Method Article

قياس BK-polyomavirus غير الترميز السيطرة المنطقة مدفوعة النشاط النسخي عن طريق قياس التدفق

DOI:

10.3791/59755

⸱

July 13th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 2Institute for Virology, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen, 3Center for Translational Medicine, Medical Department I, Marien Hospital Herne, University Hospital of the Ruhr-University of Bochum, 4Department of Infectious Diseases, University of Duisburg-Essen, University Hospital Essen Hufelandstr

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، يتم تقديم بروتوكول لإجراء قياس يستند إلى FACS للنشاط النسخي لفيروس الورم الأوب باستخدام خلايا HEK293T المنقولة مع بلازميد مراسل ثنائي الاتجاه يعبر عن tdTomato وeGFP. كما تسمح هذه الطريقة بتحديد تأثير المركبات الجديدة على النسخ الفيروسي بشكل كمي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تسبب الفيروسات المتعددة، مثل فيروس الورم المتعدد BK (BKPyV)، أمراضًا حادة لفي المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. ومع ذلك، بما أن مضادات الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حالياً، فإن هناك حاجة إلى أساليب لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. هنا، تم بناء مراسل الفلورة المزدوجة التي تسمح بتحليل BKPyV غير الترميز السيطرة المنطقة (NCCR) مدفوعة في وقت مبكر ونشاط المروج في وقت متأخر لتحديد تأثير الأدوية المضادة للفيروسات المحتملة على التعبير الجيني الفيروسي عن طريق tdTomato وeGFP التعبير. وبالإضافة إلى ذلك، عن طريق استنساخ التضخيم BKPyV-NCCR التي تم الحصول عليها في هذا البروتوكول بشكل مثالي من الحمض النووي المستمدة من الدم من المرضى الذين زرعوا الكلى المناعية، يمكن تحديد تأثير إعادة ترتيب NCCR على التعبير الجيني الفيروسي. بعد استنساخ التضخيم المشتقة من المريض، تم نقل خلايا HEK293T مع البلازميدات المراسل، وعولجت مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة. وفي وقت لاحق، خضعت الخلايا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لقياس متوسط كثافة الفلورة 72 ساعة بعد الانتراب. لاختبار أيضا تحليل الأدوية التي لها دورة الخلية المحتملة تثبيط تأثير, يتم استخدام الخلايا الفلورية فقط وبالتالي. بما أنّ هذا فحص يكون أنجزت في كبيرة [ت] مستضد عبّر عن خلايا, التأثير صدمة من مبكّرة وتعبير متأخّرة يستطيع كنت حللت في طريقة مستقلّة متبادلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل فيروسات الورم اللامع عائلة مستقلة من فيروسات الحمض النووي المزدوج (dsDNA) الصغيرة التي تقطعت بها السبل مع فيروس سيميان 40 (SV40) كنوع أولي. تحدث العدوى الأولية بشكل رئيسي خلال مرحلة الطفولة، والتي عادة ما تستمر دون أعراض المرض وعادة ما تسبب التهابات كامنة في المضيفين المختصة المناعية. فيروس الورم الحميد BK (BKPyV) يستمر بشكل رئيسي في خلايا الأنابيب الكلوية دون التسبب في أمراض الكلى، ومع ذلك، في حالة ضعف الكفاءة المناعية بعد زرع الكلى يمكن أن يعيد تنشيط الفيروس ويسبب أضرار شديدة وضعف الكسب غير المشروع وظيفة عند الوصول إلى فيرميا عالية (1 × 104 BKPyV نسخ الحمض النووي / مل)1،2. في ما يقرب من 10٪ من متلقي زراعة الكلى، يؤدي إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK (BKPyV) إلى اعتلال الكلى المرتبط بفيروس الورم الحميد (PyVAN)، والذي كان يصل إلى 80٪ المرتبطة بارتفاع خطر فشل الطعوم الكلوية3،4 . وبما أنه لا تتوفر أي عوامل مضادة للفيروسات المعتمدة، يقوم العلاج الحالي على الحد من كبت المناعة. ومن المثير للاهتمام, مثبطات mTOR يبدو أن لها تأثير مضاد للفيروسات; وبالتالي، فإن تحويل العلاج المثبط للمناعة إلى كبت المناعة القائم على mTOR قد يمثل نهجا بديلا لمنع تطور فيرميا BKPyV5،6،7. ومع ذلك، فإن الآلية المضادة للفيروسات المستندة إلى mTOR لا تزال حاليا غير مفهومة بشكل كامل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طرق لقياس تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة في التركيزات ذات الصلة سريرياً.

