يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قصيرة الأجل الحرة العائمة شريحة الثقافات من الدماغ البشري الكبار

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59845

⸱

نوفمبر 5, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Immunology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 2Department of Physiology, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 3Department of Pathology and Forensic Medicine, Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo, 4Department of Anatomy, Institute of Biosciences, São Paulo State University, 5Clinical Hospital at the Ribeirão Preto Medical School, University of São Paulo

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة من الدماغ البشري الكبار. البروتوكول هو اختلاف أسلوب الثقافة شريحة تستخدم علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء. انها بسيطه ، وفعاله من حيث التكلفة ، وأوصيت لتشغيل اختبارات قصيرة الأجل تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالعمر.

الملخص

التنميط العضوي ، أو الثقافات الشريحة ، وقد استخدمت علي نطاق واسع لنماذج الجوانب من الجهاز العصبي المركزي يعمل في المختبر. علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات في علوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه تلك التي من البشر. استخدام الانسجه البشرية الكبار لاعداد شريحة الثقافات جذابة بشكل خاص لتعزيز فهم الامراض العصبية البشرية ، كما انها تحمل خصائص فريدة من نوعها من الدماغ البشري الناضجة التي تفتقر إلى الشرائح المنتجة من القوارض (عاده حديثي الولادة) النسيج العصبي. يصف هذا البروتوكول كيفيه استخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين الاحياء الذين قدموا إلى جراحه المخ المعدية لاعداد الثقافات القصيرة الأجل والعائمة الحرة. وتقدم أيضا إجراءات لصيانة واجراء اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلايا البيولوجية باستخدام هذه الثقافات. تظهر النتائج التمثيلية ان التصفيح القشري البشري النموذجي يتم الاحتفاظ به في شرائح بعد 4 أيام في المختبر (DIV4) ، مع وجود متوقع لأنواع الخلايا العصبية الرئيسية. وعلاوة علي ذلك ، الشرائح في DIV4 الخضوع للموت خليه قويه عند الطعن مع التحفيز السامة (H2O2) ، مما يدل علي امكانيه هذا النموذج لتكون بمثابه منصة في اختبارات موت الخلايا. هذا الأسلوب ، وهو بديل ابسط وفعاله من حيث التكلفة للبروتوكول المستخدمة علي نطاق واسع باستخدام ادراج غشاء ، ويوصي بشكل رئيسي لتشغيل المقايسات علي المدى القصير تهدف إلى كشف أليات الضمور العصبي وراء امراض الدماغ المرتبطة بالسن. وأخيرا ، علي الرغم من ان البروتوكول مكرس لاستخدام الانسجه القشرية التي تم جمعها من المرضي الذين قدموا إلى العلاج الجراحي لصرع الفص الصدغي المقاوم للادويه ، الا انه يقال ان الانسجه التي يتم جمعها من مناطق/ظروف الدماغ الأخرى يجب ان تكون أيضا تعتبر مصادر لإنتاج الثقافات شريحة العائمة الحرة مماثله.

المقدمة

استخدام عينات الإنسان في البحوث هو بشكل لا لبس فيه خيارا كبيرا لدراسة امراض المخ البشرية ، والتقنيات الحديثة فتحت طرقا جديده لتجريب قويه واخلاقيه باستخدام الانسجه المستمدة من المريض. وقد استخدمت أساليب مثل الثقافات العضوية/شريحة أعدت من الدماغ البشري الكبار بشكل متزايد في نماذج مثل optogenetics1، الكهربية2،3،4،5، اللدونة 6،7،8،9، السمية العصبية/نيوروبروتكايشن10،11،12،13، العلاج الخلوي14، فحص المخدرات15،16،17، علم الوراثة وتحرير الجينات12،18،19،20، من بين أمور أخرى ، كاستراتيجية لتحسين فهم الامراض العصبية خلال مرحله البلوغ.

يعتمد فهم أليات الكامنة وراء امراض المخ البشرية علي الاستراتيجيات التجريبية التي تتطلب عددا كبيرا من المواضيع. وعلي النقيض من ذلك ، في حاله الثقافات الشريحة ، علي الرغم من ان الوصول إلى عينات الإنسان لا يزال صعبا ، فان امكانيه توليد ما يصل إلى 50 شرائح من عينه قشريه واحده تلتف جزئيا علي شرط تجنيد متطوعين متعددين عن طريق زيادة عدد من النسخ المتماثلة وأداء المقايسات لكل الانسجه التي تم جمعها21.

وقد وصفت العديد من البروتوكولات للثقافات الدماغ العضوية/شريحة الثقافات ، بدءا من الكلاسيكية كوة المسودات22،23 إلى الاسطوانه أنبوب24،25،26، شبه نفاذيه الاغشيه واجهه27،28،29،30، والحرة العائمة شرائح31،32. اعتمادا علي خصوصيات التصميم التجريبي ، كل تقنيه لها مزاياها الخاصة وعيوبها. قصيرة الأجل, العائمة الحرة شرائح الثقافات من العقول البشرية الكبار في بعض الحالات مفيده علي الطريقة التي يستخدمها Stoppini et al.27, إذا النظر في حقيقة انه علي الرغم من بقاء الخلية علي المدى الطويل في المختبر عاده ما يكون مصدر قلق كبير عند تقييم ثقافة أسلوب, في كثير تجارب فقط [شورت فتر] من وقت في ثقافة لازمه12,31,32,33,34,35. وفي ظل هذه الظروف ، فان استخدام الثقافات العائمة الحرة يقدم ميزه كونها ابسط وأكثر فعاليه من حيث التكلفة ، فضلا عن انها تشبه بشكل أدق حاله الانسجه البشرية الاصليه من الشرائح المحتفظ بها في الثقافة علي مدي 2-3 أسبوعا.

