يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59849

⸱

أغسطس 14, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland

في هذه المقالة

ملخص

والهدف من هذه الطريقة هو توليد نموذج في الجسم الحي من تكوين الأوعية الدموية الورم عن طريق xenografting الخلايا السرطانية الثدييات في جنين حمار وحشي الذي لديه الأوعية الدموية ذات العلامات الفلورية. من خلال تصوير xenograft والأوعية المرتبطة بها، يمكن الحصول على قياس كمي للاستجابة الوعائية.

الملخص

تكوين الأوعية الدموية الورم هو الهدف الرئيسي للعلاج المضاد للسرطان وقد تم تطوير هذه الطريقة لتوفير نموذج جديد لدراسة هذه العملية في الجسم الحي. يتم إنشاء xenograft حمار وحشي عن طريق زرع خلايا ورم الثدييات في الفضاء المحيطي من يومين بعد الإخصاب الأجنة حمار وحشي، تليها قياس مدى الاستجابة الوعائية التي لوحظت في نقطة نهاية تجريبية تصل إلى يومين ما بعد الزرع. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تكميم بدقة في حمار وحشي المضيف استجابة وعائية إلى الكسب غير المشروع. وهذا يتيح الفحص التفصيلي للآليات الجزيئية وكذلك مساهمة المضيف مقابل الورم في الاستجابة الوعائية. يمكن أن تخضع الأجنة المطعّمة من xenografted لمجموعة متنوعة من العلاجات، مثل الحضانة مع الأدوية المحتملة المضادة للأوعية الدموية، من أجل التحقيق في استراتيجيات لمنع تكوين الأوعية الدموية الورم. يمكن أيضًا تصوير الاستجابة الوعائية بشكل مباشر من أجل فحص العمليات الخلوية الأكثر ديناميكية. التقنية التجريبية التي لا تتطلب الكثير نسبيا، وتكاليف الصيانة الرخيصة لسمك الحمار الوحشي والجدول الزمني التجريبي القصير تجعل هذا النموذج مفيدا بشكل خاص لتطوير استراتيجيات للتعامل مع تكوين الأوعية الدموية الورم.

المقدمة

تكوين الأوعية الدموية هو واحد من السمات الكلاسيكية للسرطان ويمثل هدفا للعلاج المضاد للسرطان1،2. لدراسة هذه العملية ، تم إنشاء نماذج xenograft من السرطان عن طريق زرع خلايا أورام الثدييات في الحيوانات مثل الفئران3. كما تم تطوير نموذج xenograft حمار وحشي، والذي ينطوي على زرع الخلايا السرطانية في 2 أيام بعد الإخصاب (نقطة في البوصة) حمار وحشي مما يؤدي إلى النمو السريع للأوعية الدموية حمار وحشي في xenograft4.

يصف هذا البروتوكول نموذج ورم الجنين في الجسم الوحشي الذي يمكن فيه تحديد الاستجابة الوعائية بدقة عبر الجرافوجرافة بأكملها. تسمح هذه الطريقة للمحقق بفحص الآليات الجزيئية التي تدعم الاستجابة الوعائية للورم في الجسم الحي. تسمح القدرة الوراثية لسمك الحمار الوحشي باستجواب مساهمة المضيف، في حين يسمح اختيار خطوط الخلايا السرطانية المختلفة بشفية الورم في تكوين الأوعية الدموية لفحصها أيضًا5و6و7. وبالإضافة إلى ذلك، كما يرقات حمار وحشي قابلة للنفاذ إلى جزيئات صغيرة، يمكن استخدام مثبطات مسار محددة أو يمكن فحص مكتبات المخدرات لتحديد مثبطات جديدة من تكوين الأوعية الدموية الورم8،9،10، 11.