يتكون الجينوم الدائري للBKPyV من حوالي 5 كيلو بايت يؤوي منطقة تحكم غير ترميزية (NCCR) التي تعمل كأصل للنسخ المتماثل وفي الوقت الذي يقوم فيه مروج ثنائي الاتجاه يقود التعبير عن النصوص في مرحلة مبكرة ومتأخرة من الحمض النووي الريبي. منذ تحدث تلقائيا NCCR-إعادة ترتيب، يتم العثور على الحذف، والازدواجية في BKPyV المسببة للأمراض8 وتراكمت بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من PVAN5،9، مقارنة بين archetypical (الوزن) و إعادة ترتيب (ص) NCCR الأنشطة مفيدة لوصف اللياقة البدنية فيروسي ة.

كما هو ملخص في الشكل 1، يصف هذا البروتوكول طريقة شائعة الاستخدام لقياس نشاط النسخ BKPyV NCCR من خلال قياس الفلورة من اثنين من الفلوروفور tdTomato وeGFP أعرب عنها من بلازميد مراسل5، 9،10،11. يتم تنفيذ هذا الإجراء في وجود مستضد T SV40 كبيرة (lTAg)، والذي يسمح لتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة على نشاط NCCR في وقت مبكر ومتأخر بشكل منفصل5. ويحلل هذا التقييم كذلك أثر إعادة الترتيب على نشاط اللجنة الوطنية للامتحانات والمقارنة مع التقارير الوطنية المتعلقة بالموارد المعتمدة في مجال الصدمات الأرضية5و9. مراسل بلازميد يأوي إشارة SV40 في وقت متأخر polyadenylation المصب من كل إطار القراءة المفتوحة فلوروفور لضمان معالجة قابلة للمقارنة وفعالة من كل من النصوص لtdTomato وeGFP، على التوالي. بالمقارنة مع أساليب qRT-PCR القائمة5،12،وهذا النهج القائم على FACS يمثل منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية البديل متوافق منذ عدم وجود بروتوكولات استخراج معقدة لثقافة الخلايا المصابة وليس مكلفة هناك حاجة إلى الأجسام المضادة لتلطيخ الفلورة المناعية. وعلاوة على ذلك، منذ يتم تحليل كمية محددة من الخلايا الفلورية عن طريق قياس التدفق الخلوي، وتحليل دورة الخلية تثبيط وكلاء ممكن أيضا بطريقة كمية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما أقرتها لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن (14-6028-BO).

1. جمع عينات الدم أو البول وعزل الحمض النووي فيروس الورم

  1. جمع ما لا يقل عن 3 مل من الدم في أنابيب EDTA أو البول في أنابيب اكتساب.
  2. الطرد المركزي العينة في 2500 × ز لمدة 15 دقيقة. إذا لزم الأمر، ماصة البلازما في أنبوب جديد وتخزين عينات البلازما في 4 درجة مئوية لعدة أيام أو تجميد في -20 درجة مئوية لتخزين أطول.
  3. إعداد 40 ميكرولتر من بروتيناس K في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل وإضافة 400 ميكرولتر من البلازما عن طريق الأنابيب.
  4. Lyse العينة عن طريق إضافة 400 درجة مئوية من العازلة lysis، دوامة لمدة 15 ثانية، وحضانة لمدة 10 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
  5. عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج دم الحمض النووي كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. باختصار، إضافة الكحول وتحميل lysates على عمود تدور تحتوي على غشاء الحمض النووي ملزمة السيليكا القائم. غسل الأعمدة عدة مرات لإنتاج الحمض النووي النقي.
  6. Elute الحمض النووي العائد في 30-50 درجة مئوية من TE العازلة.