علي الرغم من إمكانات شريحة الثقافات لعلوم الأعصاب ، والدراسات التي تستخدم الانسجه العصبية الكبار لاعداد مثل هذه الثقافات لا تزال نادره ، وخاصه من البشر. توضح هذه المقالة بروتوكول لاستخدام انسجه المخ التي تم جمعها من المتبرعين البشريين الاحياء المقدمة لجراحه الدماغ المعدية لاعداد الثقافات شريحة العائمة الحرة. وترد تفاصيل إجراءات الحفاظ علي اختبارات البيولوجيا الحيوية والخلوية وأداءها باستخدام هذه الثقافات. وقد ثبت هذا البروتوكول قيمه لتحليل القدرة علي البقاء ووظيفة الخلايا العصبية في التحقيقات علي أليات الامراض العصبية المرتبطة بمرحله البلوغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقدتم الحصول علي انسجه دماغ الكبار الحية من المرضي الذين يخضعون لجراحه الأعصاب المعدية لعلاج الصرع الفص الصدغي الدوائي (الشكل 1ا). وقد وافقت لجنه الأخلاقيات علي جميع الإجراءات من مستشفي العيادات في مدرسه ريبيراو بريتو الطبية (17578/2015) ، ووافق المرضي (أو الأشخاص المسؤولون عنها قانونيا) علي شروط الموافقة المستنيرة ووقعوا عليها. تم جمع الانسجه من قبل فريق جراحه المخ والأعصاب في مركز جراحات الصرع (CIREP-مستشفي العيادات في مدرسه ريبيراو بريتو الطبية ، جامعه ساو باولو ، البرازيل).

1-تعقيم المواد

ملاحظه: يجب تعقيم جميع المواد والحلول قبل الاستخدام.

  1. تعقيم جميع الاداات الجراحية والاهتزاز المواد التشريح (حامل سكين ، عينه القرص ، علبه العازلة) في فرن تعقيم جاف ل 4 ح في 180 درجه مئوية.
  2. تعقيم المواد أو المعدات الحساسة لدرجه الحرارة عن طريق الاشعه فوق البنفسجية أو أشعه جاما.
  3. تعقيم وسائل الاعلام والحلول عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال اغشيه المسام 0.22 μm.

2-اعداد الحلول

  1. اعداد 15-20 mL من الحل النقل: 50 ٪ v/v هانكس "محلول الملح المتوازن (HBSS) pH 7.4 ، 50 ٪ v/v القاعدية المتوسطة لصيانة الخلايا العصبية الدماغ بعد الولادة والكبار (جدول المواد) ، تستكمل مع 10 ملم 4-(2-هيدروكسي ايثيل)-1- حمض بيبيرازينيثانيسولفونيك (Hepes) ، 3 ملغ/مل الجلوكوز ، و 33 ميكروغرام/مل جنتاميسين.
    ملاحظه: يجب ان يكون حل النقل المبردة والأوكسيجين (محتدما مع الغاز كربوجين) لمده 20 دقيقه علي الأقل قبل جمع عينه.
  2. اعداد 300 مل من محلول التقطيع (HBSS تستكمل مع 10 ملم HEPES و 3 ملغ/مل الجلوكوز) وتبرد عليه في الفريزر إلى نقطه تشكيل البلور الاولي.
  3. اعداد 20 مل من الثقافة المتوسطة: القاعدية المتوسطة لصيانة الخلايا العصبية الدماغ بعد الولادة والكبار (جدول المواد) تستكمل مع 1 ٪ L-الجلوتامين مشتق (جدول المواد) ، 2 ٪ تكمله للثقافة العصبية (جدول المواد) ، 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين ، و 0.25 ميكروغرام/مل الامفوتيريسن B.

3. إنشاء جهاز تشريح

ملاحظه: يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل مثالي بمساعده زميل بسبب الخدمات اللوجستية لجمع العينات في غرفه الجراحة.

  1. في دلو من الجليد المضافة الملح ، والسماح للحل تشريح بقية تحت خليط كربوجين محتدما (95 ٪ O2، 5 ٪ CO2) لمده 20 دقيقه علي الأقل قبل الاستخدام.
  2. اعداد كتله من 3 ٪ اجنشا (ما يقرب من 2 سم × 2 سم × 2 سم) والغراء إلى القرص العينة الذبذبات من أجل خلق دعم ميكانيكي إضافي لعينه الانسجه خلال تشريح (الشكل 1ه).
  3. تعيين الذبذبات لتقطيع: سمك القسم من 200 μm ، وتواتر الاهتزاز من 100 هرتز ، وسرعه التقطيع بين 0.5-1.0 mm/s.
  4. قفل صينية العازلة الذبذبات إلى قاعده الذبذبات وأضافه الجليد لإبقاءه المبردة قبل تلقي الحل تشريح والعينة ، وطوال الاجراء تشريح.