نموذج xenograft الجنين حمار وحشي يقدم مزايا فريدة من نوعها بالمقارنة مع نماذج xenograft الثدييات الأخرى. حمار وحشي xenografts أرخص وأسهل لأداء، ويمكن فحص أعداد كبيرة من الحيوانات والتصوير بالخلايا الحية يسمح بفحص مفصل لسلوك الخلية4. خلافا لغيرها من النماذج في الجسم الحي، والتي تتطلب ما يصل إلى عدة أسابيع لمراقبة نمو كبير في الأوعية، يمكن ملاحظة تكوين الأوعية الدموية في xenografts حمار وحشي في غضون 24 ساعة بعد زرع3،4. ومع ذلك، فإن عدم وجود نظام مناعي متكيف في سمك الحمار الوحشي الجنيني، في حين أن مفيدة للحفاظ على xenograft، يعني أنه لا يمكن فحص الاستجابة المناعية التكيفية ومساهمتها في تكوين الأوعية الدموية الورم. وبالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود الخلايا السترومالالورمية ، وعدم القدرة على زرع الورم بشكل أورثوموضعي ، والفرق في درجة حرارة الصيانة بين حمار وحشي وخلايا الثدييات هي نقاط الضعف المحتملة لهذه الطريقة. ومع ذلك، فإن إمكانية إنشاء هذا النموذج للتصوير الحي والقدرة على تحديد الكمية بدقة للاستجابة الوعائية يجعلها مفيدة بشكل فريد لدراسة العمليات الخلوية التي تنظم تكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد إبر الحقن المجهري

  1. تشغيل بكرة micropipette وتعيين المعلمات التالية (معايرة لنموذج سحب micropipette المدرجة في جدولالمواد): الحرارة، 680؛ سحب، 75؛ السرعة، 40؛ الوقت، 55؛ الضغط: 530.
  2. تأمين البورسليكات الزجاج الشعرية في الساحبة micropipette وسحب الشعرية لجعل اثنين من الإبر. كرر للحصول على العديد من الإبر كما هو مطلوب.

2. خلية الثقافة للزرع

ملاحظة: عند استخدام هذا البروتوكول، يمكن استخدام أي خط خلية سرطان الثدييات لزرعها في أجنة حمار وحشي كxenografts. ومع ذلك، هناك الكثير من الاختلاف في الاستجابةالوعائية الناجمة بين خطوط الخلايا المختلفة 5،11،12. وقد ثبت أن خلايا الورم الميلانيني M16-F1 الميلانوما للحث على استجابة وعائية قوية في أجنة حمار وحشي11 وبالتالي فهي مناسبة للاستخدام في هذا البروتوكول.

  1. تنمو خلايا B16-F1 في 37 درجة مئوية في قارورة 75 سم2 باستخدام وسائل الإعلام MEM-α تستكمل مع مصل البقر الجنيني (FBS) إلى تركيز نهائي من 10٪ (V / V) والبنسلين / العقدية، كل بتركيز نهائي من 100 ميكروغرام / مل.
  2. إزالة وسائل الإعلام من 95-100٪ confluent 75 سم2 قارورة من الخلايا B16-F1 وغسل الخلايا في 5 مل من درجة حرارة الغرفة الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS).
  3. إزالة PBS 5 مل، إضافة 2 مل من درجة حرارة الغرفة 0.25٪ تريبسين / حمض إيثيلينديامينيتراسيتيك (EDTA) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 60 ق.
  4. انقر على جانب القارورة لتحديد ما إذا كانت الخلايا قد بدأت تفقد تعلقها بأسفل القارورة.
  5. إضافة 8 مل من درجة حرارة الغرفة MEM-α مع FBS 10٪ في قارورة، ماصة ضد داخل قارورة لجلب أي الخلايا التي لا تزال ملتزمة في الجزء السفلي من قارورة في تعليق وماصة تعليق الخلية في أنبوب 15 مل.
  6. طرد مركزي تعليق الخلية في 800 × ز، 4-8 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يستنشق وسائل الإعلام والمضي قدما في وضع العلامات على الخلايا مع صبغ.

3. وضع العلامات B16-F1 الخلايا مع صبغ الفلورسنت

ملاحظة: من أجل التمييز بين الخلايا السرطانية المزروعة والخلايا الأخرى في الجنين ، يجب وضع علامة على الخلايا السرطانية بصبغة فلورية مناسبة قبل الزرع. يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كانت الخلايا تعبر بالفعل عن المراسلين الفلورسنت.

  1. احتضان 2 مل من وسائل الإعلام MEM-α خالية من المصل عند 37 درجة مئوية.
  2. إعداد محلول مخزون من الصبغة المختارة وتمييعه في 2 مل من وسائل الإعلام الخالية من المصل MEM-α لجعل تركيز عملي (يتم توفير أمثلة من الأصباغ والتركيزات المناسبة لخلايا B16 F1 في جدولالمواد).
  3. ماصة 1 مل من محلول صبغ في بيليه الخلية (من الخطوة 2.6)، مزيج تماما عن طريق الأنابيب، ثم إضافة أخرى 1 مل من محلول صبغ ومزيج.
  4. تحضن الخلايا وصبغ خليط في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة، وخلط من قبل يهز لطيف في 20 دقيقة.
  5. طرد مركزي تعليق الخلية في 800 × ز، 4-8 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  6. يستنشق supernatant وغسل الخلايا وصفت عن طريق الأنابيب مع 5 مل من PBS.
  7. طرد مركزي تعليق الخلية مرة أخرى في 800 × ز، 4-8 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يستنشق supernatant ووضع الخلايا على الجليد حتى جاهزة لزرع.
    ملاحظة: يجب أن يكون بيليه الخلية الورم النهائي حجم 20-40 درجة مئوية.

