Method Article

تحليل التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة تخمير الحمام في المختبر

DOI:

10.3791/59725

⸱

August 23rd, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أصبحت الكائنات الحية الدقيقة المعوية البشرية في الآونة الأخيرة هدفا هاما للبحوث في مجال تعزيز صحة الإنسان والوقاية من الأمراض. وبالتالي، أصبحت التحقيقات في التفاعلات بين الاندوبايوتكس (مثل الأدوية والبريبايوتكس) وميكروبيوتا الأمعاء موضوعا ً بحثيًا مهمًا. ومع ذلك، في التجارب الحية مع المتطوعين الإنسان ليست مثالية لمثل هذه الدراسات بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. ونتيجة لذلك، تم استخدام النماذج الحيوانية لتقييم هذه التفاعلات في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال الدراسات النموذجية الحيوانية محدودة باعتبارات أخلاقيات البيولوجيا، بالإضافة إلى اختلاف التراكيب والتنوعات في الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات مقابل البشر. استراتيجية بحثية بديلة هي استخدام تجارب التخمير الدفعية التي تسمح بتقييم التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. لتقييم هذه الاستراتيجية، تم استخدام ثنائي ة البكتيريا (بيف) اكسوبوليساكاريدس (EPS) كممثل xenobiotic. ثم، تم التحقيق في التفاعلات بين Eps BIF وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام عدة طرق مثل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC)، والتحليل التركيبي المجتمعي البكتيري مع تسلسل الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية من الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). يقدم هنا بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في التفاعلات العامة بين بطانة الرحم الأخرى وميكروبيوتا الأمعاء.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الكائنات المجهرية في الأمعاء دورًا هامًا في أداء الأمعاء البشرية وفي صحة المضيف. وبالتالي، أصبحت ميكروبيوتا الأمعاء مؤخرا هدفا هاما للوقاية من الأمراض والعلاج1. وعلاوة على ذلك، تتفاعل بكتيريا الأمعاء مع الخلايا المعوية المضيفة وتنظم العمليات الأساسية المضيفة، بما فيذلك الأنشطة الأيضية، وتوافر المواد الغذائية، وتعديل الجهاز المناعي، وحتى وظيفة الدماغ وصنع القرار 2،3 . إن بطانة الرحم لديها إمكانات كبيرة للتأثير على التركيب البكتيري وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء. وهكذا، جذبت التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتاالأمعاء البشرية زيادة الاهتمام البحثي 4،5،6،7،8،9.

من الصعب تقييم التفاعلات بين الانبوبيوتكس وميكروبيوتا الأمعاء البشرية في الجسم الحي بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. على سبيل المثال، لا يمكن إجراء التجارب التي تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية دون إذن من إدارة الغذاء والدواء، وتوظيف المتطوعين مكلف. وبالتالي، كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية لمثل هذه التحقيقات. ومع ذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية محدود بسبب اختلاف التراكيب المجهرية والتنوع في المجتمعات الحيوانية مقابل المجتمعات المرتبطة بالإنسان. وهناك طريقة بديلة في المختبر لاستكشاف التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية من خلال استخدام تجارب الثقافة دفعة.

إكسوبوليساكاريدس (EPSS) هي البريبايوتكس التي تسهم بشكل كبير في الحفاظ على صحة الإنسان10. يمكن أن تظهر EPSs المتميزة التي تتكون من تركيبات وهياكل أحادية السكريات وظائف متميزة. وقد حددت التحليلات السابقة تكوين BIF EPSs، والتي هي xenobiotic ممثل المستهدفة في الدراسة الحالية11. ومع ذلك، لم يتم النظر في الآثار الأيضية المرتبطة بالمضيف فيما يتعلق بتكوين EPS والتنوع.

يستخدم البروتوكول الموضح هنا الميكروبيوتا البرازية من 12 متطوعًا لتخمير الـ Bif EPSs. ثم يتم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)، وتسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية (GC) في تركيبة للتحقيق في التفاعلات بين EPSs وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. مزايا متميزة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي هي انخفاض تكلفته وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في دراسات أخرى تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في جامعة هونان للعلوم والهندسة (هونان، الصين)، وجامعة تشجيانغ غونغشانغ (تشجيانغ، الصين).

