مقالة منهجية

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

DOI:

10.3791/59821

⸱

سبتمبر 26, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology / Oncology and Bone Marrow Transplantation, University of Miami Miller School of Medicine, 2Batchelor Children's Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Sylvester Comprehensive Cancer Center, University of Miami Miller School of Medicine, 5Holtz Children's Hospital, University of Miami Miller School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف من هذا البروتوكول هو عزل الخلايا أحادية النووية التي توجد في بروبريا لامينا القولون عن طريق الهضم الأنزيمي للأنسجة باستخدام الكولاجين. يسمح هذا البروتوكول بعزل الخلايا أحادية النووية بكفاءة مما يؤدي إلى تعليق خلية واحدة والتي بدورها يمكن استخدامها للنماذج المناعية القوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمعاء هي موطن لأكبر عدد من الخلايا المناعية في الجسم. أجهزة المناعة المعوية الصغيرة والكبيرة الشرطة التعرض للمستضدات الخارجية وتعديل الاستجابات للمحفزات المناعية المستمدة من الميكروبات قوية. لهذا السبب، الأمعاء هي موقع الهدف الرئيسي من خلل التنظيم المناعي والتهاب في العديد من الأمراض بما في ذلك، ولكن، لا تقتصر على أمراض الأمعاء الالتهابية مثل مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، ومرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) بعد العظام زرع نخاع (BMT)، والعديد من الحالات التحسسية والمعدية. وتستخدم نماذج مورين من التهاب الجهاز الهضمي والتهاب القولون بشكل كبير لدراسة مضاعفات GI ولتحسين استراتيجيات ما قبل السريرية للوقاية والعلاج. البيانات التي تم جمعها من هذه النماذج عن طريق العزلة والتحليل الفينوتي للخلايا المناعية من الأمعاء أمر بالغ الأهمية لمزيد من الفهم المناعي التي يمكن تطبيقها لتحسين اضطرابات الجهاز الهضمي والالتهابات الجهازية. يصف هذا التقرير بروتوكولًا عالي الفعالية لعزل الخلايا أحادية النووية (MNC) عن القولون باستخدام واجهة تدرج تدرج ية مختلطة قائمة على السيليكا. هذه الطريقة reproducibly يعزل عددا كبيرا من الكريات البيض قابلة للحياة مع التقليل من تلوث الحطام، مما يسمح اللاحقة الفينول المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي أو غيرها من الأساليب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن الجهاز الهضمي (GI) مخصص في المقام الأول لمعالجة وإعادة امتصاص المواد الغذائية من المواد الغذائية، فإن الجهاز الهضمي يحافظ أيضا على أدوار مركزية في سلامة الأوعية الدموية، اللمفاوية، والجهاز العصبي والعديد من الأجهزة الأخرى من خلال في الغشاء المخاطي والجهاز المناعي تحت المخاطية1. الجهاز المناعي GI له دور مؤثر في كل من الجهاز الهضمي والصحة الجهازية بسبب تعرضه المستمر للمستضدات الأجنبية من الغذاء، والبكتيريا commensal، أو مسببات الأمراض الغازية1،2. وهكذا، يجب على الجهاز المناعي GI الحفاظ على توازن دقيق الذي يتسامح مع المستضدات غير المسببة للأمراض في حين تستجيب بشكل مناسب للمستضدات المسببة للأمراض1،2. عندما يتم تعطيل توازن التسامح والدفاع، يمكن أن يحدث خلل التنظيم المناعي الموضعي أو الجهازي والالتهاب مما يؤدي إلى عدد لا يحصى من الأمراض1،2،3.