4. إعداد الأجنة لزرعها

ملاحظة: اختيار خط حمار وحشي المعدلة وراثيا التي لديها الأوعية الدموية وصفت الفلورسنت (على سبيل المثال kdrl: RFP، fli1a: EGFP، الخ) 13 , 14.

  1. قبل يومين من الزرع ، تفرخ سمك الحمار الوحشي كما سبق وصفها وجمع الأجنة15.
    ملاحظة: وبما أننا لا نحقن هذه الأسماك في مرحلة مبكرة، فإنها لا تحتاج إلى جمعها في غضون 20 دقيقة من التفريخ كما وصفها روزين وآخرون15، ولكن يمكن جمعها بعد بضع ساعات من التزاوج.
  2. ضع الأجنة في أطباق ثقافة 100 مم بكثافة حوالي 100 جنين/طبق.
  3. إضافة 50 مل من E316 (تستكمل مع 5 ميكرولتر من 1٪ ث / الخامس محلول مخزون مائي من الميثيلين الأزرق لمنع التلوث) إلى كل طبق، وتنظيف أي الأجنة الميتة أو الحطام والحفاظ على الطبق في حاضنة الظلام في 28 درجة مئوية حتى جاهزة للحقن.
  4. في يوم واحد بعد الإخصاب (dpf)، إضافة 1-فينيل-2-ثيويوريا (PTU) إلى كل طبق لإنتاج تركيز نهائي من 30 ملغ / لتر PTU في E3. PTU يمنع التصبغ، والتي يمكن أن تتداخل مع القدرة على عرض الخلايا السرطانية والأوعية الدموية.
  5. في 2 dpf، استخدم الإبر أو ملاقط لdechorionate يدويا أي الأجنة التي هي غير مفقسة. باستخدام المجهر الفلورسنت، حدد العديد من الأجنة المعدلة وراثيا كما هو مطلوب لxenografting (50-200).
  6. قبل الزرع، قم بالتخدير للأجنة المختارة في حل 300 ميكروغرام/مل ثلاثي الكوكايين في E3 من أجل منع الحركة أثناء إجراء الحقن.
  7. ملء طبق 35 ملم مع 2٪ ميثيل سيلولوز في حل E3 إلى ربع حجم الطبق.
  8. استخدام ماصة نقل لوضع ما يقرب من 50 الأجنة (التقليل من حجم الحل E3 المنقولة أيضا) على ميثيل سيلولوز.
  9. استخدم طرف ماصة Microloader لترتيب الأجنة بحيث يتم توجيهها جميعًا عمودياً، مع توجيه الرؤوس إلى الأعلى والجانب الأيسر الذي يواجه.
    ملاحظة: الخطوات 4.7-4.9 يمكن أيضا أن تنفذ عن طريق ترتيب الأجنة على كتلة أجاروز كما سبق وصفها17، ولكن في تجربتنا ، يتم ترتيب الأجنة بسهولة أكبر عندما صفت في ميثيل سيلولوز.

5. حقن Perivitelline من الخلايا السرطانية الثدييات في 2 dpf الأجنة

ملاحظة: لضمان تكتل الخلايا معا كطعم عند زرعها، يجب خلط الخلايا جنبا إلى جنب مع خليط مصفوفة خارج الخلية (ECM). وقد وصفنا خطوات صنع خليط من هذا القبيل من الخلايا/إدارة المحتوى في المؤسسة عند استخدام خليط ECM المشار إليه في جدولالمواد. وفي حالة استخدام مصفوفة بديلة، ينبغي تعديل الخطوات وفقا لذلك.

