Pan-lyssavirus في الوقت الحقيقي RT-PCR لتشخيص داء الكلب

وقد قبلت منظمة الطاقة العالمية تشخيص داء الكلبباستخدام المنهجيات الجزيئية في عام 2018 1، مع الاعتراف بمزايا هذه التقنيات في تأكيد حالات داء الكلب، لا سيما في الحالات التي تكون فيها العينات دون المستوى الأمثل، أو لتشخيص ما قبل الوفاة، كما لا يوجد شرط للفيروس الحية أو عينات جديدة. تتطلب عمليات فحص PCR للفيروسات الليسافية نسخًا عكسيًا (RT) قبل أن يبدأ PCR لأن الجينوم هو الحمض النووي الريبي. تعتبر الاختبارات RT-PCR التي تكشف عن المنطقة القريبة من 3' من الجينوم الأكثر حساسية، كما تحدث التدرجات النسخي أثناء النسخ المتماثل فيروس lyssa. يمكن تقسيم الاختبارات RT-PCR الشائعة الاستخدام بشكل عام إلى فئتين، نقطة النهاية (أو المستندة إلى هلام) وفي الوقت الحقيقي. وكلا النهجين حساس انما محدد؛ ومع ذلك، فإن الاختبار في الوقت الحقيقي له بعض الفوائد الإضافية مثل الحصول على نتائج في "الوقت الحقيقي" ويجري تنفيذها في نظام أنبوب مغلق تماما، وبالتالي الحد من احتمال تلوث المشغل. هناك نهجان رئيسيان للكشف عن التضخيمات الخاصة بفيروس ليسا التي تم الحصول عليها باستخدام الاختبارات في الوقت الحقيقي. الأولى تستخدم تحقيقات التحلل المائي (مثل تحقيقات تقوى) التي تحتوي على فلوروفور وquencher. وعندما يرتبط المسبار بالمنطقة المستهدفة أثناء التضخيم، يؤدي نشاط الإثارة للبوليميراز إلى تفكك الفلوروفور وعصارة الفلور، مما يمكّن من قياس الفلورة الناتجة عن ذلك. والثاني يستخدم صبغة الحمض النووي المتداخلة (فلوروكروم مثل SYBR الأخضر) التي تربط لمضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل أثناء التضخيم. تنبعث من الفلوروكرومات المقيدة الفلورة التي يتم الكشف عنها في كل دورة، مما يسمح بالكشف في الوقت الحقيقي والقياس الكمي للمنتج. نظرا ً للطبيعة غير المحددة للربط بأي dsDNA، يتم إجراء تحليل منحنى التفكك لتأكيد خصوصية رد الفعل. وتكون الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي سريعة بسبب أحجام الاملييكون الصغيرة، التي يقل طولها عادة عن 200 نقطة أساس؛ ومع ذلك، فإن تحديد المناطق المناسبة لتصميم المواد التمهيدية وتحقيقات في المناطق المحفوظة، يمكن أن يثبت تحديا، وبالتالي إزالة شرط التحقيق هو ميزة متميزة.

وقد تم تصميم عدد من الـ RT-PCRs في الوقت الحقيقي للكشف على وجه التحديد عن سلالات فردية أو سلالات من RABV² وأيضا للكشف عن الفيروسات الليسا في جميع أنحاء جنس^{3،4،5،6، 7،8،9}. جميع الاختبارات سيكون لها حد من الكشف تعتمد على كيفية الحفاظ على التمهيدي (وإذا لزم الأمر، والمسبار) تسلسل هي عبر جنس. والواقع أن سلالات الفيروس الناشئة أو الجديدة قد تجعل الاختبارات المحددة للغاية القائمة على المسبار غير فعالة. اختيار الكشف في الوقت الحقيقي (صبغ مقابل التحقيق) سوف تعتمد على التطبيق المقصود. بالنسبة لمختبر يقوم بمراقبة مواد الدماغ من مصادر محلية ويتوقع أعداد كبيرة من العينات السلبية، فإن استخدام الصبغة المتداخلة الأرخص هو خيار معقول. كما أن النهج الأخضر SYBR سيكون الأمثل عند إجراء مراقبة المسح الضوئي حيث لا يزال وجود فيروسات ليسا جديدة أو متباينة دون الكشف عنها من خلال اختبارات أكثر تقييدا المستندة إلى التحقيق.