2 - تضخيم منطقة المراقبة غير الترميزية

  1. تنفيذ الإجراء التالي في غرف منفصلة جسديا. استخدم غرفة معزولة لإعداد الكواشف وتوزيع المزيج على أنابيب PCR.
  2. إعداد المزيج الرئيسي لPRE-PCR باستخدام الزوج التمهيدي A (الجدول1) في حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية واستخدام الحمض النووي المعزول سابقا من الخطوة 1.6. تتم طباعة مخطط الأنابيب لإعداد المزيج الرئيسي لـ PCR قبل ومتداخلة في الجدول2.
  3. توزيع 45 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR.
  4. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول في أنابيب PCR.
    ملاحظة: استخدم غرفة أخرى من غرفة لإعداد المزيج الرئيسي لتجنب التلوث.
  5. قم بتشغيل PCR مع شروط رد الفعل كما هو موضح في الجدول 3. كرر التناطور، الصلب، والتمديد في 35 دورة.
  6. للتضخيم المتداخلة استخدام التمهيدي الزوج B إيواء مواقع تقييد لAgeIوSpeI (الجدول 1).
  7. تشغيل PCR المتداخلة مع شروط رد الفعل كما هو موضح في الخطوات 2.2 إلى 2.5 باستخدام 5 μL من PCR pre-.
  8. مزيج 10 درجة مئوية من المنتج PCR مع 2 ميكرولتر من 6X هلام صبغ التحميل. تحميل 10 درجة مئوية من المزيج على هلام أجاروز 1.5٪، وتشغيل هلام لمدة 30 دقيقة في 60 مل.
  9. تصور هلام باستخدام نظام وثائق الأشعة فوق البنفسجية المناسبة.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون حجم amplicon بين 300-500 نقطة أساس استناداً إلى ما إذا كانت إعادة الترتيب (عمليات الحذف أو الإدراج أو التكرارات) قد حدثت (الشكل2C).
  10. تنقية amplicons PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute amplicons PCR في 30 درجة مئوية من العازلة elution.
  11. إرسال amplicons لتسلسل Sanger باستخدام الزوج التمهيدي B.