  1. تقسيم مخزون من ECM إلى 100 ميكرولتر aliquots في أنابيب 500 درجة مئوية وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
  2. إذابة aliquot من ECM وإضافة 100 ميكرولتر من PBS لتخفيف الخليط إلى 50٪ (V / v).
    ملاحظة: يمكن تخزين 50٪ ECM المخففة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  3. اخلط ECM بنسبة 50% بشكل جيد مع بيليه الخلية B16-F1 (من الخطوة 3.7) عن طريق الأنابيب والتحريك، لإنتاج خليط من الخلايا / ECM بنسبة 2:1 وتخزين الخليط على الجليد.
  4. باستخدام ماصة microcapillary، تناول 3-10 ميكرولتر من الخلايا.
  5. أدخل طرف الماصات بعناية في إبرة واخرج خليط B16-F1/matrix في نهاية الإبرة.
  6. أدخل الإبرة في حامل الإبرة وإمالة في زاوية 45 درجة إلى الطبق.
  7. كسر غيض من الإبرة باستخدام ملاقط لجعل حفرة كبيرة بما فيه الكفاية للخلايا ليتم إخراجها من الإبرة دون الضغط على الخلايا.
  8. تشغيل اسطوانة الهواء المضغوط تعلق على جهاز الحقن وتحويل حاقن على وضع "مستمر" لحظة لدفع الخلايا إلى طرف الإبرة.
  9. إزالة الإبرة من الطبق واستبدال الطبق مع مقياس الهيموكيتوماتومتر.
  10. وضع قطرة من النفط على مقياس الهيموكيتوماتومتر وحقن الإبرة مرة واحدة على هذا الانخفاض.
  11. عد عدد الخلايا التي يتم إخراجها بنبضة واحدة باستخدام مقياس الهيموكيتومات ومعايرة الإبرة لإخراج ما يقرب من 150 خلية لكل نبض عن طريق ضبط مدة النبض.
    ملاحظة: إخراج هذه الكمية من الخلايا لكل نبضة سوف تتطلب عدة نبضات من أجل زرع xenograft ناجحة. وهذا سيعطي الباحث المزيد من السيطرة على الحجم النهائي للورم xenograft من خلال السماح لهم لضبط معتدل عدد / موقع البقول لجعل كل xenograft أكبر أو أصغر كما يرونه مناسبا.
  12. قم بتوجيه الإبرة نحو كيس صفار الجنين ودفعه من خلال كيس صفار البيض في اتجاه بطني حتى يظهر طرف الإبرة من كيس صفار البيض ويدفع البشرة الجنينية على الجانب البطني للجنين الخلفي فقط إلى القلب.
    ملاحظة: ضع الإبرة بحيث تدخل كيس صفار الصفار الجنيني الأمامي إلى الموقع النهائي حيث سيتم إخراج الخلايا. وهذا يضمن أن الخلايا سيتم إخراجها في اتجاه بعيدا عن القلب، مما يقلل من احتمال حقن الخلايا في الوريد الكاردينال المشترك.
  13. دفع بعناية غيض من إبرة إلى الأمام قليلا حتى أنها خلقت مساحة (الفضاء المحيطي) بين البشرة وغشاء كيس صفار ثم نبض حاقن لطرد بعض خليط الخلية في الفضاء المحيطي.
  14. كرر النبضات حتى يتم حقن 500-800 خلية في الفضاء المحيطي، وخلق انتفاخ مرئي يمتد على الأقل نصف الطريق على طول الجزء السفلي من كيس صفار البيض، ثم إزالة الإبرة من الجنين.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا تمنع الإبرة أو تتلف أثناء الحقن، قم بتطهير الإبرة عن طريق التبديل للحظات إلى وضع "مستمر" ثم العودة إلى "النبض". هذا ينبغي إلغاء حظر الإبرة والسماح للخلايا ليتم إخراجها بحرية ودون تلف.
  15. الاستمرار في القيام بنفس الشيء لجميع الأجنة في الطبق، وتحميل إبرة جديدة مع الخلايا السرطانية عند الحاجة.
  16. بعد حقن جميع الأجنة، وإزالة الإبرة ودفع جميع الأجنة معا باستخدام طرف ماصة microcapillary بحيث يمكن أن يكون pipetted مع أقل قدر ممكن من ميثيل سيلولوز.
  17. نقل الأجنة إلى طبق الانتعاش التي تحتوي على E3 (مع PTU والميثيلين الأزرق) وغسلها عن طريق الأنابيب بلطف E3 حول الأجنة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن علاج الأجنة xenografted مع المخدرات عن طريق فصلها إلى أطباق مختلفة وإضافة محلول المخدرات إلى طبق واحد ومحلول التحكم (مثل السيارة المخدرات) إلى الطبق الآخر.
  18. احتضان الأجنة عند درجة حرارة 34 درجة مئوية وإجراء فحوصات مرتين يوميًا لإزالة الأجنة الميتة أو الوذمة من الطبق.
    ملاحظة: تم العثور على 34 درجة مئوية لتكون درجة الحرارة المثلى لوالأوعية الأوعية الدموية xenograft، كما تم استخدامها من قبل دراسات أخرى تستخدم نموذج الأوعية الدموية xenograft الجنينية حمار وحشي18. يمكن تصوير xenografts في أي وقت يصل إلى 48 حصان (ساعات بعد الزرع).