جميع أعضاء جنس Lyssaفيروس يسبب مرض داء الكلب، الذي هو قاتل ة بمجرد ظهور الأعراض. الغالبية العظمى من حالات داء الكلب البشري والحيواني بسبب فيروس داء الكلب (RABV)، الخزان المهيمن الذي هو الكلب المنزلي¹⁰. الخفافيش هي الخزانات المضيفة الهامة للفيروسات الليسافيروس وجميع ما عدا اثنين من أنواع فيروس ليسا تتميز تم التعرف عليها مباشرة في الخفافيش — إيكوما ليسافيروس (IKOV) وفيروس موكولا (MOKV) - ومن هذين، وقد تم التكهن IKOV أن يكون خزان ^{المضيف الخفافيش 11.}بالإضافة إلى 16 الأنواع المعترف بها lyssavirus¹², هناك اثنين من الفيروسات lyssaالتي تم وصفها مؤخرا: تايوان الخفافيش lyssavirus (TWBLV)¹³ وKotalahti الخفافيش lyssavirus (KBLV)¹⁴. يمكن تقسيم فيروسات الليسا وراثيا إلى ثلاث مجموعات فيلو، مع غالبية الفيروسات الليسافية، بما في ذلك RABV، تنتمي إلى مجموعة فيلوجروب 1. ومع ذلك، فإن فيروسات الليسا الأكثر تبايناً تنتمي إلى المجموعة الثالثة من الليسوجروب، ومن غير المرجح أن يتم اكتشافها بواسطة RT-PCRs المصممة لاستهداف تسلسلات فيروس RABV أو phylogroup I.

يستخدم الوصف الموضح هنا زوج التمهيدي في الوقت الحقيقي JW12-N165، الذي تم وصفه لأول مرة في عام 2005³. تم تصميم المواد التمهيدية لتكون فيروس pan-lyssaعلى الرغم من أن التطبيق الأصلي كان بمثابة إجراء تحقيق من قبل شركة TaqMan مع تحقيقات للتمييز بين أنواع فيروس ليسا. تم تحقيق تأكيد لاحق أن الزوج التمهيدي كان pan-lyssavirus في خصوصية باستخدام اختبار SYBR 2-الخطوة في الوقت الحقيقي على جميع أنواع فيروس lyssa المتاحة بما في ذلك WCBV¹⁵. ويرد وصف الزوج التمهيدي هنا في اختبار RT-PCR من خطوة واحدة في الوقت الحقيقي باستخدام الفلوروكروم intercalating، والتحقق من صحة باستخدام ممثلين من جميع الأنواع 16 فيروس lyssa المعترف بها. هذا التقييم في الوقت الحقيقي خطوة واحدة هو سريع, حساسة, اختبار فيروس ليسا محددة ويدل على أن قوة التمهيدي مجموعة لتحديد حتى الأنواع فيروس ليسا متباينة للغاية.

عينات من المواد التشخيصية التي تم تلقيها في APHA بعد العدوى الطبيعية، أو التي تم الحصول عليها عن طريق تلقيح الفئران باستخدام بروتوكولات تقيمها لجنة أخلاقيات وإحصاءات APHA بموجب لوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة بموجب الترخيص 70/7394.

1. القياس الكمي للحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم

1. تأكد من تعيين إعدادات مقياس الطيف الضوئي إلى RNA.
2. استخدم 1-2 ميكرولتر من الماء الجزيئي لتهيئة الجهاز وتعيين خط أساس.
3. استخدام 1-2 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي الريبي اختبار لتقييم كمية RNA.
4. حفظ القراءات والمستند.
5. ضبط الحمض النووي الريبي إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر، إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: يجب أن تبقى الحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. إذا تم الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام عمود، أو طريقة قائمة على حبة الحمض النووي الريبي عادة أقل من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. في هذه الحالة استخدام الحمض النووي الريبي أنيق.