3- استنساخ اللجنة الوطنية للاستنساخ في المراسل المزدوج الفلوري

  1. هضم amplicons النقي (الخطوة 2.10) مع AgeI وSpeI لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية كما هو موضح في الجدول 4.
  2. كرر الخطوة 2.10 وتنقية amplicons المهضوم.
  3. وبالتوازي مع ذلك، يهضم أيضا العمود الفقري للبلازميد (1.5 ميكروغرام) مع AgeI وSpeI لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية على النحو المبين في الجدول 5. هذه الخطوة تحتاج فقط إلى تنفيذ مرة واحدة. لردود الفعل اللاحقة، تجميد الهضم في -20 درجة مئوية.
  4. تحليل العمود الفقري بلازميد المهضوم على هلام أروز ذوبان منخفضة 0.8٪.
    ملاحظة: لا تقم بتشغيل الجل مع الحالي أعلى من 40 ما إلى هذا اللون. والإدراج المتوقع لمنطقة المتباعدة المستمد أصلاً من البلازميد pEX-K4 2-LTR CD313 هو 128 نقطة أساس (الشكل2C).
  5. تصور شظايا الحمض النووي باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (320 نانومتر) وقطع الفرقة العمود الفقري باستخدام مشرط نظيفة. نقل جزء هلام تذوب منخفضة في أنبوب جديد 1.5 مل microcentrifuge. تجنب أوقات التعرض للأشعة فوق البنفسجية الطويلة لمنع تلف الحمض النووي.
    ملاحظة: منذ يتم استخدام الأجاروز ذوبان منخفضة، فإنه ليس من الضروري لتنقية الحمض النووي قبل الربط.
  6. سخني العمود الفقري المعوّض على قطعة أغاروز منخفضة الذوبان لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية من أجل إذابة قطعة الجل واخلطي كل دقيقتين بواسطة الدوامة اللطيفة. يمكن استخدام الجل المذاب مباشرة للربط.
  7. يُلْقُ العمود الفقري والأمبيراليقّم باستخدام الليغاس الحمض النووي T4 خلال الليل عند 16 درجة مئوية باستخدام المخطط الموضح في الجدول 6.
  8. قم بإجراء التحول في E. coli باستخدام طريقة الصدمة الحرارية، وبكتيريا اللوحة على لوحات LB-amp، والثقافة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
  9. في اليوم التالي، حدد ثلاثة استنساخ إيجابية وإعداد بين عشية وضحاها E. الثقافات القولونية (5 مل من LB-Amp) والثقافة في 37 درجة مئوية.
  10. عزل بلازميد الحمض النووي باستخدام بروتوكولات قياسية كما هو موضح في مكان آخر14، أداء AgeI وSpeI الهضم للتحقق من استنساخ إيجابية وتصور قطع شظايا على هلام أغاروز 1٪. سيتم استبدال نطاق الخفض (128 bp) بتسلسل NCCR أكبر (300-500 bp، انظر أعلاه).
  11. إرسال بلازميد لتسلسل Sanger باستخدام التمهيدي EGFP-Nأو التمهيدي الزوج B (الجدول 1).
  12. منذ الطفرات قد تحدث تلقائيا، مقارنة نتائج التسلسل مع نتائج التسلسل التي تم الحصول عليها مع amplicon. استخدم فقط النسخ التي تحتوي على تسلسلات متطابقة مقارنة ً بـ amplicon.
  13. استخدام برنامج منضدة جزيئية (على سبيل المثال، مجانية GENtle 1.9.4 أو غيرها منبرامج تحرير التسلسل) لمحاذاة وتحرير التسلسلات التي تم الحصول عليها (الشكل 3).
  14. بدء تشغيل GENtle 1.9.4 واستيراد تسلسل اتّباع الحمض النووي بالنقر فوق الزر استيراد (سهم أخضر لأسفل).
  15. انقر على أداة ثم حدد محاذاة من القائمة (استخدام Ctrl + G كاختصار) واختيار تسلسل اتّباع الحمض النووي للمحاذاة.
  16. إضافة تسلسل إلى المحاذاة بالنقر فوق إضافة تسلسل أو إزالته بالنقر فوق إزالة. تضمين تسلسل توافق الآراء NCCR archetypical مثل JN19243815، لا تستخدم تسلسل NCCR من Dunlop-strain شائعةالاستخدام 16، لأنها تأوي إعادة ترتيب وازدواجية أخرى من BKPyV archetypical سلالات.
    ملاحظة: يحتوي NCCR بالفعل على codonبدء الترجمة (الشكل 3).
  17. اختيار طريقة للمحاذاة عن طريق النقر على خوارزمية في شريط الأدوات واختيار clustal W. تعيين معلمات المحاذاة لمطابقة 2؛ عقوبة تمديد الفجوة -1؛ عقوبة الفجوة -2 وانقر على موافق لتشغيل المحاذاة.

4. الانسياق العابر لخلايا HEK293T مع بلازميد المراسل والعلاج مع العوامل المضادة للفيروسات المحتملة