4-جمع العينات

ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم جمع الانسجه البشرية النيوكوريليه في غرفه الجراحة ونقلها إلى المختبر.

تحذير: عند التعامل مع العينات البشرية ، اتبع بروتوكولات السلامة المناسبة التي وضعتها المؤسسة.

  1. اعداد جهاز النقل (الشكل 1ج) الذي يتكون من: اسطوانه غاز محموله مع خليط كربوجين متصلة بصمام الضغط/التدفق الذي يتحكم في إنتاج الغاز متصلا بأنابيب السيليكون التي تربط إنتاج الغاز إلى النقل سفينة سفينة نقل ، وعاده ما 50 mL أنبوب الطرد المركزي المخروطية مع غطاء مثقب لإدخال الغاز ، والتي تحتوي علي حل النقل ؛ والجليد لتبريد العينة اثناء النقل.
  2. جمع ونقل العينة (الشكل 1ب) علي الفور إلى المختبر. غمر العينة في محلول النقل البارد (فقاعات باستمرار مع خليط كربوجين).

5. تقطيع الأوصال

  1. نقل العينة إلى طبق بيتري (100 مم × 20 مم) تحتوي علي حل التشريح ، ومع الاداات الجراحية الدقيقة ، قم بازاله بعناية أكبر قدر ممكن من السحايا المتبقية في العينة (الشكل 1د).
  2. اختيار أفضل التوجه عينه لإنتاج شرائح مع خصائص معينه من التصميم التجريبي ، ومع شفره مشرط رقم 24 ، وتقليم سطح مستو لتكون قاعده لصقها علي القرص عينه.
  3. باستخدام ملعقة بلاستيكية يمكن التخلص منها وفرش الدهان الحساسة ، وجمع جزء من طبق بيتري والجافة الحل الزائد باستخدام ورقه فلتر (الجافة بواسطة شعري وتجنب لمس جزء الانسجه مع الورق).
  4. باستخدام الغراء الفائق ، ونعلق الانسجه إلى القرص العينة الذبذبات حتى يتم التزام بشده إلى القرص وعلي اتصال مع كتله اجنشا (الشكل 1ه).
  5. وضع القرص العينة الذبذبات (مع الانسجه المرفقة بشكل صحيح) في علبه العازلة الذبذبات مليئه حل تقطيع التي يجب ان تكون محتدما خلال العملية برمتها.
  6. قفل حامل السكين في مكان مع شفره الحلاقة ثابته بقوة.
  7. يجب ان يغطي محلول التقطيع كلا من العينة والشفرة ، ثم يبدا التقطيع (الشكل 1و).
  8. قطع العينة إلى شرائح 200 μm.
    ملاحظه: علي الرغم من ان بعض الذبذبات قطع العينات تلقائيا ، فان الملاحظة الوثيقة والتعديلات الطفيفة في تقطيع السرعة اثناء العملية قد تساعد في إنتاج شرائح أفضل. تجاهل الشرائح الاوليه غير المنتظمة.
  9. نقل الشرائح من علبه العازلة إلى طبق بيتري مع حل تشريح وتقليم حواف فضفاضة والام البيضاء الزائدة إلى نسبه من حوالي 70 ٪ القشرة/30 ٪ المادة البيضاء.

6-الثقافة

ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوة في خزانه تدفق الرقائقي تحت بيئة معقمه.

  1. أضافه 600 μL من الثقافة المتوسطة في بئر (في 24 لوحه بئر) واحتضان لمده 20 دقيقه علي الأقل في 36 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 قبل الطلاء الشرائح.
  2. طبق شريحة واحده لكل بئر باستخدام فرشاه الطلاء (الشكل 1G).
  3. إذا كان هناك اي الآبار غير المستخدمة في لوحه ، وملئها مع 400 μL من المياه المعقمة.
  4. احتضان لوحه في 36 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
    ملاحظه: يجب ان يتم استبدال المتوسطة الاولي في ما بين 8-16 h بعد الطلاء اعتمادا علي حجم الشريحة.
  5. تكمله 10 مل من المتوسطة الثقافة التي تم اعدادها مسبقا مع 50 ng/mL الدماغ المستمدة من عامل التغذية العصبية (BDNF).
    ملاحظه: خلال الأول 8-16 h ، يتم احتضان الشرائح في 600 μL من المتوسطة لتجنب الحرمان من المغذيات والتحمض ، لأنه يتم تسريع الاستهلاك المتوسط في هذه المرحلة. من الخطوة التالية ، يتم ضبط حجم متوسط لكل بئر إلى 400 μL.
  6. أزاله 333 μL من المتوسطة المكيفة من كل بئر وأضافه 133 μL من الطازجة BDNF-تكمله المتوسطة.
  7. كرر عمليه استبدال المتوسطة كل 24 ساعة عن طريق استبدال ثلث المتوسطة المكيفة مع الطازجة BDNF-تكمله المتوسطة.