1. إعداد البكتيريا

  1. إعداد مرق ثنائي البكي المتوسط
    1. الجمع بين المكونات التالية في 950 مل من الماء المقطر: استخراج اللحوم، 5 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 5 غرام / لتر. الكازين ببتون، 10 غرام / لتر؛ صوتوني، 5 غرام / لتر؛ الجلوكوز، 10 غرام / لتر؛ K2HPO4,2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; حمض الكلس، 5 غرام/ لتر؛ توين 80، 1 مل؛ محلول الملح، 40 مل(CaCl 2.2H2O، 0.25 غرام / لتر؛ KH2PO4,1 g/L; NaHCO3، 10 غرام / لتر؛ (أ) حمض الكلى، 2 غرام/لتر)؛ وريرازورين، 0.4 مل (2.5 ملغ / لتر). ضبط الحموضة إلى 6.8 مع 2 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح للمرق لتبرد لدرجةحرارة الغرفة (RT) في ظل الظروف اللاهوائية (10٪ H 2، 10٪ CO2،80٪ N2). إضافة فلتر معقمة سيستين-حمض الهيدروكلوريك (0.5 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
  2. إضافة aliquot (50 درجة مئوية) من لونغوم بيفيدوباكتريوم المجمدة إلى أنبوب الثقافة مع 5 مل من مرق ثنائي الفينيل تريومد المتوسط في ظل ظروف لاهوائية، ثم الثقافة في حاضنة اللاهوائية لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.

2. إعداد EPSs ثنائي الفيدوبكتيرية

  1. إعداد PYG أجار المتوسطة
    1. الجمع بين ما يلي: peptone، 20 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 10 غرام / لتر. الجلوكوز، 5 غرام / لتر. حمض الكلس، 0.08 غرام/ لتر؛ CaCl2، 0.008 غرام / لتر؛ MgSO4·7H2O, 0.008 g/L; K2HPO4,0.04 g/L; KH2PO4,0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 جم/لتر; أجار، 12 غرام / لتر. ضبط الحموضة إلى 7.2 باستخدام 10 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. الأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وبارد إلى ~ 50 درجة مئوية. ثم، لكل 1 لتر من المتوسط، إضافة 0.5 مل من تصفية معقمة فيتامين K1 الحل (1 غرام من فيتامين ك1 المذاب في 99 مل من 99٪ الإيثانول)، 5 مل من محلول الهامين (0.5 غرام من الهامين المذاب في 1 مل من 1 مول / L هيدروكسيد الصوديوم ، ثم جلبت ما يصل إلى 100 مل مع الماء المقطر)، و 0.5 غرام من السيستين-حمض الهيدروكلوريك.
    3. قبل صب لوحات PYG، إضافة فلتر تعقيم 5-برومو-4-كلورو-3-إندول β-D-galactopyranoside (X-غال، 0.06 غرام / لتر)، LiCl·3H2O (5.7 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
      ملاحظة: X-Gal و LiCl.3H2O تسمح بتحديد مستعمرات B. longum على لوحات عن طريق تغييرات التلوين.
  2. تلقيح 20 ميكرولتر من سلالات الطول B.(الخطوة 1.2) إلى لوحات PYG ووضعها في حاضنة لاهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
  3. جمع المستعمرات البكتيرية المخاطية من لوحات PYG باستخدام مغرفة وزنها، ثم إعادة تعليق تماما في 10 مل من محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) باستخدام مذبذب دوامة.
    ملاحظة: يجب إعادة تعليق الخلائط البكتيرية وEPS تماما عن طريق الدوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا حتى يتم حل الألياف تماما في PBS.
  4. الطرد المركزي التعليق في 6000 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد ومزيج تماما مع ثلاثة مجلدات من الإيثانول الباردة 99٪ عن طريق تكرار انعكاس ومزج.
  6. طرد مركزي الخليط في 6000 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة تماما supernatants.
  7. إزالة الرواسب من أنابيب الطرد المركزي عن طريق كشط وتجفيف مقتطفات EPS بين عشية وضحاها باستخدام فراغ السرعة.