  1. لإعداد كميات كافية من الحمض النووي بلازميد لتجارب الانف المتحول اللاحقة إعداد ثقافة 150 مل بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد باستخدام مجموعة العزل بلازميد. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام مجموعات تنقية بلازميد أخرى.
  2. البذور 1 × 105 خلايا HEK293T في DMEM تحتوي على 10٪ FCS، البنسلين والعقديات (1X) لكل بئر من لوحة 12 جيدا 24 ساعة قبل التغوط والحضانة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للحفاظ على الانتشار النشط أثناء الانكسار.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا حوالي 80% مترافقة في التغوط.
  3. ضع 250 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصل ية منخفضة في أنبوب معقم وإضافة 1 ميكروغرام من كل DNA بلازميد مراسل ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب.
  4. أضف 3 ميكرولتر من كاشف الانف إلى خليط الحمض النووي، واخلطها برفق عن طريق الأنابيب والحضانة لمدة 15 دقيقة.
  5. يُضاف المزيج إلى الآبار ويُوزّع برفق على البئر.
  6. بعد 4 ساعة، استبدال supernatant مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على وكلاء الاختبار والسيطرة المذيبات. حضانة في 37 درجة مئوية حتى التحليل. في هذا المثال، تم استخدام مثبطات mTOR INK128 (100 نانوغرام/مل) ورابامايسين (100 نانوغرام/مل).

5. التنظير المجهري الفلوري والقياس السيتومي للتدفق

  1. فحص الخلايا للفلورة الحمراء والخضراء تحت المجهر الفلوري(الشكل 4).
    ملاحظة: الفلورة الحمراء والخضراء تتوافق مع التعبير الجيني BKPyV في وقت مبكر ومتأخر، على التوالي.
  2. بعد 72 ح بعد التغوط، يستنشق supernatant وغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من PBS الباردة.
  3. إضافة بلطف 500 درجة مئوية من التربسين وتحويل لوحة قليلا لتجنب انفصال سابق لأوانه من الخلايا. هذه الخطوة مهمة لتجنب doublets الخلية.
  4. بعد إضافة، إزالة التربسين مباشرة مع نفس غيض ماصة.
  5. حضانة الخلايا لمدة 5 دقائق على الأقل عند 37 درجة مئوية.
  6. إعادة تعليق الخلايا التربسية مع 1 مل من PBS تحتوي على 3٪ FCS ونقل التعليق في أنابيب FACS المسمى مسبقا.
  7. إضافة DAPI (1 ميكروغرام /مل) قبل تحليل FACS.
  8. تحليل الخلايا باستخدام مقياس التدفق. لكل عينة، قياس ما لا يقل عن 10،000 الخلايا الحية، والتي هي سلبية لتلطيخ DAPI.

