مقالة منهجية

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

13K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59750

⸱

يوليو 20, 2019

 , 
1Neural Circuits Research Group, Korea Brain Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكول لدراسة توزيع الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic في الخلايا الكاملة بعد التعديل الجيني باستخدام الضوء المترابطة وحجم المجهر الإلكتروني بما في ذلك أسكوربات بيروكسيداز 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل، الاستئصال التسلسلي للخلايا مع وبدون الجين المستهدف في نفس القسم، والتصوير التسلسلي عن طريق المجهر الإلكتروني.

الملخص

إنشاء أعضاء خلوية، مثل الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية (ER)، شبكة لأداء مجموعة متنوعة من الوظائف. يتم طي هذه الهياكل المنحنية للغاية في أشكال مختلفة لتشكيل شبكة ديناميكية اعتمادا على الظروف الخلوية. وقد جرت محاولة تصور هذه الشبكة بين الميتوكوندريا وER باستخدام التصوير الفلوري فائق الاستبانة والفحص المجهري الخفيف؛ ومع ذلك، فإن القرار المحدود غير كاف لمراقبة الأغشية بين الميتوكوندريا وER بالتفصيل. يوفر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال تباينًا جيدًا للغشاء واستبانة على نطاق النانومتر لمراقبة العضيات الخلوية؛ ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا ً طويلاً بشكل استثنائي عند تقييم بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من العضيات المنحنية للغاية. لذلك، لاحظنا مورفولوجيا الميتوكوندريا وER عن طريق الفحص المجهري الإلكترون الخفيف النسبي (CLEM) وتقنيات الفحص المجهري للإلكترون الحجم باستخدام البيروكسيداز أسكوربات معززة 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل. تم تطبيق طريقة تلطيخ الكتلة، والمقاطع التسلسلية رقيقة جدا (التصوير المقطعي للصفيف)، وحجم المجهر الإلكتروني لمراقبة بنية 3D. في هذا البروتوكول، نقترح مزيج من CLEM و3D المجهر الإلكتروني لإجراء دراسات هيكلية مفصلة من الميتوكوندريا وER.

المقدمة

الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic (ER) هي أعضاء خلوية مرتبطة بالغشاء. اتصالهم ضروري لوظيفتها، وقد وصفت البروتينات المتعلقة بشبكتهم1. وقد تم الإبلاغ عن المسافة بين الميتوكوندريا وER ما يقرب من 100 نانومتر باستخدام المجهرية الخفيفة2; ومع ذلك، كشفت الدراسات المجهرية فائقة الدقة3 والمجهرية الإلكترون (EM)4 أن تكون أصغر بكثير، في حوالي 10-25 نانومتر. الدقة التي تم تحقيقها في الفحص المجهري فائق الدقة أقل من EM، ووضع العلامات المحددة ضروري. EM هو تقنية مناسبة لتحقيق تباين عالية الدقة بما فيه الكفاية للدراسات الهيكلية للصلات بين الميتوكوندريا وER. ومع ذلك، العيب هو معلومات محور z محدودة لأن المقاطع رقيقة يجب أن يكون حوالي 60 نانومتر أو أرق لالإرسال التقليدي الإلكترون المجهري (TEM). للحصول على تصوير ثلاثي المحاور EM z-axis، يمكن استخدامالمجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3DEM) 5. ومع ذلك، وهذا ينطوي على إعداد مئات من المقاطع التسلسلية رقيقة من الخلايا بأكملها، وهو عمل صعب جدا أن عدد قليل فقط من التقنيين المهرة يتقن. يتم جمع هذه المقاطع رقيقة على هشة formvar فيلم المغلفة شبكة TEM ثقب واحد. إذا كان الفيلم يكسر على حزام واحد، والتصوير التسلسلي وإعادة بناء حجم غير ممكن. الفحص المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي التسلسلي للوجه (SBEM) هو تقنية شعبية لـ 3DEM يستخدم قسمالكتلة المدمرة داخل غرفة الفراغ بالمجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) إما بسكين ألماس (Dik-SBEM) أو شعاع أيون مركز (FIB-SEM) 6.ومع ذلك، لأن هذه التقنيات غير متوفرة في جميع المرافق، نقترح التصوير المقطعي صفيف7 باستخدام التناقل التسلسلي وSEM. في التصوير المقطعي للصفيف، يتم نقل المقاطع التسلسلية المقطوعة باستخدام ميكروتومي فائق ة إلى غطاء زجاجي بدلاً من شبكة TEM وتصورها عبر الفحص المجهري الخفيف وSEM8. لتعزيز إشارة التصوير الإلكترون التشتت الخلفي (BSE)، استخدمنا بروتوكول تلطيخ EM كتلة استخدام تتكسيد أوزميوم (OsO4)-الخلايا الثابتة مع ثيوكاربوهيدرازيد osmiophilic (TCH)9،مما يتيح لنا الحصول على صور دون بعد تضمين تلطيخ مزدوج.