3. إعداد التخمير المتوسطة

  1. إعداد الثقافة الأساسية المتوسطة السادسة
    1. الجمع بين ما يلي: peptone، 3 غرام / لتر. التربتون، 3 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 4.5 غرام / لتر. المخاط، 0.5 غرام / لتر. الأملاح الصفراوية رقم 3، 0.4 غرام / لتر؛ حمض الكلة، 4.5 غرام/لتر؛ KCl, 2.5 غرام/لتر; MgCl2·6H2O, 4.5 g/L; 1 مل توين 80؛ CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4,0.4 g/L; MgSO4·7H2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H2O, 0.32 g/L; فيسو4·7H2O، 0.1 غرام / لتر؛ CoSO4·7H2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H2O, 0.01 g/L; وNiCl2·6H2O, 0.092 g/L. ضبط الحموضة إلى 6.5 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك.
    2. إعداد الهيمين والسيستين كما هو الحال في القسم 2.1 وإضافة بعد الأوتوكلاف والتبريد.
  2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية التي تحتوي على مصادر الكربون المختلفة مع وسائل الإعلام الأساسية السادس. قبل الأوتوكلاف، أضف 8 جم/لتر من ألياف Eps من Bif إلى متوسط VI، مع المجموعة VI_Bif. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 8 غرام / لتر النشا إلى متوسط السادس لتمثيل المجموعة VI_Starch. وأخيراً، يُستخدم المتوسط السادس دون إضافة مصدر كربوني كعنصر تحكم (المجموعة السادسة).
    ملاحظة: يتم حل EPS BIF والنشا أولا في الماء الساخن باستخدام المحرض المغناطيسي، ثم مختلطة مع وسيط ة VI أعدت.
  3. الأوتوكلاف جميع وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح لتبرد إلى RT.
  4. نقل عينة فرعية (5 مل) من كل أنابيب متوسطة إلى ثقافة في حاضنة لاهوائية، وتخزين وسائل الإعلام المتبقية في 4 درجة مئوية.

4. إعداد عينة البراز البشري

  1. جمع عينات البراز الطازجة مباشرة بعد التغوط الطازجة من المتطوعين الإنسان البالغين الأصحاء باستخدام حاويات البراز، واستخدامها في وقت لاحق لإعداد الطين.
    ملاحظة: قبل جمع العينات، يجب فحص جميع المتطوعين لضمان عدم تلقي المضادات الحيوية، والبروبيوتيك، أو العلاجات البريبايوتيك لمدة 3 أشهر على الأقل قبل التبرع بالعينات. وبالإضافة إلى ذلك، يجب على جميع الجهات المانحة أن تقدم موافقة خطية مستنيرة.
  2. نقل عينة البراز الطازجة (1 غرام) إلى 10 مل من 0.1 M PBS اللاهوائية (pH 7.0) في أكواب زجاجية، ثم استخدام قضبان الزجاج لإعداد الطين 10٪ (ث / الخامس).
  3. استخدام غربال 0.4 m لتصفية الطين البراز. ثم، استخدم عينة فرعية من الطين المصفاة لتلقيح تجارب تخمير ثقافة الدفعة، وتخزين الباقي في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
    ملاحظة: تُجرى الخطوات من 4.2 إلى 4-3 في غرفة لاهوائية.

5. في المختبر دفعة التخمير

  1. إضافة الطين البراز المصفاة (500 درجة مئوية) إلى التخمير المتوسطة أعدت في الخطوة 3.2 داخل غرفة اللاهوائية، ثم حضانة في 37 درجة مئوية.
  2. جمع 2 مل من العينات المخمرة في 24 ساعة و 48 ساعة في الغرفة اللاهوائية ومن ثم الطرد المركزي خارج الغرفة في 6000 × ز لمدة 3 دقائق.
  3. نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد الذي سيتم استخدامه لتحليل تدهور السكريات وقياسات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs).
  4. تخزين الكريات الطرد المركزي في -80 درجة مئوية واستخدامها في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري.