6 - تحليل البيانات

  1. استيراد البيانات إلى برنامج تحليل قياس التدفق وإضافة عينات عن طريق النقر والسحب إلى مساحة العمل.
  2. انقر نقرا مزدوجا على الملف المستورد ة وإنشاء رسم بياني رسم. اختر FSC-A مقابل SSC-A بالنقر فوق محور x و y. بوابة السكان الخلية الرئيسية عن طريق النقر على المضلع على شريط الأدوات وتأطير السكان الخلية (الشكل5). اسم مجموعة الخلايا المختارة كما هو مطلوب (على سبيل المثال "الخلايا المفردة"). ستظهر "الخلايا المفردة" كمساحة عمل جديدة.
  3. المضي قدما في gating "خلايا واحدة" لDAPI السلبية (أي، "الخلايا الحية"). لتحديد الخلايا الحية مقارنة السكان الخلية مع وبدون تلطيخ DAPI. في كلا المخططات اختيار FSC-A مقابل المحيط الهادئ الأزرق-A.
  4. انقر على المستطيل واختر مجموعة الخلايا السالبة DAPI، قم بتسمية مجموعة الخلايا المختارة "الخلايا الحية"، وإنشاء مؤامرة نقطية جديدة تظهر FITC (eGFP) مقابل PE (tdTomato) كما هو موضح من قبل.
  5. إضافة رباعيات في "الخلايا الحية" عن طريق اختيار رباعية من شريط الأدوات. بوابة السكان عن طريق سحب مركز الربع إلى حافة كل السكان. الأرباع تمثل 1) eGFP-tdTOM-، 2) eGFP-tdTOM +، 3) eGFP + tdTOM-، 4) eGFP + tdTOM +.
    ملاحظة: نظراً للتراكب الطيفي لأطياف الانبعاثات بين شركة فيتك والمؤسسة العامة، فإن التعويض الأولي ضروري للتمييز بين الإشارات الحمراء والخضراء وتحقيق نتائج دقيقة.
  6. تحديد متوسط كثافة الفلورة (MFIs) عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الربع واختيار إضافة إحصائيات. اختر يعني وانقر فوق موافق. يتم عرض متوسط MFI الآن تحت السكان في قسم "الإحصاءات". تتوافق الربعان 2 و4 مع التعبير المبكر، بينما يمثل الربعان 3 و4 التعبير المتأخر.
  7. إضافة نسخ متماثلة إضافية بنفس الطريقة للقوة الإحصائية.
  8. ل [دتا سفي] تفسير خطة [مفي] قيم من مبكّرة ومتأخّرة داخل قضيب خطة:
  9. لمقارنة أنشطة NCCR التي تم الحصول عليها من جهات مانحة مختلفة أو سلالات الفيروسات، أضف عنصر تحكم نموذجي أو سلالة دنلوب16 وحدد مؤسسات التمويل الأصغر النسبية إلى 100%، وحساب قيم MFI النسبية. كرر مع كل تكرار وتحديد المتوسط والانحراف المعياري.
  10. لتقييم تأثير المركبات المحتملة على النشاط النسخي، تعيين السيطرة المذيبات إلى 100٪ ورسم MFI من الخلايا المعالجة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التجربة التمثيلية، تم قياس النشاط النسخي الدافع لمنطقة التحكم غير الترميزية من BK-polyoma من خلال قياس التدفق. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مثبط mTOR، والتي يمكن استخدامها لعلاج المرضى بعد إعادة تنشيط BKPyV، لتثبيطه للتعبير الجيني الفيروسي المبكر. ولهذه الغاية، تم استخدام حد مزدوج للمراسل الفلوري كما نشرت سابقا5. يتم توضيح نظام سير العمل الكلي للإعداد التجريبي في Figure 1. أولاً، تم جمع عينات الدم من المرضى الذين زرعوا في ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المقالة، يتم عرض طريقة شائعة الاستخدام تسمح بتحليل منطقة التحكم غير الترميز BKPyV (NCCR) مدفوعة نشاط المروج المبكر والمتأخر. يمكن قياس نشاط NCCR في وقت واحد ولا يحتاج إلى lysis من الخلايا المنقولة. وعلاوة على ذلك، يمكن تحليل عدد كبير نسبيا من الخلايا والمشاركة في نقل علامات إضافية لتطبيع قيم الفلورة ليست ضرورية.

