ترتبط تجارب البروتين المجهري الملزم (PBM) المقترنة باختبارات الكيمياء الحيوية بالخصائص الملزمة والمحفزة للحمض النووي البدائي ، وهو انزيم يجمع الإشعال الريبي علي الحمض النووي. ويمكن استخدام هذه الطريقة ، التي تم تعيينها كتنميط بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، للكشف عن أنماط ربط الحمض النووي لمجموعه متنوعة من الانزيمات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحمض النووي البدائي توليف الإشعال RNA قصيرة التي تبدا تخليق الحمض النووي من شظايا Okazaki علي حبلا متخلفه من قبل الحمض النووي البوليميريز خلال النسخ المتماثل DNA. والربط بين البدائيات ذات النواة الحقيقية الشبيهة بالحمض النووي في الدنا يحدث عند تسلسل معين للاعتراف بالكروموسومات الثلاثية. وهي خطوه محوريه في تشكيل شظايا اوكازاكي. الاداات البيوكيميائية التقليدية التي تستخدم لتحديد تسلسل التعرف علي الحمض النووي من الحمض النووي البدائي توفر فقط معلومات محدوده. باستخدام المقايسة الدقيقة العالية الانتاجيه المستندة إلى ميكروصفيف والتحليلات البيوكيميائية المتتابعة ، فقد تبين ان 1) السياق ملزمه محدده (الربط متواليات من موقع الاعتراف) يؤثر علي قوه ملزمه من الحمض النووي البدائي إلى قالبه الحمض النووي ، و 2) اقوي ملزمه من البدائية إلى الحمض النووي غله أطول الجيش النيبالي العالي الإشعال ، مشيرا إلى ارتفاع المستقيم من الانزيم. ويجمع هذا الأسلوب بين الفحص الدقيق والنشاط البدائي ويتم تعيينه كتصنيف بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، ويسمح بتوصيف التعرف علي تسلسل محدد بواسطة الحمض النووي البدائي في وقت وقابليه غير مسبوقين.
المقدمة
HTPP يجعل استخدام الحمض النووي ربط التكنولوجيا الدقيقة مع التحليل البيوكيميائي (الشكل 1) لتحديد إحصائيا ميزات محدده من قوالب الحمض النووي التي تؤثر علي النشاط الانزيمي من الحمض النووي البدائي. ولذلك ، يوفر HTPP منصة التكنولوجية التي تسهل قفزه المعرفة في الميدان. الاداات الكلاسيكية المستخدمة لتحديد مواقع التعرف علي البدائية لا تملك القدرة علي الغلة كميه هائله من البيانات ، في حين HTPP لا.
PBM هي تقنيه تستخدم بشكل روتيني لتحديد التفضيلات الملزمة لعوامل النسخ إلى الحمض النووي1,2; ومع ذلك ، فانه ليس مناسبا للكشف عن ضعف/عابره ملزمه من البروتينات إلى الحمض ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم ميكروصفيف
ملاحظه: تحقيقات الحمض النووي تمثل متواليات 36 المخصصة-النيوكليوتيد ، التي تتكون من موقع التعرف علي T7 DNA البدائية (GTC) الواقعة بين منطقتين متغيرتين التطويق ، تليها تسلسل ثابت 24-النيوكليوتيد المربوطة إلى شريحة زجاجيه3. استخدمنا 4 x 180,000 شكل ميكروصفيف ، والتي مكنت من اكتشاف كل تسلسل الحمض النووي في ست نسخ متماثلة ، وزعت عشوائيا علي الشريحة.
