هنا ، نقدم بروتوكولا لاعداد الخلايا الدهنية والضامة البريتونية وتحليل كفاءه افيروسيتوسيس والمثبطة المحددة بوساطة عرقله الخلايا الدهنية أحاطه. هذا البروتوكول لديه تطبيق واسعه في الخلية بوساطة أزاله الجزيئات الأخرى بما في ذلك الخرز الاصطناعي والبكتيريا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلية المبرمج هو عمليه طبيعيه ويلعب دورا حاسما في التنمية الجنينية ، وتنظيم التماثل ، والحث التسامح المناعي ، وحل التهاب. تراكم الحطام ابوتوتيك في الجسم قد يؤدي إلى الاستجابات التهابيه المزمنة التي تؤدي إلى امراض المناعة الذاتية الجهازية مع مرور الوقت. تم التورط في أزاله الخلايا الميتة المصابة بامراض المناعة الذاتية. أزاله ابوتوتيك هي عمليه معقده نادرا ما يتم الكشف عنها في ظل الظروف الفسيولوجية. انه ينطوي علي المستقبلات السطحية وفيرة واشاره جزيئات. دراسة عمليه أزاله الخلايا ابوتوتيك يوفر أليات الجزيئية الثاقبة والاستجابات البيولوجية اللاحقة ، والتي قد تؤدي إلى تطوير التداوي الجديدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكولات لتحريض الخلايا الدهنية ، واعداد الضامة البريتوني ، وتحليل أزاله الخلايا ابوتوتيك عن طريق تدفق الخلوي والمجهر. وسوف تخضع جميع الخلايا المبرمج في مرحله معينه ، والعديد من الخلايا السكنية والمنتشرة يمكن امتصاص الحطام ابوتوتيك. ولذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلية ابوتوتيك والابتلاع بواسطة العديد من أنواع الخلايا الأخرى.
المقدمة
جسمنا يولد 1-10 مليار خليه ابوتوتيك علي أساس يومي. يجب مسح مثل هذا العدد الكبير من الخلايا ابوتوتيك بطريقه ان الاستجابات المناعية لا تزال هادئه. لضمان أزاله الخلايا ابوتوتيك في الوقت المناسب ، وأنواع عديده من الخلايا المقيمة الانسجه والخلايا المتداولة تطوير أليات لابتلاع الخلايا ابوتوتيك1. وقد تورط تنظيم مختلة من موت الخلايا المبرمج في بداية وتطور مختلف الامراض التهابيه والحصانة الذاتية2. المبرمج أيضا يلعب دورا حاسما في التسبب في تطور السرطان ومقاومتها اللاحقة للعلاجات التقليدية3,4. أزاله الخلايا ابوتوتيك عموما يعزز استجابه مضاده للالتهابات ، والتي قد تكون مرتبطة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تربيه الفئران التجريبية والحفاظ عليها في مستعمره الفئران لدينا. وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيواني (IACUC) التابعة لجامعه سينسيناتي.
1. اعداد CFSE المسمية الخلايا الدهنية ثيتوتيك
- موت ببطء اثنين من الفئران الساذجة C57/B6 بواسطة CO2 استنشاق لمده 10 دقيقه وتشريح لفتح تجويف الصدر ، وأزاله (سحب) الغدة الصعتريه مع ملقط غرامه الطرف المنحني في الانسجه ثقافة بتري طبق يحتوي علي 10 مل من RPMI1640 المتوسطة.
- الحصول علي تعليق خليه واحده عن طريق طحن الغدة الصعتريه كله ضد اثنين من نهايات متجمد من الشرائح المجهر ومن ثم تصفيه التعليق من خلال 100 μm مصفاه الخلية.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تحليل أحاطه الضامة البريتوني من الخلايا الدهنية. وقد أعدت الضامة البريتوني والخلايا ابوتوتيك وشارك في استزراع كما هو موضح في البروتوكول. وفصلت الضامة وملطخه PE المضادة لCD11b الجسم لمده 20 دقيقه علي الجليد. ثم تم غسل الضامة ومعالجتها في تدفق الخلوي. كما راينا, لا يوجد الضامة الايجابيه CFSE في الربع السفلي الأيمن عندما لم يتم أضافه اي خلايا ابوتوتيك في الثقافة (الشكل 1ا والشكل 2, اللوحة الاولي). ثغليتيجمع-الضامة البريتوني المحفزة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المبرمج هو عمليه الموت خليه المحفوظة للغاية التي تنطوي علي العديد من الشلالات اشاره ويدفع التعبير البروتين, إفراز, والنقل. المبرمج غالبا ما يرتبط مع التغيرات المورفولوجية الخلوية17. الخلايا ابوتوتيك الإفراج بنشاط السايتوكينات والكيميائية التي تجذب البالعات للهجرة إلى الموقع والشروع في عمليه أحاطه ، مسار معقد للغاية تحت سيطرة مشدده18. من ناحية أخرى ، وفاه الخلايا الميتة تطلق إشارات الخطر التي تحفز الاستجابات التهابيه1. والتطهير المعيب أو لفتره طويلة م.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ويدعم البحث في مختبر شاو من قبل جائزه البحوث المبتكرة من كليه الطب والجائزة التجريبية كليه المبتدئين من قسم الطب الباطني ، جامعه سينسيناتي ومنح DK K01_095067 من NIDDK/المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Ack المحلول المخزن | المؤقت GIBCO | A10492 | |
| Annexin V / 7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| الأجسام المضادة المضادة | ل Mer R & D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (استنساخ M1 / 70) BD | Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 ملم) | جيبكو | 15575-020 | |
| أنابيب FACS | BD Biosciences | 352017 | |
| بلوري | فيشر Scientific | 12-552-343 | |
| مصل الحصان (معطل بالحرارة) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | قم بإعداد 1٪ مخزن مؤقت في 1x PBS |
| PBS ، 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100 مجم) | فيشر Scientific | BP2541-100 | أضف 214.3 مل من DMSO إلى 100 مجم لصنع محلول تخزين 1 ملي |
| ثانية ثيوغليكولات متوسط البيرة المعدل | BD Biosciences | 243010 | تحضير 3٪ عازلة ثيوغليكولات في 1 & حاد ؛ PBS ، معقم ، وتخزينه في الظلام لمدة 3 أشهر. |
المراجع
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 1....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