بالإضافة إلى ذلك, تم استخدام علامة الميتوكوندريا SCO1 (بروتين تجميع السيتوكروم ج أوكسيديز 1)– أسكوربات بيروكسيداز 2 (APEX2)10 العلامة الجزيئية لتصور الميتوكوندريا على مستوى EM. APEX2 هو ما يقرب من 28 كيلودا ومشتق من فول الصويا أسكوربات بيروكسيداز11. وقد تم تطويره لإظهار الموقع المفصل لبروتينات محددة على مستوى EM بنفس الطريقة التي يتم بها استخدام البروتين الأخضر الفلورسنت الموسومة في الفحص المجهري الخفيف. APEX2 يحول 3,3 ' -diaminobenzidine (DAB) إلى بوليمر osmiophilic غير قابل للذوبان في موقع العلامة في وجود بيروكسيد الهيدروجين العامل المساعد (H2O2). APEX2 يمكن استخدامها كبديل لوضع العلامات التقليدية للجسم المضاد في EM، مع توطين البروتين في جميع أنحاء عمق الخلية بأكملها. وبعبارة أخرى، يمكن تصور البروتين APEX2 الموسومة عن طريق التناضح محددة11 دون وضع العلامات المناعية ونفاذية بعد الترا cryoization. peroxidase الفجل (HRP) هو أيضا علامة حساسة أن يحفز H2O2تعتمد البلمرة من DAB في الرواسب المترجمة، وتوفير EM التباين بعد العلاج مع OsO4. تم تطبيق تسلسل الببتيد الهدف ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 لتصور ER داخل خلية كاملة. لتقييم بروتوكولنا لاستخدام العلامات الوراثية ووصمة عار الكتلة مع انخفاض osmium وTCH (طريقة rOTO)، وذلك باستخدام تأثير التناضح في نفس الوقت، قارنا تباين الغشاء مع وبدون استخدام كل علامة وراثية في rOTO en bloc تلطيخ. على الرغم من أن 3DEM مع التصوير المقطعي صفيف وDAB تلطيخ مع APEX وHRP قد استخدمت، على التوالي، لأغراض أخرى، بروتوكولنا فريد من نوعه لأننا قد الجمع بين التصوير المقطعي صفيف ل3DEM وDAB تلطيخ لالميتوكوندريا ووضع العلامات ER. على وجه التحديد، أظهرنا خمس خلايا مع وبدون الجينات ذات العلامات APEX في نفس القسم، مما ساعد في التحقيق في تأثير التعديل الوراثي على الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثقافة الخلية مع نمط طبق ثقافة الشبكة وخلية transection مع SCO1-APEX2 وHRP-KDEL بلازميد ناقلات

  1. البذور 1 × 105 خلايا HEK293T عن طريق وضعها في 35 ملم الزجاج شبكة القاع أطباق الثقافة في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية في دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 100 U / mL البنسلين، و100 U / مل العقديات.
  2. في اليوم التالي لبذر الخلايا، عندما نمت إلى 50٪ -60٪ من الملاءمة، وإدخال SCO1-APEX210 وHRP-KDEL12 بلازميد إلى الخلايا باستخدام كاشف الانف باستخدام كاشف الانقبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (SCO1-APEX2 cDNA 0.5 ميكروغرام + HRP-KDEL بلازميد الحمض النووي 0.5 ميكروغرام لكل 3 ميكرولتر كاشف).