6. تحلل EPS بواسطة ميكروبيوتا البراز البشري

  1. تحميل 0.2 ميكرولتر من supernatants المخمرة على هلام السيليكا المغلفة مسبقا-60 لوحات الألومنيوم TLC، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
  2. تطوير لوحات في 20 مل من حمض الفورميك / ن-البوتانول / المياه (6:4:1، v:v:v) الحل والجافة باستخدام مجفف الشعر.
  3. نقع لوحات في كاشف orcinol لصبغ، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
    1. إعداد الكواشف orcinol عن طريق حل 900 ملغ من ليشنول في 25 مل من الماء المقطر ثم إضافة 375 مل من الإيثانول. في وقت لاحق، ينبغي إضافة حمض الكبريتيك المركزة ببطء والحل مختلطة تماما.
  4. تُسخّن الأطباق عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في فرن الخبز وتقيّم تدهور EPS بقياس نطاقات TLC.

7. آثار EPS على ميكروبيوتا الأمعاء البشرية

  1. تجميد ذوبان عينات البراز الأصلي أعدت في الخطوة 4.3 والعينات المخمرة أعدت في الخطوة 5.4.
  2. استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري (gDNA) من جميع العينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري البراز بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
  3. تحديد تركيزات الحمض النووي، والنزاهة، وتوزيعات الحجم باستخدام مقياس الطيف الضوئي الجزئي والكهربائي هلام أجار.
  4. إجراء PCR من الجينات البكتيرية 16S rRNA من gDNA المستخرجة باستخدام ما يلي وصفها سابقا إلى الأمام وعكس التمهيديات12:
    -التمهيدي إلى الأمام (الباركود التمهيدي 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
    -التمهيدي العكسي (806R): GGACTACHVGGGTWTAT
    استخدم ظروف الدراجات الحرارية التالية:
    1. 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. 94 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
    3. 55 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
    4. 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
    5. كرر 2-4 لمدة 35 دورة
    6. 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    7. 4 درجة مئوية عقد حتى إزالة من دورة الحرارية.
  5. إجراء تسلسل عالي الإنتاجية لمنتجات PCR في شركة تسلسل الحمض النووي باستخدام تحليل مجتمعي ميكروبي فائق الإنتاجية.
  6. الحصول على تسلسل نظيفة وعالية الجودة باستخدام الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) خط أنابيب التسلسل13.
  7. تحديد وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) لتسلسل الجينات rRNA 16S مع أكبر من 97٪ التشابه النيوكليوتيد باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل مجموعة برامج Mothur14.
  8. اختيار تسلسل تمثيلي من كل OTU واستخدام مصنف RDP جنبا إلى جنب مع قاعدة بيانات تصنيف سيلفا لتصنيف التسلسلات التمثيلية15.
  9. حساب تغطية جيدة، مقاييس التنوع ألفا (بما في ذلك سيمبسون ومؤشر شانون)، والثراء (لاحظ عدد من OTUs) باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية16.