2. إعداد سلسلة تخفيف الحمض النووي الريبي لتحديد حساسية نقطة النهاية

1. جعل تخفيف المسلسل 10 أضعاف من الحمض النووي الريبي.
   1. أنابيب التسمية مع سلسلة التخفيف (على سبيل المثال، 10-1، 10-2، الخ) وتفاصيل الحمض النووي الريبي.
   2. إضافة 45 درجة مئوية من الماء الصف الجزيئي إلى كل أنبوب.
   3. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (المخفف سابقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخلط جيدا.
   4. تخلص من طرف الماصات في مطهر مناسب واستبداله بطرف جديد.
   5. تأخذ 5 درجة مئوية من 10-1 وإضافة إلى أنبوب 10-2 وتخلط جيدا.
   6. كرر 2.1.3-2.1.5 مع التخفيفات المتبقية.
      ملاحظة: يجب أن تبقى الحمض النووي الريبي على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات.

3. إعداد ردود الفعل RT-PCR في الوقت الحقيقي

1. باستخدام جدول بيانات، قم بتخطيط تخطيط اللوحة وفقًا لعدد عينات الاختبار وعينات التحكم، لكل من اختبارات lyssavirus وß-actin.
   ملاحظة: إذا كان سيتم اختبار 4 عينات في تكرار مع سيطرة إيجابية وسلبية، وهذا يعادل 10 ردود الفعل لكلا الاختبارين.
2. في "غرفة نظيفة" أو منطقة منفصلة عن قالب RNA، امسح الأسطح بمطهر مناسب قبل الاستخدام أو إعداد محطة عمل PCR (عند الاستخدام). لإعداد محطة العمل، امسح سطح الخزانة بمطهر مناسب ووضع العناصر المطلوبة في محطة العمل وأغلق الأبواب. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق
3. إزالة الحكام والتمهيديات من الثلاجة وذوبان (الكواشف المدرجة في الجدول 1 والتمهيديات في الجدول2).
   ملاحظة: يتم تخزين مزيج الإنزيم في الجلسرين لذلك لا يتطلب ذوبان ويجب أن تبقى على الجليد (أو في كتلة باردة) في جميع الأوقات. يمكن إذابة جميع الكواشف الأخرى في درجة حرارة الغرفة.
4. بمجرد إذابة، مزيج الكواشف والطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع السائل.
   ملاحظة: لا دوامة مزيج الإنزيم، فقط الطرد المركزي لفترة وجيزة.
5. إعداد يمزج رئيسية منفصلة لlyssavirus وß-actin. لكل رد فعل، إضافة 7.55 درجة مئوية من الماء الصف الجزيئي، 10 ميكرولتر من 2X العالمي SYBR مزيج التفاعل الأخضر، 0.6 ميكرولتر من التمهيدي إلى الأمام، 0.6 ميكرولتر من التمهيدي العكسي، 0.25 ميكرولتر من مزيج إنزيم iTaq RT.
   1. استخدم جدول بيانات لحساب وحدات التخزين الصحيحة لتجنب الأخطاء في الحساب اليدوي. ضمان ما يكفي من ماستر ميكس على استعداد للتعويض عن خطأ الأنابيب. لذلك إذا كانت هناك حاجة إلى 10 ردود فعل (انظر ملاحظة في 3.1)، وإعداد 12 ردود الفعل
   2. إعداد سيد مزيج على الجليد (أو في كتلة باردة) والبقاء على الجليد حتى توضع في آلة في الوقت الحقيقي.
6. خلط اليمزج الرئيسي المعدة، الطرد المركزي لفترة وجيزة والاستغناء 19 درجة مئوية في الآبار ذات الصلة من أنابيب الشريط أو لوحة 96 جيدا متوافقة مع آلة في الوقت الحقيقي في الاستخدام.
   ملاحظة: تقليل إنتاج فقاعات في الآبار في حين الأنابيب.
