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لا تندمج في الجينوم المضيف، ولكن يتكرر فقط في السيتوبلازم من الخلايا المصابة، وتقديم وسيلة فعالة وآمنة لإعادة برمجة18 ،19. تتوفر متجهات SeV المؤتلفة التي تحتوي على عوامل إعادة برمجة بما في ذلك OCT3/4الإنسان، SOX2، KLF4 و c-MYC في إطارات القراءة المفتوحة الخاصة بهم. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة تحسين ناقلات الفيروس SeV عن طريق إدخال طفرات حساسة لدرجة الحرارة، بحيث يمكن إزالتها بسرعة عندما يتم رفع درجة حرارة الثقافة إلى 39 درجة مئوية20. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لإعادة برمجة PBMNCs إلى iNSCs باستخدام نظام SeV.

وقد ذكرت العديد من الدراسات اشتقاق الخلايا العصبية DA من ESCs الإنسان أو iPSCs باستخدام أساليب مختلفة6،8،21. ومع ذلك، هناك نقص في البروتوكولات التي تصف التمايز بين الخلايا العصبية DA من iNSCs في التفاصيل. في هذا البروتوكول، سوف نقوم بوصف الجيل الفعال من الخلايا العصبية DA من iNSCs باستخدام طريقة على مرحلتين. يمكن زرع السلائف العصبية DA في striatum من نماذج الماوس PD لتقييمات السلامة والفعالية. ستقدم هذه المقالة بروتوكول مفصل يغطي مراحل مختلفة من جيل الخلايا الجذعية العصبية المستحثة بفيروس سينداي، تمايز الـ iNSCs في الخلايا العصبية DA، وإنشاء نماذج PD الماوس، إلى زرع سلائف DA في السترياتوم من نماذج PD. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن للمرء أن يولد iNSCs من المرضى والمانحين الأصحاء وتستمد الخلايا العصبية DA التي هي آمنة، قابلة للتوحيد القياسي، قابلة للتحجيم ومتجانسة لأغراض زرع الخلايا، أو لنمذجة PD في طبق والتحقيق في الآليات بداية المرض الكامنة والتنمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويجب أن تتبع جميع الإجراءات المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات المؤسسية للبحوث البشرية. يجب الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى أو المتطوعين الأصحاء قبل جمع الدم. وقد وافقت لجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للمؤسسة على هذا البروتوكول، وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمؤسسة المتعلقة برعاية الحيوانات واستخدامها.

1 - جمع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم وعزلها وتوسيع نطاقها