الأمعاء تأوي ما لا يقل عن 70٪ من جميع الخلايا اللمفاوية في الجسم4. معظم التفاعلات المناعية الأولية تنطوي على واحدة على الأقل من ثلاث محطات المناعة في الأمعاء: 1) بقع باير، 2) الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة (IEL) و 3) الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). يتكون كل من هذه من شبكة معقدة مترابطة من الخلايا المناعية التي تستجيب بسرعة للتحديات المناعية الطبيعية في الأمعاء5. يقتصر على ستروما فوق الغشاء المخاطي العضلي، وpropria لامينا منظم بشكل فضفاض هو النسيج الضام من الغشاء المخاطي للمعوة الأمعاء ويشمل السقالات للزغب، والأوعية الدموية، والصرف اللمفاوي، والجهاز العصبي المخاطي، فضلا عن العديد من الفطرية والمجموعات الفرعية المناعيةالتكيفية6و7و8و9. وتتألف LPL من CD4+ وCD8+ T الخلايا في نسبة تقريبية من 2:1، خلايا البلازما وخلايا النسب النخاعي بما في ذلك، الخلايا التقشرية، والخلايا الصاري، الحمضات والضامة6.

هناك اهتمام متزايد في فهم خلل التنظيم المناعي والتهاب الأمعاء لأنها تتعلق بحالات المرض المختلفة. مثل أمراض كرون والتهاب القولون التقرحي كل ذلك يظهر مستويات متفاوتة من التهاب القولون10،11،12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرضى الذين يعانون من اضطرابات خبيثة أو غير خبيثة في النخاع أو الجهاز المناعي الذين يخضعون لزراعة نخاع العظم الالوجيني (allo-BMT) تطوير أشكال مختلفة من التهاب القولون بما في ذلك 1) السمية المباشرة من أنظمة تكييف قبل BMT، 2) العدوى الناجمة عن كبت المناعة بعد BMT و 3) الكسب غير المشروع مقابل مرض المضيف (GVHD) مدفوعا الخلايا T من النوع المانح ة رد فعل على المستضدات المانحة في الأنسجة بعد BMT13،14،15. كل هذه المضاعفات ما بعد BMT يؤدي إلى تغييرات كبيرة في الوسط المناعي للأمعاء16،17،18. تسمح الطريقة المقترحة بتقييم يمكن الاعتماد عليه لتراكم الخلايا المناعية في القولون الفأر، وعندما تطبق على متلقي المورين بعد BMT، تسهل فحص كفاءة لكل من الخلايا المناعية المانحة والمتلقية المشاركة في تحمل زرع19 ،20. وتشمل الأسباب الإضافية لالتهاب الأمعاء الأورام الخبيثة، والحساسية الغذائية، أو اضطراب ميكروبيوم الأمعاء. يسمح هذا البروتوكول بالوصول إلى الخلايا أحادية النووية في الأمعاء من القولون، ومع التعديلات، إلى الكريات البيض في الأمعاء الدقيقة في أي من هذه النماذج المارين قبل السريرية.

بحث PubMed باستخدام مصطلحات البحث "الأمعاء والخلية المناعية والعزلة" يكشف أكثر من 200 منشورات تصف أساليب هضم الأمعاء الدقيقة لاستخراج الخلايا المناعية. ومع ذلك، فإن البحث عن الأدب مماثلة للقولون لا تسفر عن بروتوكولات محددة جيدا تحديد عزل الخلايا المناعية من القولون. قد يكون هذا لأن القولون لديه طبقات أكثر العضلات والخلالية، مما يجعل من الصعب هضم تماما من الأمعاء الدقيقة. على عكس البروتوكولات القائمة، يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد كولاجيناز E من الهتستيك Clostridium دون الكولاجين البكتيرية الأخرى (Collagenase D / Collagenase I). نحن نثبت أنه، باستخدام هذا البروتوكول، يمكن تحقيق هضم الأنسجة القولونية مع الحفاظ على نوعية الخلايا المناعية أحادية النووية الأمعاء المعزولة (MNC) دون إضافة الكواشف المضادة للتكتل مثل فيرسنال الصوديوم (EDTA)، Dispase II، و ديوكسيريبونوكليس 1 (DNAse I)21،22،23. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح باستخراج قوي قابل للاستنساخ من MNC قابلة للحياة من القولون مورين لمزيد من الدراسات الموجهة، وينبغي أن تصلح لدراسة المناعة من القولون أو (مع التعديلات) الأمعاء الدقيقة24، 25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع الدراسات بموجب بروتوكولات أبحاث القوارض التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لكلية الطب بجامعة ميامي ميلر، والتي تفي بالمعايير البيطرية التي وضعتها الرابطة الأمريكية لعلوم الحيوانات المختبرية (AALAS).