6. التصوير الحي

  1. في 48 حصان، تحديد 3-5 الأجنة صحية دون وذمة. التخدير لهم في 150 ميكروغرام / مل Tricaine وجبل لهم أفقيا في 1٪ منخفضة ذوبان نقطة (LMP) أغاروز كما سبق وصفها19.
    ملاحظة: كما الأجاروز هو ترسيخ، واستخدام طرف ماصة microcapillary للحفاظ على الأجنة في وضع أفقيا.
  2. تشغيل المجهر البؤري، وحدة تحكم المجهر، والليزر وبرامج الكمبيوتر للسيطرة على المجهر.
  3. ضع الطبق على مجهر بؤري. باستخدام التكبير 20X، والمياه غمس عدسة موضوعية، ووضع xenograft في وسط الميدان باستخدام التصوير brightfield.
  4. حدد أشعة الليزر الإثارة التي هي مناسبة للكشف عن الصبغة المستخدمة لتسمية الخلايا السرطانية والفلوروفور المستخدمة لتسمية الأوعية الدموية حمار وحشي.
  5. ضبط الربح لكل ليزر إلى مستوى يسمح بالكشف عن كل من الخلايا السرطانية والأوعية الدموية.
    ملاحظة: بمجرد إنشاء إعدادات البؤر، تأكد من أن يتم الاحتفاظ بها دون تغيير طوال التجربة بحيث يمكن إجراء مقارنات بين xenografts.
  6. باستخدام قناة الليزر المناسبة للخلايا السرطانية، حدد وحدة تخزين يتم تصويرها والتي تتضمن الحجم الكامل للxenograft، مما يسمح لواحد أو قسمين بصريين على الأقل على جانبي الكسب غير المشروع. استخدم فواصل المقاطع التي تبعد حوالي 5 ميكرومتر عن بعضها البعض لإنشاء مكدس z.
    ملاحظة: من الضروري أن z-المكدس يجب أن تحتوي على حجم كامل من xenograft.
  7. باستخدام اثنين من التصوير القناة، صورة كل من xenograft الورم والأوعية الدموية. كرر الخطوات 6.6-6.7 لكل يرقة ليتم تصويرها.

7. التصوير بالفاصل الزمني

ملاحظة: هذا النموذج هو مناسبة للغاية لتصوير العمليات الخلوية الديناميكية نظرا لشفافيتها وتوافر الجينات المحورة التي تسمية الفلورسنت أنواع الخلايا المختلفة. وهذا يجعل التصوير بالفاصل الزمني تطبيقًا أساسيًا لهذا الطراز.

  1. قم بتشغيل الغرفة البيئية وتعيينها إلى 34 درجة مئوية على الأقل 2 ساعة قبل التصوير. إذا لم يتم ترطيب الغرفة، إضافة أطباق من الماء.
  2. تخدير 3-5 أجنة (باستخدام 120 ميكروغرام / مل ثلاثي الكوكايين في 2 ديسيبل و 100 ميكروغرام / مل تريكين في 3 ديسيبل) وجبل لهم أفقيا في 0.8٪ LMP أغاروز للتصوير الفاصل الزمني وفقا للبروتوكول الموصوف سابقا19.
    ملاحظة: كما الأجاروز هو ترسيخ، واستخدام طرف ماصة microcapillary للحفاظ على الأجنة في وضع أفقيا.
  3. إعداد المعدات وصورة xenograft كما هو موضح في الخطوات 6.2-6.7، والحصول على z-مكدسات من xenograft في فترات 10 دقيقة.
    ملاحظة: يجب الحفاظ على الجنين عند درجة حرارة 34 درجة مئوية كما يتم تصويره ويجب فحص E3 على رأس اليرقات في أجار واستكمالها في بعض الأحيان للتأكد من أنها لا تجف.