  1. جمع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم
    1. جمع 10-20 مل من الدم الوريدي المحيطي للمتبرع عن طريق الوريد مع قارورة حافظة الهيبارين الصوديوم.
      ملاحظة: يجب تخزين عينات الدم أو شحنها في درجة حرارة الغرفة (RT). معالجة عينات الدم في غضون 24 ساعة.
  2. إعداد وسط الثقافة
    1. إعداد المصل المتوسط الحر (SFM) عن طريق الجمع بين المكونات التالية: 245 مل من وسيط دولبكو المعدل ة (IMDM)، 240 مل من F-12 لحم الخنزير، 5 مل من الأنسولين ترانسفيرين سيلينيوم-X الملحق (ITS-X)، 5 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين(جدول المواد)،5 مل من تركيز الدهون المعرفة كيميائيا، 2.5 غرام من مصل البقر الجنيني، 0.025 غرام من حمض الاسكوربيك و 9 ميكرولتر من 1-ثيوغليسيرول. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      تحذير: حمض الاسكوربيك و 1-ثيوغليسيرول سامة عن طريق ملامسة الجلد والاستنشاق.
    2. لإعداد الخلية أحادية النووية (MNC) المتوسطة، تكملة وسط SFM مع 10 نانوغرام / مل إنترلوكين الإنسان 3 (IL-3)، 2 U /mL الاريثروبويتين (EPO)، 100 نانوغرام / مل عامل الخلايا الجذعية البشرية (SCF)، 40 نانوغرام / مل عامل النمو البشري مثل الأنسولين 1 (منتدى إدارة الإنترنت-1)، 100 ميكروغرام / مل هولو ترانسفيرين و 1 الكساميثازون. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحضير الوسيطة مباشرة قبل الاستخدام.
  3. عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. نقل الدم المحيطي (PB) إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتخفيف PB مع حجم متساو من المالحة المعقمة دولبكو المخزنة الفوسفات (D-PBS).
    3. إعداد 15 مل من الكثافة المعقمة التدرج المتوسطة (جداولالمواد)في أنبوب مخروطي 50 مل آخر.
      ملاحظة: الاحتفاظ بوسط تدرج الكثافة وPB في RT للسماح بعزل أفضل للمركبات متعددة البروم ثنائية الفينيل.
    4. إمالة الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على وسط تدرج الكثافة عند زاوية 45 درجة، ثم وضع ببطء وبعناية 30 مل من PB المخفف على وسط تدرج الكثافة.
      ملاحظة: خذ الرعاية والسماح للPB لتشغيل ببطء أسفل جانب الأنبوب المخروطي على الطبقة المتوسطة التدرج الكثافة. سوف تترسب خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من الأنبوب. إمالة الأنبوب بعناية لتقليل تعطيل واجهة الطبقة.
    5. طرد مركزي الأنابيب في 800 × ز لمدة 15 دقيقة في RT مع الفرامل الطرد المركزي تعيين في موقف "إيقاف". قم بإستنسخ طبقة البلازما العلوية الصفراء وتجاهلها. ثم نقل طبقة بيضاء بيضاء رقيقة الفيلم تحتوي على MNCs مع ماصة 10 مل إلى أنبوب مخروطي 50 مل جديدة.
      ملاحظة: إيقاف تشغيل فرامل الطرد المركزي أمر مهم لعزل الشركات المتعددة الجنسيات.
    6. إضافة 30 مل من D-PBS إلى الأنبوب مع MNCs والطرد المركزي في 600 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant ثم قم بإضافة 45 مل من D-PBS لإعادة تعليق الخلايا. الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تشغيل فرامل الطرد المركزي لهذا وخطوات الطرد المركزي التالية. كما الكريات الخلية كثيفة، إضافة 1-2 مل من D-PBS لإعادة تعليق الكريات بلطف، ثم إضافة D-PBS إلى 45 مل.
    7. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا مع 5 مل من D-PBS وعد الخلايا الحية مع أسلوب الاستبعاد الأزرق trypan.
    8. وبعد وضع الشركات المتعددة الجنسيات اللازمة للتوسع جانباً، قم بتجميد الخلايا المتبقية لاستخدامها في المستقبل.
      ملاحظة: يمكن تجميد ما لا يقل عن 5 × 106 MNCs في قارورة واحدة مع 1 مل من وسط التجميد (جدولالمواد). يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  4. توسيع الشركات المتعددة الجنسيات
    1. في اليوم -14، البذور MNCs في كثافة 2-3 × 106 خلايا لكل ملليلتر في بئر واحد من لوحات ستة آبار مع 1.5 مل من pre-warmed (37 °C) MNC المتوسطة. حضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 2 أيام.
    2. في اليوم -11، جمع الخلايا والمتوسطة مع ماصة معقمة ونقلإلى أنبوب مخروطي جديد 15 مل. طرد الخلايا في 250 × ز لمدة 5 دقائق في RT. تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من درجة حرارة مسبقة (37 درجة مئوية) MNC المتوسطة.
    3. عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق تريبان. بذور MNCs في كثافة 1 × 106 خلايا لكل ملليلتر في MNC ما بين الوسائل المالية الدافئة مسبقا المتوسطة وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: من المتوقع أن إجمالي عدد الخلايا قد إنقاص في اليوم -11.
    4. في اليوم -8، كرر الخطوات 1.4.2-1.4.3 وثقافة الخلايا لمدة 3 أيام.
    5. في اليوم -4، كرر الخطوات 1.4.2-1.4.3 وثقافة الخلايا لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: بعد 14 يوماً من الثقافة، ينبغي أن يبقى عدد متساوٍ أو أكبر من الشركات المتعددة الجنسيات في الثقافة.

2 - إعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في النفثالينات المتعددة الجنسيات بواسطة عدوى النفثالينات المتعددة الأطراف