2. مجهرية خفيفة من الخلايا التي تنمو على أطباق الثقافة منقوشة وتلطيخ DAB لAPEX2 وHRP

  1. في 16-24 ساعة بعد التغوط، وإزالة جميع وسائل الإعلام الثقافة وإضافة على الفور 250 درجةمئوية من الدافئة (30-37 درجة مئوية) حل التثبيت (الجدول 1) عن طريق الأنابيب لطيف. قم بإزالة حل التثبيت على الفور واستبداله بـ 1.5 مل من محلول التثبيت الطازج. حضانة على الجليد لمدة 60 دقيقة، ثم يغسل ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما في 1مل من الجليد البارد 0.1 M الصوديوم cacodylate العازلة (الجدول 1).
    تحذير: أبخرة الألدهيد سامة للغاية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية.
  2. إضافة 1 مل من البرد (0-4 درجة مئوية) 20 مل محلول غليسين وحضانة لمدة 10 دقيقة على الجليد تليها ثلاث اذوش من 5 دقائق كل في 1 مل من الباردة 0.1 الصوديوم cacodylate العازلة.
  3. إعداد حل جديد 1X DAB (3.33 مل من 0.3 M حل cacodylate + 10 ميكرولتر من 30٪ H2O2 + 5.67 مل من الماء البارد + 1 مل 10X حل DAB).
  4. إضافة 500 درجة مئوية من الحل 1X DAB المعدة حديثا (الخطوة 2.3) وحضانة على الجليد لمدة 5-45 دقيقة تقريبا حتى وصمة عار البني الفاتح مرئية تحت المجهر الضوئي المقلوب (الشكل1A).
  5. قم بإزالة محلول DAB بلطف واشطفه ثلاث مرات بسعة 1 مل من المخزن الاحتياطي البارد بـ 0.1 متر من الصوديوم لمدة 10 دقائق لكل منهما.
  6. استخدم مجهرم مقلوب على النقيض من المرحلة (أو مجهر ضوء مشرق) لتصور تلطيخ DAB عند تكبير 100 x أو أعلى. استخدم قلم علامة لوضع علامة على الجزء السفلي من الزجاج حيث تقع منطقة الاهتمام (ROI) (الشكل1B,C).

3. إعداد عينة لكتلة EM

  1. تنفيذ ثقافة الخلية وتلطيخ DAB كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.6.
  2. بعد إصلاح العينات مع 1 مل من 2٪ خفضت OsO4 لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية.
    تحذير: أبخرة OsO4 شديدة السمية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية.
  3. إعداد حل TCHجديد (الجدول 1) أثناء الخطوة 3.2 وتمرير من خلال عامل تصفية 0.22-m.
    تحذير: أبخرة TCH شديدة السمية. أداء جميع الأعمال تحت غطاء الدخان التهوية.
  4. إزالة المثبت وشطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. ضع الخلايا في 1 مل من محلول TCH الذي تم إعداده وتصفيته مسبقًا لمدة 20 دقيقة في RT.
  6. شطف الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
  7. كشف الخلايا مرة ثانية إلى 1 مل من 2٪ أوستروكسيد أوزميوم في الماء المقطر لمدة 30 دقيقة في RT.
  8. إزالة المثبت وشطف ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل في RT. إضافة 1 مل من 1٪ خلات أورانيل (مائي)، وترك بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية في الظلام.
  9. غسل الخلايا ثلاث مرات في 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
  10. قبل الدافئة والتون الرصاص حل أسبارتات (الجدول 1) في فرن في 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. وصمة عار الخلايا مع حل الأسبارتات الرصاص والتون عن طريق إضافة 1 مل من محلول الأسبارتات الرصاص قبل تسخينها، ثم وضعها في فرن لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية.
  12. شطف الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل من الماء المقطر لمدة 5 دقائق لكل منهما في RT.
  13. حضانة في سلسلة متدرجة من 2-مل الإيثانول aliquots (50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، 100٪، 100٪) لمدة 20 دقيقة لكل منهما في RT.
  14. Decant الإيثانول والحضانة لمدة 30 دقيقة في 1 مل من 3:1 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة في RT.
  15. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 1:1 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
  16. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 1:3 الإيثانول: منخفضة اللزوجة تضمين خليط المتوسطة. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
  17. إزالة المتوسطة وإضافة 1 مل من 100٪ منخفضة اللزوجة تضمين المتوسطة وحضانة بين عشية وضحاها.
  18. قم بتضمين العينة في خليط تضمين اللزوجة المنخفضة 100% وحضانة لمدة 24 ساعة عند 60 درجة مئوية.
  19. إعداد 90 نانومتر أقسام سميكة باستخدام ultramicrotome.
  20. مراقبة الشبكة تحت TEM في 200 كيلوفولت.