-
تصميم مكتبه الحمض النووي للحصول علي البدائية مع تسلسلات التعرف المعروفة
- تاكد من ان كل تسلسل يتكون من 60 نوكليوديس. الحفاظ علي أول 24 نوكليوديس ثابت (ليتم إرفاقها إلى الشريحة الزجاجية). وينبغي ان يكون للمناطق المتغيرة الش....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا التقدم التكنولوجي لرسم خرائط المواقع ملزمه البدائية يسمح الحصول علي خصائص ربط الحمض النووي التي يصعب ، ان لم يكن من المستحيل ، لمراقبه استخدام الاداات الكلاسيكية. والاهم من ذلك ، تمكن HTPP من أعاده الفهم التقليدي لمواقع ربط البدائية. علي وجه التحديد ، HTPP يكشف عن خصوصيات ملزمه بالاضافه إلى المعروفة 5 '-GTC-3 ' تسلسل الاعتراف ، مما يؤدي إلى تغييرات في الانشطه الوظيفية لل T7 DNA البدائية. وتحديدا ، تم التعرف علي مجموعتين من المتواليات: تسلسل الحمض النووي القوي الملزم الذي يحتوي علي T/G.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمت طريقه PBM علي نطاق واسع للتحقيق في خصائص ملزمه لعوامل النسخ ويمكن أيضا ان تطبق علي انزيمات معالجه الحمض النووي ، مثل الحمض النووي البدائي ، التي ترتبط الحمض النووي مع تقارب منخفضه. غير انه يلزم إدخال بعض التعديلات علي الإجراءات التجريبية. وتشمل تجربه ميكروصفيف عده خطوات: تصميم مكتبه الحمض النووي ، واعداد رقاقه ، وربط الهدف البروتين ، ووضع العلامات الفلورسنت ، والمسح الضوئي. خطوات الغسيل الخفيفة حرجه ، لان الغسيل الطويل مع المحاليل التي تحتوي علي المنظفات يسبب تفكك البروتين من قالب الحمض النووي بسبب ضعف/عابره .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد حظي هذا البحث بدعم مؤسسه العلوم الاسرائيليه (المنحة رقم 1023/18).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلول 40٪ أكريلاميد - بيساكريلاميد (19: 1) | Merck | 1006401000 | |
| 95٪ فورماميد | سيجما ألدريتش | F9037-100ML | |
| Alexa 488 مترافق مضاد للجسم المضاد | له Qiagen | 35310 | |
| بيرسلفات الأمونيوم (APS) | سيجما ألدريتش | A3678-100G | |
| ATP ، [&alpha ؛ -32P] &ndash ؛ 3000 Ci / mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| حمض البوريك ، حبيبات | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| ألبومين مصل الأبقار (BSA) | روش | 10735094001 | |
| بروموفينول أزرق | سيجما ألدريتش | B0126-25G | |
| جرة كوبلين | |||
| ديثيوثريتول (DTT) | سيجما ألدريتش | D0632-25G | |
| الحمض النووي microarray | Agilent | 4x180K (AMADID # 78366) https://www.agilent.com | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| فوجي فيلم FLA-5100 فوسفوريجر | فوجي فيلم لايف ساينس | ||
| الزجاج تلطيخ الرف | الحراري العلمي | 12869995 | إذا تم استخدام عدة شرائح |
| مختبر دوار | 88880025 | ||
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| غرفة تهجين المصفوفات | الدقيقة Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| ماسح ضوئي للمصفوفاتات الدقيقة (GenePix 4400A) | الأجهزة | ||
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | سيجما ألدريتش | P4417-100TAB | |
| غلوتامات البوتاسيوم | ألفا إيسار | A172232 | |
| مزيج محلول الريبونوكليوتيد (rNTPs) | نيو إنجلاند BioLabs | N0466S | |
| خصيتين السلمون DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| الحليب الخالي من الدسم | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| طبق تلطيخ | حراري علمي | 12657696 | |
| تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| قاعدة تريس (2-أمينو -2- (هيدروكسي ميثيل) -1،3-بروبانديول) | سيجما ألدريتش | 93362-500 جرام | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | X100-500 مل | |
| توين -20 | سيجما ألدريتش | P9416-50 مل | |
| يوريا | سيجما ألدريتش | U6504-1KG | |
| زيلين سياانول | ألفا إيسار | B21530 |
المراجع
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
