نحن نسخ وتحليل الجينات مراسل توليد الحمض النووي الريبي دائرية. هذه الجينات المراسل ة أكبر من الإنشاءات لتحليل الربط الخطي وتحتوي على عناصر Alu. للتحقيق في الحمض النووي الريبي الدائري ، يتم نقل المنشئات إلى الخلايا ويتم تحليل الحمض النووي الريبي الناتج باستخدام RT-PCR بعد إزالة الحمض النووي الريبي الخطي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بالإضافة إلى mRNAs الخطية، العديد من الجينات eukaryotic توليد الحمض النووي الريبي دائرية. يتم إنشاء معظم الحمض النووي الريبي الدائري عن طريق الانضمام إلى موقع لصق 5 'مع موقع لصق 3 'المنبع داخل ما قبل مرنا، وهي عملية تسمى الربط الخلفي. ومن المرجح أن يكون هذا التعميم بمساعدة الهياكل الثانوية في فترة ما قبل مرنا التي تجلب مواقع التوصيل إلى مكان قريب. في الجينات البشرية، ويعتقد أن عناصر ألو لتعزيز هذه الهياكل الحمض النووي الريبي الثانوية، وعناصر ألو وفيرة ويحمل التكامل قاعدة مع بعضها البعض عندما تكون موجودة في اتجاهات معاكسة في ما قبل مرنا. هنا، ونحن نصف توليد وتحليل كبير، Alu عنصر يحتوي على الجينات المراسل التي تشكل الحمض النووي الريبي الدائري. من خلال التحسين من بروتوكولات الاستنساخ ، يمكن إنشاء جينات المراسل مع ما يصل إلى 20 كيلوبايت طول الإدراج. ويتيح تحليلها في تجارب التعامَل المشترك تحديد العوامل التنظيمية. وهكذا، يمكن لهذه الطريقة تحديد تسلسل الحمض النووي الريبي والمكونات الخلوية المشاركة في تشكيل الحمض النووي الريبي دائرية.
المقدمة
الحمض النووي الريبي الدائري
الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي مغلقة بشكل التكافؤ واحد RNAs الذين تقطعت بهم السبل التي يتم التعبير عنها في معظم الكائنات الحية. يتم إنشاؤها من خلال الانضمام إلى موقع لصق المصب 5 'إلى موقع لصق المنبع 3 '، وهي عملية تسمى الربط الخلفي(الشكل 1A)1. متواليات في مرحلة ما قبل مرنا التي تعرض قاعدة تكميلية قصيرة مثل 30-40 NT جلب المواقع مرة أخرى لصق في محاذاة مناسبة لتشكيل circRNA2. في البشر، عناصر ألو 1، تمثل حوالي 11٪ من الجينوم3، تشكل هياكل الحمض النووي الريبي المزدوج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم الهياكل
- استخدم متصفح الجينوم UCSC24 لتحديد العناصر المتكررة اللازمة لتشكيل الحمض النووي الريبي الدائري ودمجها في الإنشاءات. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الالتمهيديات للتضخيم خارج العناصر المتكررة.
- لصق تسلسل الحمض النووي الريبي دائرية(الشكل التكميلي 1 هو تسلسل الاختبار) في https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start وحدد الكائن الحي الصحيح. إرسال التسلسل والذهاب إلى عرض المتصفح، تصغير 1.5x أو حسب الاقتضاء(الشكل 2A).
ملاحظة: يظهر تسلسل البحث في السطر العلوي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تسمح جينات المراسل بتحديد العوامل التنظيمية التي تؤثر على تكوين الحمض النووي الريبي الدائري. ومع ذلك ، فإن هذه الجينات المراسلة كبيرة وتحتوي على عناصر متكررة غالباً ما تجعل الحمض النووي غير مستقر. نظرا لحجمها الكبير ، غالبا ما يكون من الضروري حذف أجزاء من الإنترونات ، وهو ما يتحقق عن طريق تضخيم القطع الجينومية التي تحتوي على الإكسون والأجزاء الغير نظامية المحيطة الأصغر. يتم تجميع قطع الحمض النووي هذه بشكل أنزيمي ، مما يسمح بالبناء دون قيود على الإنزيمات.
مثال على الحمض النووي الريبي الدائري ال.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بشكل عام ، الحمض النووي الريبي الدائري منخفضة وفيرة1، مما يعقد دراسة وظيفتها وتشكيلها. على غرار RNAsالخطية 13، واستخدام minigenes مراسل يسمح لتحديد رابطة الدول المستقلة والعوامل عبر المفعول التي تنظم تشكيل الحمض النووي الريبي الدائري. وهكذا، يولد هذا النهج فرضيات يمكن اختبارها باستخدام الجينات الذاتية.
الخطوة الأكثر أهمية هي تصميم جين المراسل. التجميع الأنزيمي لشظايا الحمض النووي ("غيبسون الاستنساخ"27)يسهل هذا التصميم، كما.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا شيء للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع وزارة الدفاع منحة AZ180075. ستيفان ستام يشكر جاكلين نونان الوقف. آنا Pawluchin كان مدعوما من قبل DAAD، الألمانية برنامج التبادل الأكاديمي، جوستين R. ويلدن كان حاصلا على جائزة جامعة كنتاكي ماكس ستيكلر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| أداة البناء | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/< / a> | |
| Dark Reader Transilluminator. | من كلير للأبحاث | ||
| NEB | E2621S | ||
| مجموعة تنظيف الجل وتفاعل البوليميراز المتسلسل | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 موقع الاستنساخ | الاستنساخ | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf< / a> | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | بوليميراز بعيد المدى (NEB) ، iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | مجموعة البوليميراز طويلة المدى Qiagen |
| 18080044 | النسخ العكسي | Thermo Fisher | |
| Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies | |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter / Lucigen |
| الخلايا المختصة المستقرة | NEB | C3040H | NEB الخلايا المستقرة |
| القياسية الاستنساخ البكتيريا | NEB | C2988J | NEB5-alpha أداة ويب مختصة |
| لتصميم الاشعال | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/< / a> | |
| حسابات درجة الحرارة المستندة إلى الويب | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main< / a> |
المراجع
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Deininger, P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