7. تقييم الصحة والمورفولوجية والوظائف في الشرائح المستزرعة

ملاحظه: للحث علي موت الخلايا لغرض التوضيح في النتائج التمثيلية ، تم تقديم بعض الشرائح إلى معالجه 24 ساعة مع محفز الاكسده H2O2. الخطوات 7.1.2 و 7.1.3 تصف استخدام H2O2 للحث علي موت الخلايا.

  1. بقاء الخلية
    ملاحظه: طريقه بسيطه ومباشره لتقييم السمية العصبية/نيوروبروتكايشن في الثقافات شريحة التحدي هو 3-(4 ، 5-ديميثيلثيازول-2-yl)-2 ، 5-diفينيلبيراسيتام (MTT) مقايسة36، الذي يقيس نسبه الخلايا النشطة الايضيه في ظل الظروف العادية مقارنه مع العينات المعالجة.
    1. في مجلس الوزراء تدفق الرقائقي ، استبدال ثلث المتوسطة مع المتوسطة الطازجة.
    2. من 30% H2o 2 حل الأسهم ، أضافه حجم h2س2 لكل بئر للوصول إلى التركيز النهائي المقصود (30 ملم أو 300 mm).
      ملاحظه: تم أضافه H2O2 بعد التغيير اليومي لمتوسط لضمان العرض السليم من المواد الغذائية الطازجة قبل التحدي.
    3. احتضان لوحه لمده 24 ساعة في 36 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
      ملاحظه: بعد H2O2 العلاج (أو غيرها من المحفزات السامة للفائدة) ، تصف الخطوات التالية تحديد صلاحيه الخلية بواسطة فحص mtt.
    4. أضافه 40 μL من محلول MTT إلى تركيز نهائي من 0.5 مغ/مل لكل بئر في لوحه.
    5. احتضان لوحه في 36 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 3 ساعات.
    6. اغسل الشرائح بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات ونقلها إلى ميكروتيوب.
    7. أزاله اي حل المتبقية بعناية عن طريق التنضيد.
    8. تزن الأنابيب المجهرية التي تحتوي علي الشرائح لتحديد كتله كل شريحة (وهذا هو المفتاح لتطبيع قراءات الامتصاص التي تم الحصول عليها).
      ملاحظه: إذا لزم الأمر ، يمكن تجميد العينات (-20 درجه مئوية) في هذه المرحلة للمعالجة اللاحقة.
    9. تجانس الشرائح في 200 μL من ايزوبروبانول/HCl باستخدام مدقه اليه.
    10. أجهزه الطرد المركزي في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 2 دقيقه في 2600 x g.
    11. جمع ماده طافي وقياس الامتصاص في 540 nm.
  2. أزاله الاستقطاب العصبية الناجمة عن KCl
    ملاحظه: فوسفات البروتين المنشط ميتوجين كيناز (MAPK) إشارات تتالي البروتين الذي يتبعه التنقيط الغربية ، يمكن استخدامها للقياس الكمي لاستجابه الخلايا العصبية ل KCl المستحثة الاستقطاب37 .
    1. في الدفق خزانه, استبدلت الثقافة وسط ب 300 μL من [HBSS] سابقا معايرتها إلى 36 [ك.].
    2. استبدال HBSS مع 300 μL من HBSS الطازجة سابقا معايرتها إلى 36 درجه مئوية.
    3. احتضان لوحه في 36 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 15 دقيقه.
    4. استبدال HBSS اما مع HBSS الطازجة أو مع 80 mM الحل الاستقطاب KCl (علي حد سواء في 36 درجه مئوية) واحتضان في 36 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 15 دقيقه.
    5. انقل الشرائح من اللوحة إلى الأنابيب المجهرية. في هذه الخطوة ، يمكن تخزين الشرائح في-20 درجه مئوية للمعالجة اللاحقة.
    6. اعداد مقتطفات الانسجه في 150 μL من راديويمونوبريسيبيتيشن مقايسة (ريبا) المخزن المؤقت (50 mM تريس-HCl ؛ 150 mM كلوريد الصوديوم ؛ 1 مم أدتا ؛ 1 ٪ السطحي غير الايونيه ، 0.1 ٪ كبريتات دوديسيل ، الأس الهيدروجيني 7.5). مقتطفات الطرد المركزي في 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه في 16000 x g، وجمع supernatant ، وتحديد إجمالي تركيز البروتين باستخدام أسلوب برادفورد.
    7. تحميل 30 ميكروغرام من البروتين الكلي علي 12 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS الصفحة).
    8. بعد الكهربائي ، ونقل محتوي هلام إلى غشاء النيتروسليلوز.
    9. بعد حجب الغشاء مع 5 ٪ من الحليب الجاف غير الدسم في TBS بالاضافه إلى 0.1 ٪ توين ، احتضان مع الماوس مكافحه بيرك (1:1000) لمده 16 ساعة في 4 درجه مئوية. بعد الغسيل ، احتضان لمده 2 ساعة في RT مع الأرنب المضادة لERK1/2 (1:1000).
    10. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة التي مترافقة مع الجسم في RT لمده 1 ساعة.