  1. إعداد الوسيط والثقافة
    1. إعداد حل مخزون بولي د-يسين (PDL) عن طريق حل 100 ملغ من PDL مع 100 مل من H2O إلى تركيز 1 ملغ / مل. يخزن عند -20 درجة مئوية في 1 مل aliquots.
    2. إعداد محلول مخزون الأنسولين عن طريق حل 100 ملغ من الأنسولين في 20 مل من 0.01 N حمض الهيدروكلوريك إلى تركيز 5 ملغ / مل. يخزن عند -20 درجة مئوية في 1 مل aliquots.
    3. لإعداد 200 مل من الوسط القاعدي iNSC، والجمع بين 96 مل من DMEM-F12 و 96 مل من المتوسطة الأساسية (جدولالمواد)مع 2 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين، 2 مل من الأحماض الأمينية غير الضرورية (NEAA)، 2 مل من الملحق N2 و 2 مل من الملحق B27. إضافة 10 نانوغرام / مل المؤتلف سرطان الدم البشري عامل مثبط، 3 μM CHIR99021 و 2 μM SB431542 قبل الاستخدام. تصفية المتوسطة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين. إضافة المؤتلف عامل مثبطة لسرطان الدم البشري، CHIR99021 و SB431542 مباشرة قبل الاستخدام.
  2. إعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم إلى الـ iNSCs عن طريق عدوى الـ SeV
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. في اليوم 0، جمع الخلايا في MNC المتوسطة ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. طرد الخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
    3. عد الخلايا القابلة للحياة مع الأزرق تريبان. إعادة تعليق الخلايا مع ما قبل تسخينها (37 درجة مئوية) MNC المتوسطة إلى تركيز 2 × 105 خلايا لكل بئر في لوحات 24 جيدا.
    4. بعد إزالة أنابيب SeV من -80 درجة مئوية التخزين، ذوبان الأنابيب التي تحتوي على SeV في حمام المياه 37 درجة مئوية لمدة 5-10 ثوان، ومن ثم السماح لهم بالذوبان في RT. بمجرد ذوبانها، وضعها على الجليد على الفور.
    5. إضافة SeV ترميز Klf4 الإنسان، أكتوبر 3/4، SOX2 و C-MyC إلى الآبار، في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 10. خلايا الطرد المركزي مع لوحات في 1000 × ز لمدة 30 دقيقة لتسهيل مرفق الخلايا. ترك الخلايا وsupernatant في لوحات. وضع لوحات في الحاضنة في 37 درجةمئوية، 5٪ CO 2.
      تحذير: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على SeV في خزانة السلامة، وينبغي التعامل مع جميع النصائح والأنابيب مع الإيثانول أو التبييض قبل التخلص منها.
    6. في اليوم الأول، نقل المتوسطة والخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. شطف البئر مع 1 مل من MNC المتوسطة. طرد مركزي تعليق الخلية في 200 × ز لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: استخدم لوحة منخفضة المرفقات 24 جيدا لمنع مرفق أي خلايا قبل الطلاء على PDL / لامينين.
    7. في اليوم 2، تمييع 1 مل من 1 ملغ / مل PDL مع 19 مل من D-PBS إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل. طبقة 6-لوحات جيدا مع 50 ميكروغرام / مل PDL لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
    8. تمييع 200 ميكرولتر من 0.5 ملغ /مل لامينين مع 20 مل من D-PBS إلى تركيز 5 ميكروغرام/مل. يستنشق PDL في لوحات 6-جيدا، وتجف على مقاعد البدلاء نظيفة عمودية.
    9. طبقة 6-لوحات جيدا مع 5 ميكروغرام / مل لامينين وحضانة لمدة 4-6 ح في 37 درجة مئوية. يغسل مع D-PBS قبل الاستخدام.
    10. في اليوم 3، لوحة الخلايا المستحثة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.6 في iNSC المتوسطة على PDL / laminin المغلفة 6-جيدا لوحات.
      ملاحظة: نقل لوحات بلطف إذا لزم الأمر بعد وضع الخلايا على لوحات PDL / laminin المغلفة، في محاولة لعدم إزعاج مرفق الخلايا.
    11. في اليوم 5، أضف 1 مل من التسخين المسبق (37 درجة مئوية) وسيط iNSC في كل بئر في 6 أطباق جيدا بلطف.
      ملاحظة: من المتوقع أن تتعرض الخلايا لوفاة شديدة (>60%)..
    12. في اليوم 7، أضف 1 مل من التسخين المسبق (37 درجة مئوية) وسيط iNSC في كل بئر في 6 أطباق جيدا بلطف.
    13. من اليوم 9 إلى اليوم 28، استبدال المتوسطة التي تنفق مع الطازجة قبل تسخينها (37 درجة مئوية) iNSC المتوسطة كل يوم. رصد ظهور مستعمرات iNSC. اختيار ونقل استنساخ iNSC للتوسع في حوالي 2-3 أسابيع. التقاط المستعمرات مع مورفولوجيا المناسبة باستخدام الماصات الزجاجية المحروقة، باستثناء أي خلايا ملوثة ربما، واستنشاق المستعمرات مع نصائح 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن تجميد iNSCs المميزة للاستخدام في المستقبل مع مستعمرات 2-5 في قارورة واحدة. وتشمل وسيلة التجميد الوسط القاعدي الحر للمصل (جدول المواد) وكبريتيد ثنائي الميثيل مختلطاً بنسبة 9:1، التي ينبغي إعدادها مباشرة قبل الاستخدام. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