8. تكميم الاستجابة الوعائية لزينورفيش حمار وحشي

ملاحظة: تستخدم الخطوات التالية برنامج تحليل الصور ثلاثيالأبعاد. ستختلف الخطوات المحددة وفقًا للبرامج المستخدمة.

  1. نقل ملفات الصور البؤرية z-كومة من xenograft الورم إلى مجلد جديد على برنامج تحليل الصور 3D.
    ملاحظة: من أجل تكميم مستويات الأوعية الدموية الورم، يجب إنشاء بروتوكولات القياس مع إعدادات معايرة بحيث يمكن استخدامها لقياس إما حجم الورم أو حجم السفينة لجميع xenografts.
  2. لإنشاء بروتوكول "حجم الورم" لقياس حجم xenografts الورم، انتقل إلى علامة التبويب "قياس" في القائمة العليا ثم اسحب البروتوكولات المسماة "البحث عن كائنات" من قائمة البروتوكولات التي تظهر على الجانب الأيسر من الإطار إلى الفضاء الذي يحمل عنوان "سحب المهام هنا لإجراء القياسات".
  3. تأكد من تعيين هذا البروتوكول لقياس الكائنات في قناة الورم، ثم اسحب البروتوكولات المسماة "قصاصة إلى ROIs" و "جعل عائد الاستثمار من السكان" من قائمة البروتوكولات إلى مساحة "سحب المهام هنا لإجراء القياسات". تأكد من تطبيق هذين الأمرين على الكائنات المعرّفة بواسطة "البحث عن كائنات".
  4. قبل معايرة إعدادات هذا البروتوكول، انتقل إلى القائمة المنسدلة أعلى تسمية "الوضع" في أعلى يسار الإطار وحدد طريقة العرض "التركيز الموسع".
  5. قم بإلغاء تحديد القنوات غير الورمية في الجزء الموجود في أقصى اليمين بالنقر فوق الدائرة السوداء تحت كل عنوان قناة، بحيث يمكن رؤية قناة الورم فقط. استخدم أداة "Freehand" في الجزء العلوي من النافذة لرسم "منطقة الاهتمام" (ROI) حول كل حجم الورم.
    ملاحظة: احرص على التأكد من عدم ترك أي من الورم خارج عائد الاستثمار. سيوفر هذا المنطقة التي لتنفيذ البروتوكول كما كنت معايرة الإعدادات.
  6. حدد تسمية "ملخص" في اللوحة أسفل الصورة، وقم بتعيين خيار "عرض" لإظهار "التجمعات السكانية 2". لمعايرة، انقر فوق العلامة النجمية في المهمة البحث عن كائنات، والتي ستفتح نافذة الإعدادات. ضبط "عتبة" باستخدام "كثافة" وتحديد عتبة "أقل" حتى يتم اختيار الخلايا السرطانية فقط وليس الفلورة الخلفية.
    ملاحظة: وهذا أمر مهم بحيث يتم الكشف عن الفلورة فقط من الخلايا السرطانية في عائد الاستثمار المحدد (رسمها في 8.5) ويتم قياس أي من الفلورة الخلفية.
  7. تحديد "الحد الأدنى لحجم الكائن" بحيث يتم قياس الخلايا السليمة فقط بدلاً من العناصر الأصغر من حطام الخلايا(على سبيل المثال عن طريق تعيين "الحد الأدنى لحجم الكائن" على أنه 100 ميكرومتر 3). حفظ هذا البروتوكول باسم "حجم الورم" عن طريق النقر فوق علامة التبويب قياسات في القائمة العليا والنقر فوق "حفظ البروتوكول"، واستخدام نفس الإعدادات لقياس جميع xenografts.
  8. لقياس حجم الأوعية الدموية المرتبطة بxenograft، سوف تحتاج إلى إجراء بروتوكول جديد. انتقل إلى القائمة العلوية، انقر على علامة التبويب القياسات وانقر على "مسح البروتوكول". اسحب المهام "البحث عن كائنات" و "قصاصة إلى ROIs" إلى المساحة التي تحمل عنوان "سحب المهام هنا لإجراء قياسات" لهذا البروتوكول.
  9. تأكد من تعيين الأمر الأول لقياس الكائنات في قناة الأوعية الدموية ومن تعيين الأمر التالي لتطبيقه على الكائنات المعرّفة بواسطة الأمر الأول. ثم قم بإلغاء تحديد القنوات غير الأوعية في الجزء الأيمن بحيث يمكن رؤية الأوعية الدموية فقط.
  10. تحديد إعدادات "حجم السفينة" بطريقة مشابهة لبروتوكول "حجم الورم" وحفظ هذا البروتوكول كـ "حجم السفينة" (انظر 8.6-8.7).