    11. تكشف مع الركيزة المفضلة لل.
  3. التقييم المورفولوجية
    ملاحظه: بالاضافه إلى بقاء الخلية والتقييمات الوظيفية ، من المهم لتحليل الانسجه المورفولوجية. يجب ان تدرك ان أعاده تحديد الشريحة المثقفة خطوه هامه لإنتاج أكبر قدر ممكن من المواد ذات الجودة العالية للتحليل المورفولوجية.
    1. إصلاح الشرائح وكريوبروتيكتينجها وأعاده تحديدها
      1. نقل الشرائح من الآبار مع الثقافة المتوسطة إلى جديد 24 لوحه جيدا التي تحتوي علي تلفزيوني.
      2. أزاله التلفزيونية وأضافه 1 مل من بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA). من المهم ان تبقي الشرائح مسطحه قبل أضافه PFA. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
      3. أزاله بعناية الحل PFA وأضافه 1 مل من محلول السكروز 30 ٪. احتضان ل 48 h في 4 ° c.
      4. تعيين تجميد ميكروتومي إلى-40 درجه مئوية.
      5. اعداد قاعده السكروز علي مرحله ميكروتومي حيث يجب وضع الشرائح (الشكل 2ا). السماح لها تجميد تماما وقطع بعناية بعض السكروز المجمدة لإنتاج سطح مستو الذي سيتم وضع شريحة.
      6. وضع كل شريحة علي فيلم من البلاستيك امتدت واستخدام فرشاه الرسام لشقه الانسجه.
      7. نقل شريحة امتدت إلى قاعده السكروز المجمدة في خطوه واحده.
        ملاحظه: ليس من الممكن نقل الشريحة بمجرد ان تكون فوق قاعده السكروز المجمدة. قم بتنفيذ خطوه النقل هذه بعناية.
      8. السماح للشريحة بقية لمده 5-10 دقيقه للتجميد السليم.
      9. قطع الشريحة إلى 30 ميكرومتر المقاطع.
      10. نقل المقاطع 30 μm إلى صحن بيتري التي تحتوي علي الخدمات التلفزيونية.
      11. المضي قدما إلى بروتوكول الانسجه أكثر ملاءمة للتصميم التجريبي.
        ملاحظه: المقاطع 30 μm يمكن استخدامها بسهوله لمناعي العائمة الحرة ، التي شنت علي الشرائح المجهر لمزيد من الانسجه أو تخزينها في محلول التجمد في-20 درجه مئوية.
    2. مناعي
      ملاحظه: تختلف البروتوكولات القياسية مناعي والمناعية بين المختبرات. للحصول علي نسخه مفصله من البروتوكول المستخدم هنا ، يرجى الرجوع إلى Horta et al.38. الأجسام المضادة الاوليه المستخدمة للمناعة المقدمة في الشكل 2 تشمل نوى الخلايا العصبية (neun) ، علامة الخلايا العصبية الناضجة الصحية ، البروتين الحمضي الليفي الدليطي (gfap) ، علامة astorcytes ، محول الكالسيوم المتاين الملزم (Iba-1) ، علامه.
      1. احتضان الشرائح في حل الحجب (علي سبيل المثال ، 2 ٪ المصل حمار عادي في تلفزيوني) لمده 40 دقيقه.
      2. احتضان بين عشيه وضحيها مع الأجسام المضادة الاوليه تحت الانفعالات معتدل في 4 درجه مئوية.
      3. بعد الغسيل مع تلفزيوني ، احتضان لمده 120 دقيقه مع الأجسام المضادة الثانوية الحيوية تحت الانفعالات خفيفه في RT.
      4. بعد غسل مع [ببس], حضنت في [رت] ل 120 دقيقه مع [افدين-براكسيدس] تقارن (طاوله المواد).
      5. تكشف مع داب + 0.04 ٪ الأمونيوم النيكل.
      6. جبل المقاطع الملونة علي الشرائح المجهر المجهري المغلفة والسماح لهم الهواء الجاف. ديهيدرات في الايثانول ، معزي في اكسيلين ، والانتهاء مع المتوسطةالمتصاعدة (جدول المواد) ، وتغطيه مع الشفة ، والصورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ومن الجوانب الهامه لتقييم نوعيه وصحة الشرائح المستزرعة وجود وشكل نموذجي لأنواع الخلايا العصبية المتوقعة ، والخلايا العصبية ، والكريات الدليج. ولوحظ الهندسة المعمارية النموذجية لتصفيح القشرية البشرية في شريحة في DIV4 ، التي كشفت عنها المناعية العصبية (الشكل 2د). الاضافه إلى ذلك ، لوحظ أيضا وجود الخلايا الصغيرة والخلايا الفلكية الصغرى المتوقعة (الشكل 2باء ، جيم). وتبين هذه النتائج ان هندسه الانسجه لا تتاثر بشكل كبير اما بالعملية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا البروتوكول لإنتاج العائمة الحرة ، والثقافات شريحة قصيرة الأجل هو وسيله بديله لزراعه شرائح الإنسان البالغين الاستعمار الكبير. مثل هذا البروتوكول لشرائح الثقافات قد تكون قابله للدراسة علي (ولكن ليس علي سبيل الحصر) optogenetics1,44,45, الكهربائية الفسيولوجية2,3,4,5 ، اللدونة علي المدى القصير