3. تمايز iNSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامين

  1. إعداد الوسيط والثقافة
    1. إعداد 200 مل من iNSC التمايز الوسط القاعدي عن طريق الجمع بين 192 مل من DMEM-F12 مع 2 مل من 100X محلول مخزون الجلوتامين, 2 مل من NEAA, 2 مل من الملحق N2 و 2 مل من الملحق B27.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
    2. إعداد iNSC التمايز المرحلة الأولى المتوسطة عن طريق استكمال iNSC التمايز الوسط القاعدي ة مع 1 μM SAG1 و 100 نانوغرام / مل FGF8b.
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
    3. إعداد iNSC التمايز المرحلة 2 المتوسطة عن طريق استكمال iNSC التمايز الوسط القاعدي مع 0.5 مل دوري أدينوسين أحادي الفوسفات (cAMP), 0.2 Mحمض الاسكوربيك, 10 ΜM DAPT, 10 نانوغرام / مل الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (BDNF), 10 نانوغرام / مل غليال مشتقة عامل نيوتروفيك (GDNF) و 1 نانوغرام/مل تحويل عامل النمو βIII (TGF-βIII).
      ملاحظة: استخدم الوسيطة في غضون أسبوعين.
  2. طلاء أطباق الثقافة
    1. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم مقاعد البدلاء نظيفة قبل الاستخدام. تعقيم جميع الأسطح والمعدات مع الكحول 75٪. تعقيم جميع النصائح باستخدام الأوتوكلاف.
    2. لطلاء PDL، يوم واحد على الأقل قبل إعادة طلاء الخلايا، تخفيف 1 مل من 1 ملغ / مل PDL مع 19 مل من D-PBS إلى تركيز 50 ميكروغرام / مل. معطف 12 مم الأغطية الزجاجية التي تم تعقيمها مع الكحول 75٪ في لوحات 24 جيدا مع 50 ميكروغرام / مل PDL في RT لمدة 2 ساعة على الأقل.
    3. بالنسبة لطلاء اللامينين، تمييع 200 ميكرولتر من 0.5 ملغم/مل لامينين مع 20 مل من D-PBS إلى تركيز 5 ميكروغرام/مل. يستنشق PDL وتجفيف الآبار في مقاعد البدلاء نظيفة. قم بقص الأغطية عيار 12 مم مع 5 ميكروغرام/مل لامينين وحضانة لمدة 4-6 ساعة عند 37 درجة مئوية. يغسل مع D-PBS قبل الاستخدام.
  3. خلايا المرور للتمايز.
    1. عندما يصل التقاء iNSCs المستزرع ة إلى 70-90٪، يستنشق المتوسطة من لوحة الثقافة، وإضافة 1 مل من D-PBS لغسل الخلايا. إضافة 1 مل من الكاشف ينفصل الخلية قبل تسخينها (37 درجة مئوية) (جدولالمواد)لكل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتفكك الخلايا.
    2. بعد الحضانة لمدة 3 دقائق، أصبحت الخلايا شبه عائمة. إضافة 3 مل من pre-warmed (37 درجة مئوية) DMEM-F12 المتوسطة لكل بئر، وخلايا ماصة صعودا وهبوطا لتفكك الكريات الخلية في خلايا واحدة.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، والطرد المركزي في 250 × ز لمدة 3 دقائق.
    4. عد الخلايا باستخدام أسلوب الاستبعاد الأزرق trypan. لوحة 5 × 103 خلايا لكل غطاء زجاجي 12 مم في لوحات 24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  4. تمييز iNSCs في الخلايا العصبية الدوبامين.
    1. بدء التمايز 24 ساعة بعد إعادة طلاء الخلايا على PDL / لامينين المغلفة الأغطية. يستنشق ثقافة المتوسطة، وغسل الخلايا مرة واحدة مع D-PBS، ومن ثم إضافة 600 درجة مئوية من مرحلة التمايز قبل تسخينها أنا المتوسطة لكل بئر في لوحات 24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    2. تغيير المتوسطة كل يوم من اليوم 1 إلى يوم 10 خلال المرحلة الأولى من التمايز.
    3. في اليوم 10، يستنشق وسط الثقافة، وغسل الخلايا مرة واحدة مع D-PBS. إضافة 600 درجة مئوية من مرحلة التمايز قبل الدفء (37 درجة مئوية) وسط 2 لكل بئر في لوحات24 جيدا وحضانة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.
    4. تغيير المتوسطة كل يوم من اليوم 11 إلى اليوم 25 خلال المرحلة الثانية من التمايز. يمكن إصلاح الخلايا المتمايزة من قبل paraformaldehyde في نقاط زمنية مختلفة للتحليل.
    5. لتلطيخ الفلورسنت المناعي، اغسل الخلايا مع D-PBS ثلاث مرات بلطف في نقاط الوقت المختارة في يوم التمايز 11 إلى 25.
    6. ماصة 300 ميكرولتر من السطحي غيرالأيونية (جدول المواد) في 100 مل من PBS لجعل السطحي غير الأيونية 0.3٪ في PBS.
      تحذير: السطحي غير الأيونية سامة عن طريق ملامسة الجلد والاستنشاق.
    7. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 10 دقيقة في RT. ثم يغسل مع 0.3٪ في PBS ثلاث مرات.
      تحذير: البارافورمالهايد سام عن طريق ملامسة الجلد واستنشاقه.
    8. سد الخلايا بنسبة 3٪ مصل الحمار لمدة 2 ساعة في RT.
    9. تمييع الجسم المضاد الأساسي في مصل الحمير بنسبة 1٪ بتركيز مناسب وtriturate بلطف لخلط. إضافة 300 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر من لوحة 24 جيدا. حضانة الخلايا في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات.
    10. تمييع الجسم المضاد الثانوي في 1٪ مصل الحمار في تركيز مناسب وtriturate بلطف لخلط. إضافة 300 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر من لوحة 24 جيدا. احتضان الخلايا في RT لمدة 2 ساعة، محمية من الضوء.
    11. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات. تخفيف 4', 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) مع PBS مع تخفيف 1:500. احتضان الخلايا في كل بئر من لوحة 24 جيدا مع 300 درجة مئوية من DAPI المخفف لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. غسل الخلايا مع 0.3٪ السطحي غير الأيونية في PBS ثلاث مرات.
    12. تأخذ بلطف من الأغطية من آبار لوحات مع ملقط. جافة في الظلام بين عشية وضحاها في RT. جبل تحت المجهر الفلوري.