8- آثار ربحية السهم على إنتاج الميكروبيوتا المعوية البشرية

  1. إضافة supernatants المخمرة (1 مل) أعدت في الخطوة 5.3 إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي.
  2. إضافة 0.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك إلى كل من العينات وخلط الحلول جيدا عن طريق الدوامة.
  3. طرد مركزي الخلائط في 13،000 × غرام لمدة 20 دقيقة ونقل supernatants إلى أنابيب جديدة.
  4. في الوقت الذي تقوم فيه بإعداد حلول للأسيحاق 120 مل، بروبيوني، بوتيريك، إيزوبوتيريك، حشيشة الهر والأحماض الإيزوفاليريك. ثم، إضافة 1 مل من كل حمض أعدت إلى 1.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك واستخدامها كالكوكتيلات القياسية.
  5. تصفية العينات باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر.
  6. الكشف عن تركيزات SCFA باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز عالية الأداء وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا11،17.
    ملاحظة: يتم استخدام عمود غطاء القلب الأقصى (0.25 م× 30 م × 0.25 درجة مئوية) لكروماتوغرافيا الغاز (GC). ثم يتم تحديد تركيزات SCFA كمياً استناداً إلى مناطق الذروة باستخدام طريقة المعيار الداخلي أحادية النقطة في مجموعة برامج حلول GC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن ملاحظة إنتاج EPS المخاطية في الثقافات B. longum على لوحات PYG بعد الحضانة اللاهوائية لمدة 72 ساعة (الشكل1A). المركزية من القصاصات الثقافة، تليها هطول الأمطار الإيثانول والتجفيف، أدى إلى جمع EPS مثل السليلوز (الشكل1B). ثم استخدمت EPS المجففة والنشا القابل للذوبان كمصادر الكربون لثقافات التخمير. تم استخدام TLC لفصل oligosaccharide وتحليل النقاء بسبب انخفاض تكلفتها وسرعة تحول النتائج18. على الرغم من أن معدل تدهور النشا من قبل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أحرز تقدم كبير نحو فهم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وأنشطتها على مدى العقد الماضي. ونتيجة لهذه الدراسات، ظهر مفهوم الهولوبيوت، الذي يمثل التفاعلات بين المضيفين والمجتمعات الميكروبية المرتبطة بها، كما هو الحال بين البشر وميكروبيوتا الأمعاء19،20. وعلاوة على ذلك، يعتبر البشر حتى الآن الكائنات الحية الفائقة21، حيث تم الاعتراف microbiota الأمعاء باعتبارها واحدة من الأجهزة الوظيفية في البشر22،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يتعارضان في المصالح. وقد ذُكرت هذه الأرقام في Yin et al. 11.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم 31741109)، ومؤسسة هونان للعلوم الطبيعية (رقم 2018JJ3200)، وبرنامج بناء الانضباط المميز التطبيقي في جامعة هونان للعلوم والهندسة. نشكر ليتبوب (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 وميكرو ؛ مرشحات غشاء mMilliporeSLGP033RBاستخدم لتصفية العينات
0.4 مم غربالThermo Fischer308080-99-1استخدم لتحضير عينات البراز البشري
5-bromo-4-chloro-3-indolyl & beta ؛ -D-galactopyranoside (X-Gal)SolarbioX1010استخدم لتحضير لوحة ملونة
AceticSigma-Aldrich71251عينة قياسية ل SCFA
AgarSolarbioYZ-1012214مكون
الغرفة اللاهوائيةElectrotek AW 400SGثقافة البكتيريا والتخمير
الأوتوكلافSANYOMLS-3750استخدم لالأوتوكلاف
باكتو فول الصوياSigma-Aldrich70178مكون
فرن الخبزالمتوسط Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co.، LtdDHG-9240Aاستخدم لتسخين وخبز
مستخلص لحم البقرSolarbioG8270مكون الوسط
Bifidobacterium longum ReuterATCCATCC® 51870™بكتيريا
الأملاح الصفراويةSolarbioYZ-1071304مكون متوسط
الزبدSigma-Aldrich19215عينة قياسية ل SCFA
CaCl2< / sub>SolarbioC7250محلول ملح العمود
الشعريSHIMADZU-GLInertCap FFAP (0.25 مم & مرات ؛ 0.25 & mu ; م)تستخدم للكشف عن SCFA
الكازين الببتونسيجما-ألدريتش39396
الطرد المركزيالمتوسط Thermo ScientificSorvall ST 8يستخدم للطرد المركزي
CoSO4< / sub>.7H2< / sub>OSolarbioC7490مكون
CuSO4< / sub>.5H2< / sub>OSolarbio203165مكون متوسط
Cysteine-HClSolarbioL1550مكون
الإيثانولالمتوسط سيجما-ألدريتشE7023استخدم لتحضير فيتامين K1< / sub>
FeSO4< / sub>.7H2< / sub>OSolarbioYZ-111614مكون
حمض الفورميكسيجما-ألدريتش399388تستخدم في
TLC لكروماتوغرافيا الغازShimadzu CorporationGC-2010 Plusتستخدم للكشف عن SCFA
دورقزجاجي فيشرScientific FB10050يستخدم لتحضير الملاط
الجلوكوزSolarbioG8760مكون المتوسط
HaeminSolarbioH8130مكون حمض الهيدروكلوريك
المتوسطSigma-Aldrich30721الحل الأساسي المستخدم لضبط درجة الحموضة للمخازن المؤقتة