1. إعداد الحلول

  1. كما هو موضح في الجدول 1، وإعداد المخزن المؤقت القولون، والسيليكا القائم على كثافة فصل الوسائط 100٪، والسيليكا القائم على كثافة فصل وسائل الإعلام 66٪، السيليكا القائم على كثافة فصل وسائل الإعلام 44٪، Collagenase E التخزين المؤقت الهضم، وFACS العازلة.
    1. إعداد المخزن المؤقت للقولون في اليوم السابق للإجراء وتخزينه بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    2. إعداد 100٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في اليوم السابق للإجراء وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، ووضع في درجة حرارة الغرفة صباح الإجراء للذوبان.
    3. إعداد 66٪ و 44٪ من وسائل الإعلام الفصل القائم على السيليكا في صباح العزلة، وذلك باستخدام درجة حرارة الغرفة 100٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام والقولون العازلة.
    4. قياس الكمية المناسبة من كلوستريديوم الهيستوريكيوم المستمدةمن الكولاجين E وتخزينها في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها قبل الإجراء. في صباح اليوم التالي، تذوب في الحجم المناسب من المخزن المؤقت القولون لاستخلاص الكولاجين الهضم العازلة. لجميع الحضانة مع الكولاجين التخزين المؤقت الهضم في يوم الإجراء، قبل تسخين الحلول إلى 37 درجة مئوية.
  2. بالنسبة لكامل خطوات البروتوكول، احتفظ بجهاز طرد مركزي واحد عند درجة حرارة 20 درجة مئوية وسرعة دوران 859 × ز،مع تعطيل الفرامل (0 تباطؤ) لتدرج الطرد المركزي. تعيين آخر إلى 4 درجة مئوية وسرعة دوران من 859 × ز،مع التباطؤ القياسية، لخطوات الغسيل.

2. حصاد القولون

  1. قتل الماوس عن طريق خنق CO2 متبوعاً بطريقة تأكيدية معتمدة من AALAC.
  2. وضع الماوس في موقف supine ورذاذ الفراء مع الإيثانول 70٪. باستخدام مقص الأنسجة الكبيرة، وجعل شق خط الوسط الرأسي وفضح الصفاق سليمة.
  3. باستخدام مقص تشريح غرامة، فتح التبلل. استخدام ملقط لنقل الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد وفضح القولون التنازلي. سحب قليلا صعودا على القولون التنازلي لفضح أقصى قدر من الجزء المستقيم من القولون. قطع المستقيم القاصي في عمق الحوض وتشريح وإزالة القولون بأكمله كوحدة واحدة، من المستقيم القاصي إلى غطاء الجحيق.
  4. نقل القولون في 20 مل المبردة القولون العازلة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل.