7. في غرفة منفصلة، أو في خزانة الأشعة فوق البنفسجية أعدت كما هو موضح في 3.2، إضافة بعناية 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تعديلها سابقا إلى 1 ميكروغرام / ميكرولتر (انظر الخطوة 1.5) تحت سطح البئر سيد المزيج المناسب ة ومزيج بلطف. تخلص من طرف الماصات إلى مطهر مباشرة بعد الاستخدام (تحت السطح).
   1. إضافة عناصر التحكم بعد عينات الاختبار، مع إضافة عنصر التحكم الإيجابي التالي وعنصر تحكم القالب لا (NTC - الماء الصف الجزيئي) وأضاف الأخير. يمكن تغيير كمية الحمض النووي الريبي المستخدمة اعتمادا على نوع العينة، واستخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة. يجب التحقق من صحة المبلغ المستخدم لضمان تحسين رد الفعل.
8. ختم لوحة باستخدام أغطية الشريط أو السدادة رعاية لضمان إغلاق جميع الأغطية بحزم ووضع العلامات بما فيه الكفاية لتوجيه العينات. تسمية حافة أنابيب لوحة / قطاع.
9. تدور أسفل العينات باستخدام جهاز طرد مركزي لجمع كل السائل في الجزء السفلي من الآبار.
10. نقل لوحة إلى آلة PCR في الوقت الحقيقي، وفتح الباب والمكان في حامل ضمان الموقع الصحيح / التوجه من العينات وفقا لتخطيط لوحة.
    ملاحظة: إذا تم استخدام شرائط أنبوب، تأكد من حامل في مكان.
11. فتح برنامج آلة PCR في الوقت الحقيقي واختيار الخيار لتجربة SYBR في الوقت الحقيقي مع منحنى التفكك. قم ببرمجة جهاز PCR في الوقت الحقيقي باستخدام شروط ركوب الدراجات الحرارية المحددة في الجدول3، بما في ذلك نقاط جمع البيانات.
12. حدد SYBR كصبغة الفلورسنت وحدد غير معروف كنوع العينة وإدراج اسم في المربع اسم العينة الصحيح.
    ملاحظة: تمييز بين ال ينسخ وأيضا بين ال [ليسّووسفير] و [أس-أكتين] آبار.
13. اختر موقع ملف لحفظ البيانات التجريبية، وتأكد من إيقاف تشغيل المصباح في نهاية التشغيل، ثم بدء التشغيل.
    ملاحظة: كما الخطوة الأولى هي مرحلة RT، يتم جمع أي بيانات خلال هذا الوقت، وبالتالي، إذا كان المصباح يتطلب فترة الاحماء يمكن أن يحدث هذا خلال مرحلة RT. الجهاز في الوقت الحقيقي والبرمجيات سوف عرض منحنيات التضخيم في الوقت الحقيقي، في حين سيتم إنشاء منحنى ذوبان في نهاية الدورة.

4- تحليل البيانات

1. بمجرد الانتهاء من تشغيل تنفيذ تحليل البيانات كما يلي.
   1. أولا تحليل نتائج مؤامرة تضخيم عينات الاختبار جنبا إلى جنب مع عينات التحكم. تعرض العينات الإيجابية سلالم أسية، تليها عادة هضبة وقيمة_C t. عينات سلبية عرض قطع التضخيم شقة مع عدم وجود قيم_ر C (الشكل1A). يتم حساب قيمة_{C t} تلقائياً بواسطة البرنامج، على الرغم من أنه يجب فحص هذا وتغييرها يدويًا إذا لزم الأمر.
   2. ثانياً، تحليل نتائج منحنى التفكك لعينات الاختبار إلى جانب عينات التحكم. عينة إيجابية سيكون لها درجةحرارة ذوبان (T م) 77 - 80 درجة مئوية، وتتداخل مع السيطرة الإيجابية الشكل 1B).
   3. الحصول على نتيجة التشخيص الكلي عن طريق التأكد من صحة عناصر التحكم. استخدم الجدول 4 لتفسير النتائج فيما يتعلق بالتحكم الداخلي في الأكتين. إذا كانت عينات التحكم الموجبة سالبة و/أو العينات السالبة موجبة، يجب تجاهل التشغيل.
   4. تسجيل قيم C_t و T_m التي تم الحصول عليها للتحكم RNA في "بطاقة التحكم" لتمكين تحليل الاتجاه والمساعدة في تحديد الانجرافات في حساسية السحب.