  11. مسح البروتوكول ورسم عائد الاستثمار حول xenograft، مع الحرص على عدم تضمين أي الفلورة غير الورم. قياس مجموع حجم الكائنات في قناة الورم داخل عائد الاستثمار هذا بالنقر فوق علامة التبويب قياسات، وتحديد الأمر "استعادة بروتوكول" واختيار بروتوكول "حجم الورم".
  12. باستخدام عائد الاستثمار الجديد الذي تم إجراؤه بواسطة بروتوكول "حجم الورم"، استخدم بروتوكول "حجم السفينة" لقياس الحجم الإجمالي للكائنات الموجودة في قناة السفينة داخل عائد الاستثمار هذا بالنقر فوق علامة التبويب القياسات، وتحديد الأمر "استعادة بروتوكول" واختيار "السفينة حجم" بروتوكول.
  13. تقسيم حجم السفينة من قبل حجم الورم ومضاعفة الجواب بنسبة 100 للحصول على نسبة مئوية من الأوعية الدموية الكسب غير المشروع.
  14. كرر الخطوات من 8.11 إلى 8.13 لكافة xenografts الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من خلال تصوير xenograft الفردية في 6 و 24 و 48 حصان، يمكن حساب الاستجابة الوعائية في نقاط زمنية مختلفة كما هو موضح في الشكل 1A-C. ويلاحظ أكبر استجابة الأوعية الدموية بين 24-48 ح بعد زرع، مع المستوياتالقصوى من الأوعية الدموية الكسب غير المشروع ينظر حوالي 2 نقطة في البوصة (الشكل 1A-C). فيلم الفاصل الزمني من استجابة وعائية نموذجية لxenograft B16-F1 من 20.75 حصان حتى 46 هبي وينظر في الفيلم ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوة الحرجة الأولى في البروتوكول هي زرع الخلايا السرطانية. من الضروري أن يتم حقن الخلايا في موقع من شأنه أن يسمح للxenograft لزرع بنجاح في الجنين دون جعل وذمة الجنين. يمكن أن تسمح الحقنالأمامية جداً للخلايا بالتحرك نحو القلب، وسد مجرى الدم ويؤدي إلى وذمة، في حين أن الحقن الذي هو الخلفي جداً سيؤدي إلى xenograft المزروعة بشكل سيئ. من الأفضل تجنب الحقن الأمامي عن طريق إدخال الإبرة من خلال كيس صفار البيض في اتجاه أمامي إلى خلفي بحيث يشير بعيدا ً عن القلب أثناء حقنه. أفضل تجنب الحقن الخلفي عن طريق حقن الخلايا في موقع في الن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر السيد الحاج ماهاجونكار على إدارته مرفق أسماك الحمار الوحشي بجامعة أوكلاند ووحدة أبحاث التصوير الطبي الحيوي، كلية العلوم الطبية، جامعة أوكلاند، على مساعدتهم في الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. وقد دعم هذا العمل منحة من مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا (14/105)، ومنحة مشروع صندوق الجمعية الملكية النيوزيلندية مارسدن (UOA1602)، ومنحة مشروع مؤسسة أوكلاند للبحوث الطبية (1116012) مُنحت إلى شركة J.W.A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسطوانة الهواءBOC011GXenotransplantation
خلايا B16-F1ATCCثقافة الخلايا
BD Matrigel LDEV خالية من (خليط مصفوفة خارج الخلية)Corning356235Xenotransplantation
الشعيرات الدموية الزجاجية BorosillicateWarner InstrumentsG100T-4OD = 1.00 مم ، المعرف = 0.78 مم ، الطول = 10 سم خلية حقن الخلية
طبق استزراع قطر 35 ممThermofisher NZNUN153066تربية الأسماك
طبق استزراع الخلايا بقطر 100 ممSigma-AldrichCLS430167-500EAالأسماك
قارورة زراعة الخلايا 75 سم 2< / sup>In Vitro TechnologiesCOR430641زراعة الخلايا
CellTracker GreenInvitrogenC2925وضع العلامات على الخلايا ، تركيز المخزون (10 ملي مولار في DMSO) ، تركيز العمل (0.2 مو ؛ M في وسائط خالية من المصل)
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD8418العلاج بالمخدرات ، وضع العلامات على الخلايا
E3 Media (60x في 2 لتر من الماء) 34.8 جم كلوريد الصوديوم