3. تنظيف القولون

  1. ضع القولون على منشفة ورقية مبللة واستخراج البراز الصلب عن طريق تطبيق ضغط خفيف على جدار الأمعاء مع نهاية حادة من مقص أو ملقط.
  2. ضع القولون في طبق بيتري واغسل الأمعاء بـ 10 مل من المخزن المؤقت للقولون المبرد باستخدام حقنة 10 مل مع إبرة تعبئة حادة 18 غرام.
  3. نقل القولون إلى منشفة ورقية مبللة كولون العازلة وإزالة mesentery والدهون مع نهاية حادة من مقص.
  4. ضع القولون في طبق بيتري مملوء بـ 5-10 مل مبردة بـ Colon Buffer التي تثير التحريك يدويًا لغسل المحتويات القولونية المتبقية. كرر 2-3 مرات.
  5. قطع القولون طوليا من نهاية المستقيم أكثر العضلات إلى القولون القريب (توليد قطعة واحدة مستطيلة مفتوحة القولون) في طبق بيتري مليئة الطازجة المبردة القولون العازلة. تجاهل الوسائط الموجودة وإعادة تعبئتها باستخدام المخزن المؤقت للنقطتين المبردة النظيفة.
  6. غسل الأمعاء 3 مرات عن طريق دوامة بقوة في طبق بيتري واستبدال 5-10 مل من المخزن المؤقت القولون المبردة بعد مع كل غسل.
  7. ضع أنسجة القولون المستطيلة على منشفة ورقية مبللة بالمخزن المؤقت للقولون واقطعها عن طريق تقطيعها أفقياً ثم إلى أجزاء صغيرة (3 مم × 3 مم).
  8. جمع شظايا القولون بعناية باستخدام ملقط غرامة في 20 مل المبردة القولون العازلة في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50مل.
  9. غسل شظايا القولون 3 مرات، كل غسل في 20 مل القولون العازلة، عن طريق دوامة بقوة أنبوب لمدة 30 ث. بين كل التحريض، والسماح لشظايا الأنسجة لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب. يستنشق المزيل أو الفراغ المنثقب مع منع فقدان جزء الأنسجة في عملية الطموح بين كل غسل.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لتغيير الأنبوب بعد كل غسل.

4. الكولاجين الهضم 1

  1. إضافة 20 مل من خزان الهضم Collagenase إلى شظايا القولون غسلها في أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50 مل.
  2. وضع أنبوب مغلق 50 مل في 37 درجة مئوية في شاكر المدارية الحاضنة مع معدل دوران تعيين في 2 × ز لمدة 60 دقيقة. إذا لزم الأمر، وزيادة معدل دوران تدريجيا لضمان عدم وجود شظايا الأنسجة تسوية إلى أسفل الأنبوب.

5. إعداد التدرجات وسائل الإعلام الفصل القائم على السيليكا

  1. إعداد 66٪ و 44٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام، وذلك باستخدام 100٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في 20 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) والقولون العازلة.
  2. صب 5 مل من 66٪ على أساس السيليكا كثافة فصل وسائل الإعلام في كل من 3 أنابيب البولي بروبلين 15 مل منفصلة. إعداد 3 أنابيب لكل القولون. هذا يشكّل ال [هيغر دنستي] قاعدة من التدرج عزل إجراء, على أيّ [لوور دنستي] فصل أوساط كنت طبقات أن يخلق الفصل تدرج.
  3. يُحفظ عند درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى يُستعمل.

6. جمع سوبرناتانت من الهضم 1

  1. جمع فقط supernatant باستخدام ماصة المصلية 25 مل وتصفية supernatant من خلال 40 ميكرومتر المسام الترشيح النسيج مصفاة خلية وضعت في أنبوب بولي بروبلين بولي بروبلين نظيفة 50 مل مخروطي، بعد اكتمال الهضم Collagenase 1. يجب الحرص على عدم استنشاق أي شظايا الأنسجة الموجودة.
    ملاحظة: الاحتفاظ بأي شظايا الأنسجة المرئية المتبقية في الأنبوب. هذه سوف تخضع الهضم الكولاجين الثاني (الخطوة 8).

7. تبريد الكولاجين الهضم العازلة

  1. ملء أنبوب البولي بروبلين 50 مل تماما مع المخزن المؤقت القولون المبردة.
    ملاحظة: كولاجيناز نشط عند 37 درجة مئوية. وبالتالي العازلة المبردة يعطل هذا الإنزيم.
  2. طرد مركزي الأنبوب في 4 درجة مئوية في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
    1. تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ. غسل الخلايا مع 25 مل من المخزن المؤقت القولون الطازجة والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقائق.
    2. إعادة تعليق بيليه في أقل من 1 مل من المخزن المؤقت القولون المبردة الطازجة.
    3. وضع أنبوب البولي بروبلين البولي بروبلين 50 مل مخروطي على الجليد.

8. الكولاجين الهضم 2

  1. كرر الخطوة 4 (الهضم 1) مع أجزاء الأنسجة المتبقية التي تم الاحتفاظ بها من الخطوة 6.1.