بعد البروتوكول وصف أعلاه، وقد أظهرت حساسية pan-lyssavirus RT-PCR على سلسلة تخفيف من فيروس التحكم القياسية (CVS) (الشكل 1) ومجموعة من الفيروسات الليسا أخرى (الشكل 2والشكل 3). تم استخدام SYBR الأخضر أنا صبغ كعالمية خطوة واحدة RT-PCR، حيث يتم تنفيذ توليف cDNA وتضخيم PCR في أنبوب واحد. كما يحدث تضخيم الهدف المحدد، ومن ضم المزيد من الصبغة، مما أدى إلى زيادة مستويات الفلورة في الوقت الحقيقي. يجب تفسير جميع الاختبارات المتشابكة في الوقت الحقيقي على مرحلتين: التضخيم والتفكك. مرحلة التضخيم مطابق ة لأي تضخيم في الوقت الحقيقي (الشكل 1 ألف). وهناك "مرحلة مبكرة" خطية خلال الدورات المبكرة حيث لا يمكن حساب تضخيم الحمض النووي بسبب عدم كفاية الإشارة فيما يتعلق بالخلفية. ويرتبط طول هذا مباشرة إلى مقدار الهدف في العينة. في وقت لاحق، هناك مرحلة الأسي حيث يتم الكشف عن مضاعفة جزيئات الحمض النووي وتسجيلها. وأخيرا، يتم الوصول إلى مرحلة الهضبة (وبصرف النظر عن العينات المخففة للغاية التي قد لا تصل إلى هذه المرحلة قبل نهاية البرنامج). في هذه المرحلة ، فإن شدة مستويات الفلورة ، بسبب استنفاد الكواشف. قطع التضخيم التي لوحظت باستخدام تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من CVS، مطابقة للمؤامرات المتوقعة (الشكل 1 ألفج) حيث أظهر التبيّر فيروس ليسا حساسية أعلى من مستوى الـ ß-actin. تم حساب منحنى التفكك بعد التضخيم، حيث تم فصل dsDNA إلى ssDNA عن طريق زيادة تدريجية في درجة الحرارة والفلورة رصدها كدالة لدرجة الحرارة (الشكل 1 باءمد - واو,). تسببت درجة حرارة العتبة التي ينفصل فيها amplicon المحدد في ssDNA، في إطلاق الفلورة، التي تم قياسها بواسطة برنامج الدراجات الحرارية (T)م). وقد وفرت مرحلة التفكك هذه بيانات عن حجم amplicon، مما مكن المستخدم من تفسير النتيجة بالمقارنة مع عنصر تحكم إيجابي، مما أدى إلى احتمال ضئيل للنتائج الإيجابية الكاذبة. ذا تيملوحظ لCVS باستخدام الإسبوروس (الشكل 1 باء) و [أس-أكتين] إنساي (الشكل 1 دال) متميزة، وساعدت المستخدم على تأكيد تحليل التحليل الصحيح من خلال ملاحظة Tمتم الحصول عليها (الشكل 1 هاء). وعلاوة على ذلك، فإن Cتيو Tمتم تقييم القيم بين التشغيل والمشغلين وتبين أن تكون قابلة للاستنساخ (الجدول 5). العتبة المستخدمة لحساب Cتيتم حساب القيمة تلقائيا من قبل البرنامج وتعتمد على العديد من العوامل، بما في ذلك مزيج رد الفعل أو أداة المستخدمة. على ال 12 يدير مستقلّة ال [ك] معلّةتيكان 20.66 (SD 0.63) لفحص فيروس ليسا و 27.5 (SD 1.13) لـ ß-actin assay. في المقابل فإن التباين الذي لوحظ في Tموكانت القيم أقل بشكل ملحوظ، وذلك بسبب عدم وجود تأثيرات خارجية على هذا القياس. على سبيل المثال، يعني Tمللحصول على فحص فيروس الليسا 78.92 (SD 0.16) (الجدول 5)، بالمقارنة مع متوسط جميع الفيروسات lyssas 78.81 درجة مئوية (SD 0.531) (الجدول 6والشكل 1 واو). هذا النقص في الاختلاف في Tمعبر Lyssavirusجنس مفيدة بما أنّ ال نفسه تحكم [رنا] يستطيع كنت استعملت [رلّيس وف] ال [ليسّوروس] في العينة, ولكن يُمْرّب بين الليسافيروس نوع يستعمل ال [ت]مغير ممكن، لا سيما لأن مختلف السلالات الفرعية RABV امتدت نطاق Tمالقيم التي لوحظت (الجدول 6). ونادراً ما تُلاحظ قطع التضخيم غير المحددة مع هذا التسيب؛ ومع ذلك، هناك حاجة إلى معلمات محددة لتعريف نتيجة إيجابية مقابل نتيجة سلبية غير محددة. تم تطبيق SD لوحظ في جميع الفيروسات lyssaviruses (0.531) على أدنى (77.34 - LBVa) وأعلى (79.67 - IKOV) لاحظ Tمقيم لتعيين نطاق 76.8 درجة مئوية - 80.2 درجة مئوية للنطاقات المحددة الإيجابية. لذلك، Tماعتبرت قيم خارج هذا مدى [نون-سبسفيك] ولذلك نتيجة سلبيّة. في بعض الأحيان لوحظ قمم متعددة لعينة. إذا كانت الذروة المهيمنة في T الصحيحم(لكل تكرار) ثم تعتبر العينة إيجابية. السبب الأكثر شيوعا ً هو ملاحظة ذروة غير محددة يرجع إلى التمهيدي ديمرز، وقد تم تحسين فحص للحد من الدمامل التمهيدي. التمهيدي الخافتات عادة ما يؤدي إلى amplicon أصغر من ذلك من التسلسل المستهدف، وبالتالي سيكون Tمأقل من المنتج المحدد.