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من قبل FAPESP (منحه 25681-3/2017 إلى AS), الرؤوس (زمالة ما بعد الدكتوراه PNPD/INCT-A.F. وزمالة ما قبل الدكتوراه إلى N.D.M.) و FAEPA. G.M.A. حاصل علي زمالة الماجستير من FAPESP (MS 2018/06614-4). N.G.C. يحمل زمالة أبحاث CNPq. نشكر المرضي وعائلاتهم علي التبرع بالانسجه المقطوعة لهذه الدراسة. ونود ان نعترف بدعم المقيمين والممرضين والفنيين وفريق CIREP ، من المستشفى السريري في كليه الطب في ريبيراو بريتو ، جامعه ساو باولو ، الذي ساعد في مختلف مراحل العملية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-بروبانولميرك1096341000
أكريلاميد / بيس أكريلاميد ، محلول 30٪سيجما ألدريتشA3449   ؛
AgaroseSigma AldrichA9539
بيرسولفات الأمونيومSigmaA3678-25G
Amphotericin BGibco15290-018
الأجسام المضادة المضادة ل ERK 2 (أرنب)سانتا كروز Biotecnologysc-154التخفيف 1: 1,000 في BSA 2.5٪
الأجسام المضادة المضادة ل pERK (الفأر)سانتا كروز Biotecnologysc-7383التخفيف 1: 1,000 في BSA 2.5٪
B27Gibco17504-044
BDNFSigma AldrichSRP3014
مصل الأبقار ألبومينSigma AldrichA7906
برادفورد 1x كاشف صبغBioRad500-0205
EDTASigmaT3924المستخدمة في RIPA عازلة
الجلوكوزMerck 108337
GlutamaxGibco35050-061
أملاح هانك المتوازنةSigma AldrichH1387-10X1L
HepesSigma AldrichH4034
حمض الهيدروكلوريكMerck1003171000
بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)Vetec194
Mouse IgG ، مرتبط ب HRP كامل Ab (مضاد للماوس)GENA931-1ML
NaClMerck1064041000المستخدمة في RIPA العازلة
Neurobasal AGibco10888-022
الحليب الجاف الخالي من الدسم (Molico)Nestl & eacute ؛تستخدم لحجب الأغشية
PBS Buffer pH 7،2Laborclin590338
Penicilin / StreptomicinSigma AldrichP4333
كلوريد البوتاسيومMerck1049361000
كاشف الكشف عن النشافالغربي الأول GERPN2232
Rabbit IgG ، مرتبط ب HRP كامل Ab (مضاد للأرانب)GENA934-1ML
SDSSigmaL5750المستخدم في RIPA buffer
TEMEDGE17-1312-01
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)Sigma AldrichM5655
TrisSigmaT-1378المستخدمة في RIPA buffer
Triton x-100SigmaX100المستخدمة في RIPA العازلة
Ultra Pure WaterMilliporeالمياه المعقمة ، المشتقة من نظام تنقية المياه MiliQ
< قوية > المعدات والمواد < / ألواح قوية >
24 بئراCorningCL S3526Flat Bottom مع غطاء
Amersham Potran Premium (غشاء النيتروسليلوز)   ؛GE29047575
خليط الكربوجينالأبيض مارتينز95٪ O2 ، 5٪ CO2
CO2 حاضنةنيو برونزويك العلميةCO-24حضانة شرائح 5٪ CO2 ، 36 & ordm ؛ C
Microplate Readerالأجهزة
MicrotubesGreiner0016081,5 مل microtube
مدقة آليةKimble Chase
ملعقةحجم ملعقة حلوى
Razor BladeBicChrome Platinum ، تستخدم في التقطيع بشفرة
مشرط اهتزازيةBecton Dickinson (BD)رقم 24يستخدم لتقطيع الأنسجة ؛ يوصى بنفس الحجم أو أصغر
Superglue (Loctite Super Bonder)Henkel: Etilcianoacrilato ؛ 2-حمض البروبينويك ؛ 6،6'-di-terc-butil-2،2'-metilenodi-p-cresol ؛ homopolymer
Vibratome   ؛Leica14047235612 - VT1000S
اسم المادة/معدات الكيمياء المناعية
الأجسام المضادة المضادة للنيو (الفأر)Millipore MAB377التخفيف 1: 1,000 في الأجسام المضادة للفوسفات العازلة
المضادة ل GFAP (الفأر)تخفيف MerckMAB3601: 1,000 في الأجسام المضادة للفوسفات العازلة
المضادة ل Iba1 (أرنب)AbcamEPR16588 - ab178846التخفيف 1: 2,000 في عازلة الفوسفات
المضاد IgG المضاد للفأر البيوتينيل (H + L)VectorBA-9200
DABSigma AldrichD-9015
EntellanMerck107960
EthanolMerck1.00983.1000
الجيلاتينموالفة00G1002.02.AEتستخدم لطلاء الشرائح
MicrotomeLeicaSM2010Rمجهزة بمرحلة التجميد (BFS-10MP ، Physiotemp) ، مضبوطا على -40 & ordm ؛ C
مصل الحمار العاديJackson ImmunoResearch 017-000-121
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Rabbit IgG ، مرتبط ب HRP كامل Ab (مضاد للأرانب)شرائح GENA934-1ML
(Star Frost)Knittel Glaserالشرائح المطلية بالجيلاتين
السكروزVetec60REAVET017050
مجموعة Vectastain ABC HRP (بيروكسيداز ، قياسي)ناقلاتPK-4000 ، مجموعة قياسية
من الزيلينموالفة01X1001.01.BJ
الجزيئية بلاستيكية تكوين الجسم