4. إنشاء من جانب واحد 6-الهيروكسيدوبامين (6-OHDA) -الآفات PD نماذج الماوس

  1. لتوليد نماذج الماوس PD لزرع الخلايا، واستخدام الذكور البالغين SCID-البيج الفئران وزنها 20-25 غرام لحقن 6-OHDA.
  2. إعداد الأدوية للجراحة
    1. إعداد محلول حمض الاسكوربيك 0.2٪ عن طريق حل 0.2 غرام من حمض الاسكوربيك في 100 مل من محلول ملحي معقم (0.9٪) وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها. في يوم الجراحة، تمييع 0.2٪ محلول حمض الاسكوربيك من قبل 10 مرات للحصول على محلول حمض الاسكوربيك 0.02٪.
      ملاحظة: يتم إضافة حمض الاسكوربيك لمنع أكسدة 6-OHDA إلى شكل غير نشط.
    2. لإعداد حل 6-OHDA، تزن كمية مناسبة من 6-OHDA في أنبوب معقمة 1 مل، ومن ثم إضافة بعض حجم حمض الاسكوربيك 0.02٪ لجعل 5 ميكروغرام / ميكرولتر 6-OHDA الحل. يُرفع المزيج إلى أن يذوب. ضع 6-OHDA على الجليد حتى الاستخدام.
      ملاحظة: 6-OHDA هو درجة الحرارة والضوء الحساسة. كن حذرا لحماية الحل من الضوء وإبقائه على الجليد قبل الاستخدام.
  3. إعداد المعدات الجراحية المعقمة عن طريق الأوتوكلاف قبل الجراحة. تنظيف جميع المعدات والمناطق السطحية مع الإيثانول عند إعداد الإطار stereotaxic. إعداد قفص استعادة الماوس تحت مصباح التدفئة.
  4. إجراء عملية جراحية لإنشاء نماذج الماوس من جانب واحد 6-OHDA-الآفة.
    1. وزن كل فأر، وتسجيل الوزن وحساب كمية الدواء الذي يحتاج إلى أن تدار. يتلقى كل فأر 0.5 ملغم/كغم من الأتروبين 20 دقيقة قبل العمليات. التخدير الماوس مع 80 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغ / كغ xylazine.
    2. إدارة 0.5 مغ/كغ الأتروبين عن طريق الحقن داخل قنابية.
    3. التخدير الماوس مع 80 ملغ / كغ الكيتامين و 10 ملغ / كغ xylazine عن طريق الحقن داخل اقابية 20 دقيقة بعد إعطاء الأتروبين.
    4. ضع الماوس في غرفة مغلقة. بعد 3-5 دقائق، سيتم التخدير بعمق الماوس دون استجابة لقرصة الساق الخلفية.
      ملاحظة: من المتوقع أن الفأر الذي تلقى التخدير سوف تواجه فترة الإثارة.
    5. حليقة رأس الماوس وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين على عيون الماوس للحماية من تطوير قرحة القرنية.
    6. وضع الماوس على جهاز stereotaxic. إصلاح الماوس مع أشرطة القاطع أولا. أدخل أكواب الأذن بشكل صحيح لجعل رأس الماوس في وضع مسطح وآمن.
    7. تعقيم رأس الماوس مع اليود البوفيدون والكحول ايزوبروبيل. قطع شق المترهل (~ 1.5 سم) على جلد الرأس مع شفرة مشرط، وفضح الجمجمة. اضبط شريط القواطع وقضبان الأذن لتقليل فرق الارتفاع بين البريما ولامدا إلى أقل من 0.1 مم.