تم تشغيل 10 أضعاف التخفيف التسلسلي من ثلاثة lyssavirus عينة الدماغ الإيجابية RNAs المستخرجة باستخدام TRIzol، في نفس الوقت وتآمر (الشكل2). وتفاوتت حدود الكشف عن الفيروسات اللايسا الثلاثة، ولكن لم يتجاوز أي منها Ct 36. وتراوحت قيم معامل R2 للفيروسات المرسومة في الشكل 2 بين 0.9637 و0.996. لجميع الفيروسات التي تمتحليلها (الجدول 6) لم يتجاوز النطاق هذا، وعلاوة على ذلك، كان 7 من 29 lyssavirus R2 > 0.99 (البيانات غير مبينة). مع الأخذ في الاعتبار أن إعداد سلسلة التخفيف هو من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي، والخطية التي لوحظت يوفر دليلا على أن الاختبار قوي. وأخيراً، تم التحقيق في الكشف عن جميع أنواع فيروس ليسا (ولا سيما فيروسات الفيلوغروب الثالث الأكثر تنوعاً) باستخدام لوحة من RNAs تغطي جميع المجموعات الثلاثة في جنس فيروس ليسا. تم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج من الفئران الأصلية أو المصابة تجريبياً، مادة الدماغ، باستخدام البروتوكولات الموضحة أعلاه. وتؤكد النتائج أن التمهيديات تضخيم جميع أنواع فيروس ليسا، بما في ذلك التباينة فيلوجروب الثالث lyssaviruses IKOV، WBCV و LLEBV (الجدول6 والشكل 3). تم فحص لوحة متنوعة من الفيروسات الروماتيزمية غير الليسافيروس، التي تم جمعها وتحليلها في الأصل antigenically16، ومؤخرا وراثيا17 وتم الكشف عن عدم وجود تفاعل عبر، مما يدل على أن التمهيديات محددة ل أعضاء جنس Lyssavirus فقط (البيانات غير المعروضة). وقد تم إدراج اختبار عموم lyssavirus في الوقت الحقيقي في EURL (مختبر المراجع الاتحاد الأوروبي) خطط الكفاءة بين المختبرات منذ عام 2013، مما يدل على توافق 100٪ مع الاختبارات الجزيئية الأخرى مثل اختبار اللايسمان pan-lyssavirus و فحص RT-PCR التقليدية بالإضافة إلى FAT (اختبار الأجسام المضادة الفلورسنت).