المراجع

  1. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, April issue 1-5 (2016).
  2. Granholm, A. C., et al. Morphological and electrophysiological studies of human hippocampal transplants in the anterior eye chamber of athymic nude rats. Experimental Neurology. 104 (2), 162-171 (1989).
  3. Köhling, R., et al. Spontaneous sharp waves in human neocortical slices excised from epileptic patients. Brain. 121 (6), 1073-1087 (1998).
  4. Simon, A., et al. Gap junction networks can generate both ripple-like and fast ripple-like oscillations. European Journal of Neuroscience. 39 (1), 46-60 (2014).
  5. Israel, J. M., Oliet, S. H., Ciofi, P. Electrophysiology of hypothalamic magnocellular neurons in vitro: A rhythmic drive in organotypic cultures and acute slices. Frontiers in Neuroscience. 10, MAR issue 1-13 (2016).
  6. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. The Journal of Neuroscience. 12 (8), 3054-3070 (2018).
  7. Crain, S. M. Development of Specific Synaptic Network Functions in Organotypic Central Nervous System (CNS) Cultures: Implications for Transplantation of CNS Neural Cellsin Vivo. Methods. 16 (3), 228-238 (1998).
  8. He, S., Bausch, S. B. Synaptic plasticity in glutamatergic and GABAergic neurotransmission following chronic memantine treatment in an in vitro model of limbic epileptogenesis. Neuropharmacology. 77, 379-386 (2014).
  9. Antonietta Ajmone-Cat, M., Mancini, M., De Simone, R., Cilli, P., Minghetti, L. Microglial polarization and plasticity: Evidence from organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 61 (10), 1698-1711 (2013).
  10. Noraberg, J., et al. Organotypic Hippocampal Slice Cultures for Studies of Brain Damage, Neuroprotection and Neurorepair. Current Drug Target - CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  11. Hoppe, J. B., et al. Amyloid-β neurotoxicity in organotypic culture is attenuated by melatonin: Involvement of GSK-3β, tau and neuroinflammation. Journal of Pineal Research. 48 (3), 230-238 (2010).
  12. Sebollela, A., et al. Amyloid-β oligomers induce differential gene expression in adult human brain slices. Journal of Biological Chemistry. 287 (10), 7436-7445 (2012).
  13. Chong, C. M., et al. Discovery of a novel neuroprotectant, BHDPC, that protects against MPP+/MPTP-induced neuronal death in multiple experimental models. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1057-1066 (2015).
  14. Daviaud, N., Garbayo, E., Schiller, P. C., Perez-Pinzon, M., Montero-Menei, C. N. Organotypic cultures as tools for optimizing central nervous system cell therapies. Experimental Neurology. 248, 429-440 (2013).
  15. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (8), 659-666 (2008).
  16. Minami, N., et al. Organotypic brain explant culture as a drug evaluation system for malignant brain tumors. Cancer Medicine. 6 (11), 2635-2645 (2017).
  17. Magalhães, D. M., et al. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices-a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 1-18 (2018).
  18. Wang, X., et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neuroscience. 10, 1-20 (2009).
  19. Di Pietro, V., et al. Transcriptomics of traumatic brain injury: gene expression and molecular pathways of different grades of insult in a rat organotypic hippocampal culture model. Journal of neurotrauma. 27 (2), 349-359 (2010).
  20. Kalebic, N., et al. CRISPR/Cas9-induced disruption of gene expression in mouse embryonic brain and single neural stem cells in vivo. EMBO Reports. 17 (3), 338-348 (2016).
  21. Jones, R. S. G., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2015).
  22. Hoffer, B., Seiger, A., Ljungberg, T., Olson, L. Electrophysiological and cytological studies of brain homografts in the anterior chamber of the eye: maturation of cerebellar cortex in oculo. Brain Research. 79 (2), 165-184 (1974).
  23. Hoffer, B. J., Olson, L., Palmer, M. R. Toxic effects of lead in the developing nervous system: in oculo experimental models. Environmental Health Perspectives. 74, 169-175 (1987).
  24. Hogue, M. J. Human fetal brain cells in tissue cultures: Their identification and motility. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 85-107 (1947).
  25. Costero, I., Pomerat, C. M. Cultivation of neurons from the adult human cerebral and cerebellar cortex. American Journal of Anatomy. 89 (3), 405-467 (1951).
  26. Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  27. Stoppini, L., Buchs, A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  28. Sanai, N., et al. Unique astrocyte ribbon in adult human brain contains neural stem cells but lacks chain migration. Nature. 427 (6976), 740-744 (2004).
  29. Eugène, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  30. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  31. Verwer, R. W. H., Dubelaar, E. J. G., Hermens, W. T. J. M. C., Swaab, D. F. Tissue cultures from adult human postmortem subcortical brain areas. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 6 (3), 429-432 (2002).