      ملاحظة: يقع بريغما الماوس عند تقاطع الغرز الإكليلية والمترهلة، ويقع لامدا عند تقاطع الغرز اللامدوية والمترهلة.
    8. تتحرك ببطء وخفض غيض من الإبرة نحو بريجما وعلاج بريغا كنقطة الصفر. نقل الطرف إلى موضع مع إحداثيات A /P +0.5 مم، M/L -2.1 مم نسبة إلى بريغا. اسحب الطرف ووضع علامة على النقطة. حفر حفرة صغيرة في الجمجمة.
    9. استخراج 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر 6-OHDA الحل في المحقنة الدقيقة (جدولالمواد). إرجاع الإبرة إلى النقطة التي تم وضع علامة عليها، وإدراج الإبرة إلى D / V -3.2 ملم.
    10. حقن 2 ميكرولتر من 5 ميكروغرام/ميكرولتر 6-OHDA الحل (10 ميكروغرام المجموع) بمعدل 1 ميكرولتر / دقيقة. بعد الانتهاء من حقن 6-OHDA، وترك الإبرة في مكانها لمدة 5 دقائق أخرى. ثم سحب إبرة الحقن ببطء.
    11. أغلق الشق مع الغرز وتطبيق مرهم العين الاريثروميسين على عيون الماوس. تقديم 0.5 مل ملحي تحت الجلد لمنع الجفاف، وتطبيق مرهم المضادات الحيوية مباشرة على الجلد خياطة.
    12. إزالة الماوس من جهاز stereotaxic ووضعها في قفص الانتعاش. وضع الماوس مرة أخرى والسماح بالوصول إلى الغذاء والماء حتى يستعيد وعيه. علاج الماوس مع مسكن في مياه الشرب يوميا بعد الجراحة لمدة 2-3 أيام، والجرعة الموصى بها من ايبوبروفين هو 0.03 ملغ / غرام من وزن الجسم في اليوم الواحد.
    13. فحص الماوس يوميا بعد الجراحة.

5. التقييم السلوكي بعد من جانب واحد 6-OHDA الآفات

  1. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الجراحة، إجراء تقييم سلوكي لتقدير أعراض PD. وزن كل فأر، وتسجيل وزنهم وحساب كمية الدواء التي ينبغي أن تدار (0.5 ملغ / كغ أبومورفين قبل التقييم).
  2. إدارة 0.5 مغ/كغ أبومورفين عن طريق الحقن تحت الجلد قبل التقييم ووضع الماوس في اسطوانة زجاجية.
  3. بعد فترة سكن لمدة 5 دقائق، عد عدد الدورات التعارضية وipsilateral نسبة إلى الجانب الآفة في الدقيقة الواحدة وتسجيل نشاطهم مع كاميرا فيديو.
  4. تعتبر الفئران ذات الدوران اتّسحد ناقص ipsilateral >7 دورة في الدقيقة/دقيقة ناجحة ومختارة كمرشحين لتجارب زرع الخلايا. أعد الفئران إلى أقفاص السكن بعد 30 دقيقة من الراحة.
    ملاحظة: إذا كان الماوس قد أُفِّر بنجاح، فإن الماوس المحقون 6-OHDA سوف يظهر تحيزًا أكبر في التحول نحو الجانب المنافي لأن ناهض DA ينشط striatum denervated فائق الحساسية من الجانب المُقمّر غالبًا.
  5. إجراء التقييم السلوكي قبل أسبوع واحد و2، 4، 6، 8، 12، 16 أسابيع بعد زرع الخلايا.