4. المقاطع التسلسلية وتصاعد على الأغطية المغلفة الإنديوم والقصدير أكسيد لتصوير SEM

  1. إعداد الركيزة
    1. غطاء زجاجي مغطى بالإنديوم والقصدير (ITO) (22 مم × 22 مم) بواسطة الهياج اللطيف في إيزوبروبانول لمدة 30-60 ثوان.
    2. إزالة الأغطية، واستنزاف قبالة isopropanol الزائدة، وترك في بيئة خالية من الغبار حتى تجف.
    3. علاج الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO بواسطة التفريغ المتوهج باستخدام معطف البلازما لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: تنشيط البلازما يمنح خاصية مائية على سطح الركيزة. فإنه يخلق فيلم رقيقة جدا من الماء على الركيزة لمنع تشكيل التجاعيد في الأقسام عندما يتم إرفاق القسم إلى الركيزة.
    4. أدخل الأغطية الزجاجية المغلفة بـ ITO في حامل الركيزة، ووضعها في قارب السكين.
  2. تقليم كتلة عينة والمقاطع التسلسلية
    1. إدراج كتلة عينة في حامل عينة من ultramicrotome وتعيين في كتلة التشذيب.
    2. استخدام شفرة الحلاقة لتقليم بعيدا كل الراتنج الزائد حول الموقف المستهدف (المحددة في الخطوة 2.6، الشكل 1D-G). يجب أن يكون شكل وجه كتلة شبه منحرف أو مستطيلة. يجب أن تكون الحافة الرائدة والحافة الزائدة موازية تماما (الشكل1H،I).
    3. إدراج حامل العينة على ذراع ultramicrotome ووضع سكين الماس في حامل السكين. إدراج الأغطية الزجاجية ITO في الناقل الشريط والمشبك الناقل مع مقبض (الشكل1J). تعيين الناقل الشريط في قارب سكين وملء القارب سكين مع الماء المقطر المصفاة (الشكل1K).
    4. ضبط موقف الناقل مع الشريحة من السكين عن طريق دفع بعناية مقبض حامل لتعيين حافة الزجاج ITO على مقربة من السكين (الشكل1L).
    5. بعد قطع القسم، ووقف عملية القسم، وفتح ببطء المسمار لقط من أنبوب واستنزاف القارب المائي (معدل تدفق قطرة واحدة من الماء في الثانية الواحدة).
    6. بعد الانتهاء من عملية جمع الشريط، وإزالة الركيزة مع مقبض الجهاز لقط وتجفيف الشريط (الشكل1M).

5. التصوير في SEM ومحاذاة مكدس الصور SEM

  1. قم بتركيب غطاء الغطاء المطلي بـ ITO على كعب الألومنيوم مع شريط الكربون اللزج. ختم سطح الزجاج والسطح في كعب مع شريط الكربون لزجة، ومن ثم معطف مع طبقة الكربون سميكة 10 نانومتر (الشكل1N).
  2. مراقبة غطاء المغلفة ITO في حقل الانبعاثات SEM في الجهد تسارع منخفض من 5 كيلوفولت ومسافة عمل مناسبة لجمع كفاءة من BSEs.
  3. استيراد الصور التسلسلية إلى برنامج صورة J (فيجي)13 باستخدام الخيار مكدس الظاهري. فتح TrakEM14جديدة ، واستيراد كومة الصور في TrakEM. انقر فوق زر الماوس الأيمن واختر قائمة المحاذاة.
  4. ثم حدد نطاق الصورة (من الصورة الأولى إلى الصورة الأخيرة). قم بإنهاء المحاذاة التلقائية، واحفظ مجموعة البيانات المحاذية، واختر التصدير لتجميع صورة مسطحة من نطاق الصورة المحدد (من الصورة الأولى إلى الصورة الأخيرة). وأخيراً، حفظ بيانات الصورة المسطحة بتنسيق AVI في القائمة الرئيسية صورة J.
    ملاحظة: الفيلم التكميلي 1 والفيلم التكميلي 2 إظهار مكدس الصور SEM ومكدس الصور اقتصاص، على التوالي.