9. تصنيف الأنسجة بعد الهضم 2

  1. اغسل شظايا الأنسجة بقوة ذهاباً وإياباً بين الأنبوب وحقنة 10 مل من خلال إبرة 18 G حادة.
  2. كرر هذا التدفق لمدة لا تقل عن 7-8 ممرات كاملة، وتستمر حتى لا تكون شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام مرئية.

10. تصفية الخلايا

  1. تمرير تعليق تصنيف الأنسجة من خلال 40 ميكرومتر المسام مصفاة خلية النسيج الترشيح في أنبوب البولي بروبلين 50 مل نظيفة.
  2. غسل مصفاة خلية النسيج الترشيح مع 10 مل المبردة القولون العازلة لاستعادة أي خلايا المحاصرين في مرشح.

11. تبريد الكولاجين الهضم

  1. ملء أنبوب البولي بروبلين مخروطي 50 مل إلى الحافة مع المخزن المؤقت القولون المبردة.
    ملاحظة: درجة حرارة القولون العازلة أمر بالغ الأهمية لضمان تبريد نشاط الكولاجين.
  2. تدور في 4 درجة مئوية و 800 × ز لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ.
  4. يغسل عن طريق إعادة تعليق في 25 مل من المخزن المؤقت القولون المبردةالطازجة، تليها الطرد المركزي في 4 درجة مئوية، 800 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل supernatant عن طريق الطموح فراغ.
  6. تجمع بيليه علقت من الكولاجين الهضم 1 (الخطوة 7) إلى أنبوب المقابلة لها من الخطوة 11.4.
  7. كرر الخطوة 11.4 (غسل والطرد المركزي).

12. السيليكا القائمة على كثافة فصل الوسائط التدرج الفصل

ملاحظة: تنفيذ الخطوات 12-18 في أسرع وقت ممكن، لضمان التبريد السريع لنشاط الكولاجين.

  1. بعد الخطوة 11.7، إعادة تعليق كل بيليه في 24 مل المجموع من 44٪ على أساس السيليكا الكثافة فصل وسائل الإعلام لكل القولون.
  2. طبقة ببطء 8 مل من وسائل الإعلام من الخطوة 12.1 على كل من الأنابيب الثلاثة التي أعدت في الخطوة 5.2 (تحتوي على 66٪ من الوسائط القائمة على كثافة السيليكا الفصل)، وذلك باستخدام ماصة المصلية 10 مل. الحفاظ على تدفق ثابت وبطيء من 44٪ كثافة فصل الوسائط مع طبقات التدرج من أجل تجنب تعطيل واجهة.
  3. قم بموازنة جميع الأنابيب داخل جرافات الطرد المركزي بعناية باستخدام مقياس وزن أو توازن.
  4. تدور الأنابيب 20 دقيقة في 859 × ز في جهاز طرد مركزي دون الفرامل في 20 درجة مئوية. السماح للدوارات أن تأتي لاستكمال بقية قبل إزالة الأنابيب، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج.