6- زرع الخلايا لسلائف DA

  1. إعداد تعليق الخلية للزرع. لتطعيم الخلايا، تعليق 2 × 105 السلائف DA مختلطة من قبل D10 و D13 DA السلائف بنسبة 1:7 في 4 ميكرولتر من 5 غرام L-1 الجلوكوز في محلول الملح المتوازن (جدولالمواد)من زرع العازلة.
  2. إجراء جراحة زرع الخلايا بعد الإجراءات الموضحة في القسم 4.4، باستثناء أن 6-OHDA يتم استبدالها بتعليق الخلايا السليفة DA أو العازلة.
  3. إجراء التقييم السلوكي 2، 4، 6، 8، 12، 16 أسابيع بعد زرع الخلايا من سلائف DA بعد الإجراءات الموصوفة في القسم 5. عد عدد الدورات المضادة الناجمة عن apomorphine نسبة إلى الجانب الآفة في الدقيقة الواحدة وتسجيل نشاطهم مع كاميرا فيديو.
    ملاحظة: بعد الزرع، يشير انخفاض معدل الدوران اتّصالي إلى تحسين وظيفة المحرك.
  4. في 4، 8، 12، و 16 أسابيع بعد زرع الخلايا، وperfuse الماوس تحت التخدير العميق مع 4٪ paraformaldehyde حتى يصبح جسم الماوس قاسية والكبد من الماوس يصبح شاحبا.
  5. فصل الدماغ من الماوس بلطف ووضع الدماغ في 4٪ بارافورماليدهايد في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  6. في اليوم الثاني، ضع الدماغ في 30٪ السكروز للجفاف حتى يغرق الدماغ إلى القاع.
  7. شريحة العقول في سمك 40 درجة مئوية باستخدام ميكروتومي تجميد.
  8. إجراء تلطيخ المناعة كما هو موضح سابقا في الخطوات 3-4-5-3-4-12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقوم بالإبلاغ عن بروتوكول يغطي مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لعلاج نماذج PD. أولاً، تم عزل مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم وتوسيعها، وإعادة برمجتها لتصبح من الـ iNSCs عن طريق عدوى الـ SeV. ويرد في الشكل 1تمثيل تخطيطي للإجراءات مع توسيع PBMNC وتحريض iNSC. وفي اليوم -14، تم عزل مركبات ثنائي الفينيلمتعدد البروم باستخدام وسيط تدرج الكثافة (جدول المواد). قبل الطرد المركزي، تم فصل الدم المخفف مع PBS وكثافة التدرج المتوسطة إلى طبقتين. بعد الطرد المركزي، ظهرت أربع طبق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا قدمنا بروتوكول التي غطت مراحل مختلفة من العلاج الخلوي iNSC-DA لنماذج PD. وتشمل الجوانب الحاسمة لهذا البروتوكول ما يلي: (1) عزل وتوسيع مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم، وإعادة برمجة مركبات ثنائي الفينيل متعدد البروم في النفثالينات المتعددة البروم على النفثالينات المتعددة الأطراف عن طريق العدوى بفيروس نقص المناعة إلى جانب الـ SeV، (2) التمييز بين النفثالينات والأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي بالخلايا العصبية في دا، (3) إنشاء نماذج ماوس PD أحادية 6-OHDA وسلوكية تقييم، و (4) زرع الخلايا من السلائف DA والتقييم السلوكي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل من خلال المنح التالية: الخلية الجذعية والترجمة المشروع الرئيسي الوطني (2016YFA0101403)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81661130160، 81422014، 81561138004)، مؤسسة بكين البلدية للعلوم الطبيعية (5142005)، مؤسسة بكين للمواهب (201700021223TD03)، مشروع دعم المعلمين رفيعي المستوى في جامعات بلدية بكين في فترة الخطة الخمسية الثالثة عشرة (CIT & TCD20180333)، جائزة بكين للمواهب ذات المستوى العالي (2015-3-063)، بكين صندوق لجنة الصحة البلدية (PXM 2018_026283_000002)، صندوق بكين 100،000 و10000 مواهب (2018A03)، إدارة بلدية بكين لتطوير الطب السريري من دعم التمويل الخاص (ZYLX201706)، و الزمالة المتقدمة للجمعية الملكية - نيوتن (NA150482).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب مخروطي سعة 15 ملكورنينج430052
1-ثيوجلسرينسيجما-ألدريتشM6145سام للاستنشاق والتلامس مع الجلد
24 بئر لوحةCorning3337
أنبوب مخروطي سعة 50 مل   ؛كورنينج430828
6-OHDASigma-AldrichH4381
6-well plateCorning3516
AccutaseInvitrogenA11105-01كاشف تفكك الخلية
ApomorphineSigma-AldrichA4393
حمض الأسكوربيكSigma-AldrichA92902سام مع ملامسة الجلد   ؛
مكمل B27 Invitrogen17504044
BDNFPeprotech450-02عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ
أنابيب جمع الدم التي تحتوي على هيبارين الصوديومBD367871
BSAyisheng36106es60مصل الأبقار الجنيني
cAMPSigma-AldrichD0627Dibutyryladenosine أحادي الفوسفات الدوري
CellBanker 2ZENOAQ100 مليستخدم كوسيط تجميد ل PBMNCs
تركيز الدهون المحدد كيميائياInvitrogen11905031
CHIR99021عملية الجينات04-0004
CoverslipFisher25 * 25-2
DAPISigma-AldrichD8417-10mg
DAPTSigma-AldrichD5942
ديكساميثازونسيجما ألدريتشD2915-100MG
DMEM-F12Gibco11330
DMEM-F12Gibco11320