6- تجزئة الميتوكوندريا وER من الصور المسلسلة

  1. بدء تشغيل 3dmod في برنامج IMOD15 وفتح ملفات الصور.
  2. في إطار ZaP، ارسم محيط الميتوكوندريا وER باستخدام زر الماوس الأوسط.
  3. لتصور وحدة التخزين المجزأة، افتح نافذة عرض الطراز (فيلمتكميلي3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يصف الشكل 1 الجدول الزمني وسير العمل لهذا البروتوكول. يتطلب البروتوكول 7 أيام؛ ومع ذلك، اعتماداً على الوقت المستغرق في التصوير SEM، قد يزيد هذا. لتبديل الخلايا، ينبغي التحكم في تزامن الخلايا حتى لا تغطي الجزء السفلي من لوحة الشبكة بأكملها (الشكل1A). يمكن أن تمنع كثافة الخلايا العالية تحديد الخلية ذات الأهمية أثناء المجهر الضوئي ومراقبة EM. استخدمنا بلازميدات ذات علامات وراثية تعبر عن APEX2 وHRP لاختيار الخلايا المنقولة بكفاءة بين الخلايا المستزرعة العديدة في طبق الثقافة. نحن زراعة خلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحديد التعريب الخلوي لبروتينات محددة بدقة نانومتر باستخدام EM أمر بالغ الأهمية لفهم الوظائف الخلوية للبروتينات. عموما، هناك نوعان من التقنيات لدراسة توطين البروتين المستهدف عن طريق EM. واحد هو تقنية مناعي، والتي تم استخدامها في EM منذ عام 1960، والآخر هو تقنية باستخدام العلامات المشفرة وراثيا وضعت مؤخرا16. وقد استخدمت تقنيات الذهب المناعي التقليدية جزيئات الذهب المترافقة بالأجسام المضادة أو نقاط الكم لإظهار موقع البروتين المسمى. ومع ذلك، نظرا لمتطلبات الأجسام المضادة عالية الجودة وكفاءة اختراق الأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا البحث من خلال برنامج البحوث الأساسية KBRI من خلال معهد كوريا لبحوث الدماغ بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (19-BR-01-08)، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) التي تمولها حكومة كوريا (MSIT) (رقم. 2019R1A2C1010634) وتتكرم جامعة سيول الوطنية بتقديم البلازميدات من قبل شركة SCO1-APEX2 وHRP-KDEL. تم الحصول على بيانات TEM في المرافق الأساسية لأبحاث الدماغ في KBRI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
جلوتارالديهايدEMS16200يستخدم فقط في غطاء الدخان
بارافورمالديهايدEMS19210يستخدم فقط في غطاء الدخان
كاكوديلات الصوديومEMS12300
رابع أكسيد الأوزميوم 4٪ محلول مائيEMS16320يستخدم فقط في شفاط الدخان
Epon 812EMS14120EMbed 812- 20 مل / DDSA- 16 مل / NMA - 8 مل / DMP-30 - 0.8 مل
فائق الصغر Leica ARTOS 3DLeicaARTOS 3D
Uranyl acetateEMS22400مادة كيميائية خطرة
سترات الرصاصEMS17900
35 مم طبق غطاءMattekP35G-1.5-14-CGRD
مفرغ توهجPelcoeasiGlow
Formvar شبكة نحاسيةمطلية بالكربونتيد بيلا01805-F
حمض الهيدروكلوريكSIGMA 258148
Fugene HDPromegaE2311
GlycineSIGMAG8898
3،3 & prime; -diaminobenzamidine (DAB)SIGMAD8001مادة كيميائية خطرة
30٪ محلول بيروكسيد الهيدروجينMerck107210
سداسي سيانوفيرات البوتاسيوم (II) ثلاثي هيدراتSIGMAP3289
0.22 ميكرومتر مرشح حقنةSartorius16534
ثيوكربونيل ثنائي هيدرازيدSIGMA223220استخدم فقط في غطاء الدخان
هيدروكسيد البوتاسيومفلوكا10193426
حمض الأسبارتيك LSIGMAA9256
الإيثانولميرك100983
الفحص المجهري الإلكتروني للنقلFEITecnai G2
أكسيد القصدير الإنديوم (ITO) أغطية زجاجية مطلية SPI06489-ABزجاج هشات
الأيزوبروبانولفيشر الكواشف الحيويةBP2618-1
سكين الماسLeicaAT-4
مجهر خفيفمختل نيكونECLipse TS100
الفحص المجهري الإلكتروني الماسحZeissAuriga
شبكي

المراجع

  1. Krols, M., et al. Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration. Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).
  2. Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians. International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623(2017).
  3. Shim, S. H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  4. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).
  5. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).
  6. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  7. Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
  8. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
  9. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH). The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).
  10. Lee, S. Y., et al. APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest. Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).
  11. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  12. Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons. Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS ONE. 7 (6), 38011(2012).
  15. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
  16. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  17. Kijanka, M., et al. A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy. Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).
  18. Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX. Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).
  19. Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nature Communications. 6, 7923(2015).
  20. Shu, X., et al. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms. PLOS Biology. 9 (4), 1001041(2011).
  21. Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein. PLOS ONE. 8 (5), 64764(2013).
  22. Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells. Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).
  23. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  24. Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2. Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

2

مقالات ذات صلة