  32. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer's disease-associated Aβ oligomers. Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  33. Bruce, A. J., Malfroy, B., Baudry, M. beta-Amyloid toxicity in organotypic hippocampal cultures: protection by EUK-8, a synthetic catalytic free radical scavenger. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2312-2316 (1996).
  34. Finley, M., et al. Functional validation of adult hippocampal organotypic cultures as an in vitro model of brain injury. Brain Research. 1001 (1-2), 125-132 (2004).
  35. Schoeler, M., et al. Dexmedetomidine is neuroprotective in an in vitro model for traumatic brain injury. BMC Neurology. 12, 20(2012).
  36. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  37. Maharana, C., Sharma, K. P., Sharma, S. K. Feedback mechanism in depolarization-induced sustained activation of extracellular signal-regulated kinase in the hippocampus. Scientific Reports. 3, 1103(2013).
  38. Horta, J. D. A. C., López, D. E., Alvarez-Morujo, A. J., Bittencourt, J. C. Direct and indirect connections between cochlear root neurons and facial motor neurons: Pathways underlying the acoustic pinna reflex in the albino rat. Journal of Comparative Neurology. 507 (5), 1763-1779 (2008).
  39. Carmona-Fontaine, C., et al. Metabolic origins of spatial organization in the tumor microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2934-2939 (2017).
  40. McMurtrey, R. J. Analytic Models of Oxygen and Nutrient Diffusion, Metabolism Dynamics, and Architecture Optimization in Three-Dimensional Tissue Constructs with Applications and Insights in Cerebral Organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  41. Lossi, L., Alasia, S., Salio, C., Merighi, A. Cell death and proliferation in acute slices and organotypic cultures of mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 88 (4), 221-245 (2009).
  42. Adams, J. P., Sweatt, J. D. Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 42, 135-163 (2002).
  43. Sharma, S. K., Carew, T. J. The roles of MAPK cascades in synaptic plasticity and memory in Aplysia: Facilitatory effects and inhibitory constraints. Learning and Memory. 11 (4), 373-378 (2004).
  44. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-755 (2011).
  45. Takahashi, Y. K., et al. Neural Estimates of Imagined Outcomes in the Orbitofrontal Cortex Drive Behavior and Learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  46. Peça, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a Cooperate in the Regulation of Epileptic and Synaptic Activity in the CA1 Region of the Hippocampus. Journal of Neuroscience. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  49. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  50. Jung, S., et al. Brain tumor invasion model system using organotypic brain-slice culture as an alternative to in vivo model. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 128 (9), 469-476 (2002).
  51. Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 261-270 (2007).
  52. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
  53. Gähwiler, B. H. Organotypic cultures of neural tissue. Trends in Neurosciences. 11 (11), 484-489 (1988).
  54. Walsh, K., Megyesi, J., Hammond, R. Human central nervous system tissue culture: A historical review and examination of recent advances. Neurobiology of Disease. 18 (1), 2-18 (2005).
  55. Gähwiler, B. H. Slice cultures of cerebellar, hippocampal and hypothalamic tissue. Experientia. 40 (3), 235-243 (1984).
  56. Bsibsi, M., et al. Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators. Glia. 53 (7), 688-695 (2006).
  57. González-Martínez, J. A., Bingaman, W. E., Toms, S. A., Najm, I. M. Neurogenesis in the postnatal human epileptic brain. Journal of Neurosurgery. 107 (3), 628-635 (2008).
  58. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. The FASEB Journal. 16 (1), 54-60 (2002).
  59. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  60. Masamoto, K., Tanishita, K. Oxygen Transport in Brain Tissue. Journal of Biomechanical Engineering. 131 (7), 074002(2009).
  61. Hadjistassou, C., Bejan, A., Ventikos, Y. Cerebral oxygenation and optimal vascular brain organization. Journal of the Royal Society Interface. 12 (107), (2015).
  62. Qiu, C., Kivipelto, M., von Strauss, E. Epidemiology of Alzheimer's disease: occurrence, determinants, and strategies toward intervention. Dialogues in Clinical Neuroscience. 11 (2), 111-128 (2009).
  63. Stahl, K., Mylonakou, M. N., Skare, O., Amiry-Moghaddam, M., Torp, R. Cytoprotective effects of growth factors: BDNF more potent than GDNF in an organotypic culture model of Parkinson's disease. Brain Research. 1378, 105-118 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

التصفيح القشريالمقايسات الكيميائية الحيويةمقايسات بيولوجيا الخليةالكيمياء النسيجية المناعيةالتقطيع بجهاز الفايبراتومتحفيز بيروكسيد الهيدروجينمقايسة اختزال MTTفسفرة ERK
قصيرة الأجل الحرة العائمة شريحة الثقافات من الدماغ البشري الكبار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.