1.6 جم KCl

5.8 جم CaCl 2 < / sub > middot ؛ 2H2O

9.78 جم MgCl2· 6H2O ضبط على الرقم الهيدروجيني 7.2 مع هيدروكسيد الصوديوم		في المنزل [1]تربية الأسماك
إيثيل -3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين)سيجما ألدريتشE10521زرع الزرع
طرف مرشح التصوير 1,000 & mu; LVWR732-1491تستخدم خلال خطوات
متعددة طرف المرشح 200 & mu ؛ LVWR732-1489تستخدم خلال خطوات
متعددة طرف المرشح 10 & mu ؛ LVWR732-1487يستخدم خلال خطوات متعددة
المجهر الفلوريLeicaMZ16FAتحضير الأجنة FBS
(أصل نيوزيلندي)ثقافة الخلايا10091148العلمي للثيرموفيشر
أي علامة تجاريةتستخدم خلال خطوات متعددة
عد خلايا مقياس الدم محسنة NeubauerHawksleyVetAC1000Xenotransplantation
Heraeus Multifuge X3R الطرد المركزيThermofisher 75004500 العلميةثقافة الخلايا ، وضع العلامات على الخلايا
Hoechst 33342Thermofisher Scientific62249العلامات على الخلايا ، تركيز المخزون (1 مجم / مل في DMSO) ، تركيز العمل (6 & mu ؛ جم / مل في وسائط خالية من المصل)
نقطة انصهار منخفضة ، UltraPureAgarose Thermofisher 16520050Scientific Imaging
MethycelluloseSigma-Aldrich9004 67 5Xenotransplantation
Methylene bluesigma-AldrichM9140Microloader لتربية الأسماك
0.5-20 & mu ؛ طرف ماصة L لتحميل الشعيرات الدموية الدقيقةEppendorf5242956003Xenotransplantation
Micropipettesأي علامة تجاريةتستخدم خلال خطوات متعددة
مجتذب الماصات الدقيقة P 87أدوات SutterXenotransplantation
حاضنة قفص المجهرOkolabتصوير الفاصل الزمني
الميكروويفأي علامة تجاريةتصوير
الزيوت المعدنيةSigma-AldrichM3516Xenotransplantation
الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) - ألفاThermofisher Scientfic12561056زراعة الخلايا
MPPI-2 حاقن الضغطالأجهزة العلمية التطبيقيةXenotransplantation
Narishige micromanipulatorNarishige GroupXenotransplantation
Nikon D Eclipse C1 مجهر متحد البؤرنيكونتصوير
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629تربية الأسماك
PBSGibco10010023زراعة الخلايا
البنسلين StreptomycinLife Technologies15140122زراعة الخلايا
حشو ماصة S1Thermoscientific9501شريطية مصلية لزراعة
الخلايا 10 ملكورنينج4488شريطية مصلية لزراعة
25 ملكورنينج4489شريطية مصلية لزراعة
الخلايا 5 ملكورنينج4485شريطية مصلية لزراعة
الخلايا 2 ملكورنينج4486إبرة تيرومو لزراعة
الخلايا 22 جمAmtechSH 182تربية الأسماك
حاضنة زراعة الأنسجةThermofisher ScientficHeraCell 150iزراعة الخلايا
Tivozanib (AV951) AVEOPharmaceuticalsالعلاج بالمخدرات
ماصة نقل 3 ملMedirayRL200Cتربية الأسماك
التربسين / EDTA (0.25٪)TechnologiesT4049ملاقط زراعة الخلايا
أدوات العلوم الدقيقة11295-10
برنامج Volocity لتربية الأسماك (v6.3)تحليل الصور Improvision/Perkin Elmer
تربية , قفازات غرفة وضع الخلايا Life

المراجع

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
  3. Ribatti, D. Tumor Angiogenesis Assays. , 1st. edn, Humana Press. (2016).
  4. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  5. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
  6. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  7. Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
  8. Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
  9. Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
  10. Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
  11. Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
  12. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  13. Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7(2005).
  14. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
  15. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  16. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  17. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
  18. Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
  19. Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
  20. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768(2011).
  21. Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
  22. Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
  23. Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
  24. Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
  25. Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
  26. Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
  27. Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404(2016).
  28. Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486(2012).
  29. Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

VEGFR
في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.