جزء حرجة من هذا طريقة أنّ ال يستنسخ [نكر] سوفت احتويت تماما ال نفسه تسلسل بما أنّ يعيّن بال [أمبليسون] تسلسل, أيّ يماثل إلى الأغلبية [فرينت] حاضرة في المريضة بلازما. لتحقيق نتائ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تلقى يوهانس كوث منحا ً لأتعاب المتحدثين ونفقات سفرهم من أستيلاس ونوفارتي. حصلت ماريك وريدا على رسوم استشارية من نوفارتي. تلقى أوليفر فيتزكي منحاً للدراسات السريرية، ورسوم المتحدث، والأتعاب، ونفقات السفر من أمجين، أليكسيون، أستيلاس، باسيليا، بيوتيست، بريستول مايرز-سكويب، كوريفيو، كيسي، جيلاد، هيكسال، يانسن، الدكتور ف. كوهلر كيمي، MSD، نوفارتوس، روش، فايزر، سانوفي وتيفا.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر أصحاب البلاغ باربرا بليكمان على مساعدتها التقنية الممتازة. وقد تم دعم هذه الدراسات من قبل برنامج IFORES التابع لجامعة دويسبورغ- إيسن وكلية الطب في جامعة دويسبورغ- إيسن وبرنامج RIMUR التابع لتحالف جامعة روهر ومركز أبحاث ميركاتور رور (MERCUR). ويشكر المؤلفون يورغن - مانشوت - ستيفتونغ على زمالة الدكتوراه التي حصلت عليها هيلين سيرتزنغ وعلى الدعم المستمر. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ-إيسن (14-6028-BO) على جمع واستخدام مواد المرضى.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
سلم 100 نقطةNEBN3231يمكن استبدال أي سلم يصل نطاقه إلى 1 كيلو
2 سجلNEBN0550يمكن استبدال أي سلم يصل نطاقه إلى 10 كيلو بايت
Agar-Agar ، Kobe ICarl Roth5210.3
AgeI-HFNEBR3552
Ampicillin Natriumsalz CellpureCarl RothHP62.1
يمكن استبدال Aqua ad iniectabiliaBbraun2351744من قبل أي مصنع
BD FACSCanto & trade ؛ IIBD Biosciences
BD FACSDivaBD Biosciences
DAPISigma10236276001
وحدة الكاميرا DFC450CLeicaاستخدام أي كاميرا
بواسطة أي مصنع
DMIL مجهر LEDLeicaأي مجهر مضان يمكن استخدام
مجموعة أدوات الدم المصغرة للحمض النووييمكن استبدال Qiagen51104من قبل أي مصنع
E.coli DH5alpha Certified CellsThermo Scientific18258012
FBS SuperiorMerckMillipore50615يمكن استخدام أي FBS
FlowJo v10.5.3FlowJo، LLCيمكن استخدام أي برنامج لقياس التدفق الخلوي FBS
صبغة تحميل الجل ، أرجواني (6X) NEBB7024يمكن استبدال أي صبغة تحميل 6x
HEK293T الخلاياATCC11268تعبر هذه الخلايا بشكل أساسي عن مستضد T الكبير للفيروس السيميان 40 (SV40) ، وتم اختيار الاستنساخ 17 خصيصا لقابليته العالية للتعداد.
يمكن استبدال حاضنة HERAcell & reg 240i CO2Thermo Scientificمن قبل أي مصنع
HotStar PCR kitQiagen203203
Intas GelIntasاستخدام أي نظام تصور للحمض النووي الملون الذي يحتوي على مواد هلامية من الاغاروز
850081أي مصنع
Opti-MEMInvitrogen31985070من قبل أي مصنع
pBKV (34-2)ATCC45025بلازميد يؤوي الجينوم الكامل لسلالة BKPyV Dunlop ؛ تم استخدامه كعنصر تحكم إيجابي ؛ تسلسل الحمض النووي: KP412983
PBSGibco14190-136
PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal CyclerBio-Radالمنتج الذي توقفاستخدام أي دورة حرارية يمكن استخدام
مزيج النوكليوتيدات PCR ، 10 ملي مولارPromega#C1145يمكن استبداله من قبل أي مصنع
PCR1 و PCR2 Primersmetabionغير قابل للتطبيق. تمييع إلى (10 & micro; M) مع الماء الصف PCR
PenStrep (100x)Gibco15140-122من قبل أي مصنع
Roti & reg ؛ -GelStainCarl Roth3865وصمة عار قائمة على التألق لقياس تركيز dsDNA
SpeI-HFNEBR3133
T4-DNA LigaseNEBM0202
TransIT LT1MirusMIR2300
استبدال Trypsin 0.05٪ - EDTAGibco25300-054من قبل أي مصنع
يمكن استبدال ZymoPURE II Plasmid KitZymoD4201من قبل أي مصنع
أساس بايت سلم يمكن يمكن استبدالها يمكن يمكن استبداله يمكن استبدال عن العمل يمكن يمكن استبدال يمكن

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
  2. Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
  3. Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
  4. Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
  5. Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
  6. Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
  7. Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
  8. Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
  9. Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
  10. Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
  11. Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
  12. Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
  13. Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
  14. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247(2007).
  15. Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
  16. Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
  17. Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
  18. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
  19. Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
  20. Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
  21. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

BK PolyomavirusNon Coding Control RegionTranscriptional ActivityFlow CytometryDual Fluorescence ReporterHEK293T CellsAntiviral AgentsNCCR RearrangementsEarly Late Gene ExpressionFluorescence Microscopy

Related Articles