عينة
الأحماض المتساوية السوفاليريةSigma-Aldrich129542عينة قياسية ل SCFA
K2< / sub>HPO4< / sub>SolarbioD9880محلول ملح متوسط
KClSolarbioP9921مكون محلول ملح متوسط
KH2< / sub>PO4< / sub>SolarbioP7392من محلول ملح متوسط
LiCl.3H2< / sub>OSolarbioC8380استخدم لتحضير لوحة ملونة
مستخلص اللحمSigma-Aldrich-Aldrich70164مكون
حمض الميتافوسفوريكالمتوسط سيجما-ألدريتشB7350عينة قياسية ل SCFA
MgCl 2< / sub>.6H 2< / sub>OSolarbioM8160مكون
MgSO4< / sub>.7H2< / sub>OSolarbioM8300محلول ملح متوسط
MISEQIlluminaMiSeq 300PEالحمض النووي
لنظام MnSO4< / sub>. H2< / sub>0Sigma-AldrichM8179من
متوسط MupirocinSolarbioYZ-1448901المضاد الحيوي
كلوريد الصوديومSolarbioYZ-100376محلول ملح متوسط
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich792519محلول ملح متوسط
NanoDrop ND-2000NanoDropND-2000 ND-2000تحديد تركيزات الحمض النووي
هيدروكسيد الصوديومسيجما-ألدريتش30620الحل الأساسي المستخدم لضبط درجة الحموضة في المخازن المؤقتة
n-butanolChemSpider71-36-3يستخدم في TLC
NiCl2< / sub>Solarbio746460مكون Orcinol
Sigma-Aldrich447420المستخدم لتحضير كواشف
الأورسينولعينة قياسية من PropionicSigma-Aldrich94425ل SCFA
QIAamp DNA Stool Mini KitQIAGEN51504استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري
مسحوق PBS جاهز للاستخدامSangon Biotech (Shanghai) Co.، Ltd.A610100-0001تستخدم لتحضير معلق الدهون
ResazurinSolarbioR8150معدات اللاهوائية
سرعة مكثفالفراغ LABCONCOCentriVapاستخدم لتحضير EPSs
النشاSolarbioYZ-140602استخدم لمصدر الكربون
حمض الكبريتيكسيجماألدريتش 150692يستخدم لتحضير كواشف
T100 PCRBIO-RADتضخيم PCR
TLC صفائح الألمنيومMerckMillipo116835تستخدم في TLC
الببتونسيجما-ألدريتشZ699209مكون التربتون المتوسط
سيجما-ألدريتشT7293مكون متوسط
Tween 80SolarbioT8360محلول ملح متوسط
ValericSigma-Aldrich75054عينة قياسية ل
SCFA Vitamin K1< / sub>Sigma-AldrichV3501دوامة متوسطة
الصناعات العلميةVortex.Genie2استخدم في دوامة
مستخلص الخميرةSigma-AldrichY1625مكون
ZnSO4< / sub>.7H2OSigma-AldrichZ0251مكون الوسيط
المتوسطة المتوسط مكون جهاز المتوسط قياسية من SCFA تسلسل محلول ملح الأورسينول 1861096 re مكون مذبذب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81(2018).
  2. Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309(2017).
  3. Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
  4. Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
  5. Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
  6. Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
  7. Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
  8. Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099(2016).
  9. Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
  10. Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
  11. Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
  12. Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
  13. Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
  14. Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
  15. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  16. Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
  17. Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576(2017).
  18. Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
  19. Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
  20. Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
  21. Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
  22. Malfertheiner, P., Nardone, G. Gut microbiota: the forgotten organ. Digestive Diseases. 29 (6), (2011).
  23. Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
  24. Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889(2015).
  25. Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
  26. Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533(2016).
  27. Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endobiotics Gut MicrobiotaIn Vitro FermentationBifidobacterial EPSThin Layer ChromatographyGas Chromatography16S rRNA SequencingShort Chain Fatty AcidsAnaerobic IncubationFecal Sample PreparationPolysaccharide Degradation

Related Articles