الشكل 1: تخفيف تسلسلي 10 أضعاف من CVS التحكم الإيجابي RNA، تشغيل على اختبار PAN-lyssavirus RT-PCR، تصور على أنها مؤامرة تضخيم (A)، ومنحنى التفكك (B)، وتشغيلها على ß-actin RT-PCR كما تصور كما مؤامرة التضخيم (C)، و منحنى التفكك (D). NTC = لا يوجد عنصر تحكم قالب. مقارنة التحكم CVS RNA تشغيل على كل من عموم lyssavirus RT-PCR الاختبار (الأزرق) وß-actin RT-PCR الاختبار (الأحمر) مما يدل على الفرق في منحنيات التفكك (E) - انظر الجدول 5 للاطلاع على القيم المتوسطة; وأخيرا منحنيات التفكك لLBVa (الأزرق) وIKOV (الأحمر) مما يدل على مجموعة من القيم Tم لوحظ ت عبر جنس Lyssavirus (F ). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف لثلاثة أنواع من فيروس الليسا: RABV (RV108) وDUVV (RV131) وARAV (RV3379). R2 = 0.996 و 0.9962 و 0.9637 على التوالي. وصلت نقاط البيانات عند 10-7 (0.0001 نانوغرام/ميكرولتر) إلى حد الكشف (حيث تم الحصول على قيمة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: بيانات التخفيف التسلسلي التمثيلية 10 أضعاف من جميع أنحاء جنس فيروس Lyssa (انظر الأساطير الفردية للهوية فيروس ليسا والجدول 6 للاطلاع على النتائج المجدولة بالمقارنة مع الفيروسات الليسافية الأخرى). لوحات A، C، E، G مخططات التضخيم و B، D، F، H منحنيات التفكك لA، C، E، وG على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الكواشف الرئيسية لمزيج RT-PCR في الوقت الحقيقي.

الجدول 2: تفاصيل التمهيدي RT-PCR في الوقت الحقيقي.

الجدول 3: ظروف ركوب الدراجات في الوقت الحقيقي لـ RT-PCR.

الجدول 4: موجز النتائج والنتائج الإجمالية لمعدل فيروس الليسا في الوقت الحقيقي RT-PCR. يتم تعيين السلبية إلى عينة مع عدم وجود قيمةT C (تضخيم) وليس درجة حرارة ذوبان (تفكك)، أو درجة حرارة تذوب الذي هو خارج نطاق Tم للفيروسات lyssa إيجابية (76.8 درجة مئوية - 80.2 درجة مئوية). يتم تعيين إيجابية إلى عينة مع قيمةT C (تضخيم) ودرجة حرارة ذوبان (تفكك) الذي هو داخل نطاقM T للفيروسات lyssaviruses إيجابية.

الجدول 5: التحليل البيني للتحكم الإيجابي في نظام CVS عبر 12 تشغيلًا مستقلًا بما في ذلك عوامل تشغيل متعددة.

الجدول 6: موجز لخصوصية وحساسية وT لفيروسات الليسا التمثيلية في جميع المجموعات الثلاثة. وكان متوسط Tم عبر lyssaviruses 78.81 (SD 0.531).

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.