13. جمع الخلايا أحادية النووية من واجهة التدرج

  1. تصور واجهة التدرج (بالقرب من علامة 5 مل)، حيث عادة ما يكون هناك نطاق أبيض سمك1-2 مم (يحتوي على MNC).
    ملاحظة: قد يرى المرء أو لا يرى فرقة بيضاء. ومع ذلك، سوف MNC يكون في هذه الواجهة وينبغي سحابة وضوح واجهة التدرج.
  2. فراغ يستنشق وتجاهل أعلى 7 مل من التدرج العلوي للسماح أسهل الوصول إلى ماصة إلى واجهة.
  3. باستخدام الشفط اليدوي المستمر وحركة المعصم الدورية ثابت، وجمع طبقة واجهة من الخلايا في أنبوب بولي بروبلين بولي بروبلين نظيفة 50 مل مخروطي. جمع حتى واجهة بين التدرجات 2 واضحة والحرارية (واضحة من الخلايا).
  4. ملء أنبوب جمع مع 50 مل من المخزن المؤقت FACS المبردة. تدور في 4 درجة مئوية، 800 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. يستنشق supernatant عن طريق التطلع فراغ وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من FACS العازلة.
  6. عد الخلايا على مقياس الهيموكيتومات في تخفيف 1:2 باستخدام أساليب استبعاد الخلايا الميتة المناسبة.
  7. انتقل إلى FACS تلطيخ أو غيرها من الاختبارات مع MNC القولون معزولة حديثا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند العمل مع نماذج مرض القولون المورين، فمن المفيد أن تكون قادرة على كل من القياس الكمي وتقييم نوعيا، بين MNC من القولون، والمجموعات الفرعية متعددة الخلايا المناعية المشاركة في العملية الالتهابية. وييسر تعليق الخلية الواحدة للشركات عبر الوطنية التي تم الحصول عليها من خلال تطبيق هذا البروتوكول هذا الوصف الفينوتي بطريقة قوية ويمكن استنساخها. كدليل على المبدأ لتطبيق طريقة العزل هذه في ظل إعدادات تجريبية متنوعة، استرجعنا MNC القولون باستخدام هذه الطريقة وقمنا بالقياس السيتوميعلى الخلايا المعز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول البصري الأساليب التي يمكن تحملها بشكل جيد لعزل الخلايا أحادية النووية القولونية بما في ذلك الخلايا الليمفاوية لامينا بروبريا (LPL). وبالنظر إلى أن هذا البروتوكول تم تحسينه في تقييم نماذج التهاب القولون الماوس بعد زرع شديدة حيث السيتوكينات الالتهابية وإصابة الأنسجة تصلح لضعف قدرة MNC المستردة، ونحن نتوقع أن هذه الأساليب يمكن ترجمتها إلى أخرى التطبيقات التي تتطلب التحليل الفينوتي للملية القولونية. وتشمل هذه ولكن، لا تقتصر على تقييم التهاب القولون في نماذج الماوس من مرض التهاب الأمعاء، ودراسات الاستجابات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح #1K08HL088260 و #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) ومؤسسة Batchelor لبحوث الأطفال (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). C57BL/6 وBALB / ج الفئران المستخدمة في هذه الدراسة إما ولدت في منشأتنا أو المقدمة من مختبرات جاكسون أو تاكونيك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
60 مم Petri DIshThermo Scientific150288
1x PBSCorning21-040-CV
10x PBSLonza BioWhittakerBW17-517Q
10 مل ماصة مصلية يمكن التخلص منهاCorning4100
10 مل حقنةبيكتون ديكنسون302995
15 مل أنابيبمخروطية غير معقمةTruLineTR2002
18 G إبرة حادةبيكتون ديكنسون305180
25 مل ماصة مصلية يمكن التخلص منهاكورنينج4250
40 & م حجم المسام مصفاة الخليةCorning352340
50 مل Falcon TubeCorning21008-951
ألبومين مصل البقر (BSA)SigmaA4503-1KG
Fixation BufferBiolegend420801
E. coli< / em> Collagenase E من Clostridium histolyticumSigmaC2139
EDTA ، 0.5 متر معقم الحلAmrescoE177-500ML
مصل الأبقار الجنينيالحراري / فيشر Scientific -HyCLoneSV30014.03
HEPESGE Healthcare-HyCloneSH30237.01
PercollGE Healthcare-LifeSciences 1708901
RPMI MediumCorning17-105-CV
الصوديوم أزيدVWR علوم الحياة Amresco97064-646
تريبان بلولونزا بيوويتاكر17-942E

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
  2. Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
  3. Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
  4. Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
  5. Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Waisman, A., Becher, B. , Humana Press. New York, NY. 21-25 (2014).
  6. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
  7. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
  8. Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
  9. Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
  10. Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
  11. Harb, W. J. Crohn's Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
  12. Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
  13. Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
  14. Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
  15. Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
  16. Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
  17. Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
  18. Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
  19. Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
  20. van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
  21. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114(2016).
  22. Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281(2018).
  23. Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
  24. Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
  25. Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
  26. Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
  27. Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  28. Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
  29. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
  30. Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
  31. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  32. van der Heijden, P. j, Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

E FACS

مقالات ذات صلة