مصل الحمارجاكسون017-000-121
EPOPeprotech100-64-50UGHuman Erythropoietin
FGF8bPeprotech100-25
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02P = 1.077 ، متوسط التدرج الكثافة
GDNFPeprotech450-10عامل التغذية العصبية المشتق Glial
GlutaMAXInvitrogen21051024100 مرة ؛ محلول مخزون الجلوتامين
Ham's-F12Gibco11765-054
HBSSInvitrogen14175079محلول ملح متوازن
عامل مثبط لسرطان الدم البشريMillporeLIF1010
مؤتلف بشري SCFPeprotech300-07-100UG
IGF-1Peprotech100-11-100UGنمو شبيه بالأنسولين البشري العامل 
IL-3Peprotech200-03-10UGإنترلوكين بشري 3
IMDMGibco215056-023المتوسط المعدل من Iscove Dulbecco
Roche   ؛12585014
ITS-XInvitrogen51500-056ملحق الأنسولين ترانسفيرين والسيلينيوم X
بالضربة القاضية بديلةالمصل Gibco10828028القاسطي المتوسط
المجاني LamininRoche   ؛11243217001
حقنة دقيقةهاميلتون7653-01
N2 الملحق Invitrogen17502048
NEAAInvitrogen11140050الأحماض الأمينية غير الأساسية
NeurobasalGibco10888PDL المتوسط
الأساسي Sigma-AldrichP7280Poly-D-lysine
SAG1EnzoALX-270-426-M01
SB431542عملية الجينات04-0010-10mgتخزين من الضوء عند -20؟
Sendai virusLife TechnologiesMAN0009378
السكروزbaiaoshengke
TGF & beta ;?Peprotech100-36Eتحويل عامل النمو  β?
ترانسفيرينآر آند أنظمة D2914-HT-100G
Triton X 100baiaoshengkeالخافض للتوتر السطحي غير الأيوني
تريبان الأزرقجيبكوT10282
زيلازينسيجما ألدريتشX1126
الأنسولين المصل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams-Gray, C. H., et al. The distinct cognitive syndromes of Parkinson's disease: 5 year follow-up of the CamPaIGN cohort. Brain. 132, Pt 11 2958-2969 (2009).
  2. Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radical Biology and Medicine. 62, 132-144 (2013).
  3. Chen, Z. Cell Therapy for Parkinson's Disease: New Hope from Reprogramming Technologies. Aging and Disease. 6 (6), 499-503 (2015).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  5. Doi, D., et al. Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  6. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  7. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12543-12548 (2004).
  8. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  9. Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. Progress in the reprogramming of somatic cells. Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).
  10. Tang, X., et al. Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors. Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).
  11. Yuan, Y., et al. Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model. Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).
  12. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  13. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  14. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  15. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  16. Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).
  17. Bazley, F. A., et al. Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells. Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).
  18. Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).
  19. Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method. Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Cho, M. S., et al. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Zhu, S., et al. Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds. Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).
  24. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  25. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).
  26. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  27. Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).
  28. Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. Transgenic rodent models of Parkinson's disease. Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).
  29. Sheng, C., et al. Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors. Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).
  30. Prasad, A., et al. A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation. Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

6 FOXA2

مقالات ذات صلة