يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجينات المباشرة ضرب من Axolotl الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية عن طريق الكهربائي من المجمعات CAS9 البروتين-gRNA

7.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/59850

⸱

يوليو 9, 2019

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, South China Normal University, 2The Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna Biocenter (VBC), 3Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هنا بروتوكول لتنفيذ الوقت والفضاء مقيدة الجينات ضرب الخروج في الحبال الشوكي ة عن طريق حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية الحبل الشوكي تليها الكهربائي.

الملخص

الساكسوتول لديه القدرة الفريدة على تجديد الحبل الشوكي بالكامل. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الخلايا الاستئصالية المتبقية كخلايا جذعية عصبية (NSCs) طوال الحياة، والتي تنتشر لإصلاح الأنبوب الاستئصالي والتفريق في الخلايا العصبية المفقودة بعد إصابة الحبل الشوكي. يمكن أن يؤدي فك رموز كيفية احتفاظ هذه الشركات الوطنية للضمان ة بتعدد القوى بعد التنمية والتكاثر عند إصابة الحبل الشوكي لإصلاح الهيكل الدقيق لما قبل الإصابة، إلى توفير رؤية قيمة حول كيفية تجديد الحبال الشوكية للثدييات وكذلك خيارات العلاج المحتملة. ومن خلال إجراء عمليات خروج الجين في مجموعات فرعية محددة من الشركات غير الحكومية في غضون فترة زمنية محدودة، سيسمح بدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات التجديدية، دون أن تُحيرها آثار اضطراب التنمية. يوصف هنا هو وسيلة لأداء الجينات خروج المغلوب في NSCs الحبل الشوكي axolotl باستخدام نظام CRISPR-Cas9. عن طريق حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية للحبل الشوكي تليها الكهربائي، يتم ضرب الجينات المستهدفة في NSCs داخل مناطق محددة من الحبل الشوكي في نقطة زمنية مرغوب فيها، مما يسمح للدراسات الجزيئية من NSCs الحبل الشوكي خلال التجديد.

المقدمة

الحبل الشوكي لمعظم الفقاريات غير قادر على التجدد بعد الإصابة، مما يؤدي إلى إعاقة دائمة. العديد من السلاماندرز، مثل axolotl، هي استثناءات ملحوظة. يمكن للaxolotl تجديد كامل الحبل الشوكي متطابقة هيكليا واستعادة تماما وظيفة الحبل الشوكي. الكثير من القدرة التجديدية للحبل الشوكي axolotl يرجع إلى الخلايا ependymal. هذه الخلايا خط القناة المركزية، وعلى عكس تلك الموجودة في الثدييات، والخلايا الأيبنديمال axolotl لا تزال الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التنمية ما بعد الجنين. بعد إصابة الحبل الشوكي (على سبيل المثال، من بتر الذيل)، تنتشر هذه NSCs لإعادة زراعة الأنبوب ependymal والتفريق لتحل محل الخلايا العصبية المفقودة1،2،3. الكشف عن كيفية النفثالينات الحبل الشوكي axolotl لا تزال متعددة القوى وتصبح نشطة بعد الإصابة يمكن أن توفر معلومات قيمة عن وضع استراتيجيات علاجية جديدة للمرضى البشر.

بسبب التقدم المحرز في تقنية الخروج من الخروج الجينات CRISPR-Cas9، أصبح أداء خروج المغلوب لفك وظيفة الجينات أسهل، وقد ثبت أن لها إمكانية تطبيق واسعة في مختلف الأنواع، بما في ذلك axolotls4،5، 6 , 7 , 8. الإصدارات الأخيرة من الجينوم الأكسولوت الكامل والنسخ يسمح الآن أي موضع الجينوم أنتكون مستهدفة ولتقييم أفضل للآثار خارج الهدف 9،10،11،12 , 13 , 14.وقد وضعت بروتوكولات الأمثل لضرب والخروج في axolotls باستخدام نظام CRISPR-Cas915. وقد ثبت تسليم الآلات كريسبر-Cas9 في شكل CAS9 البروتين-gRNA ريبونوكليوبروتين (RNP) أن تكون أكثر كفاءة من استخدام Cas9 وgRNA ترميز بلازميدات4. ومن المرجح أن يرجع ذلك إلى أن RNP أصغر في الحجم من ناقلات البلازميد، وقدرته على إنشاء فواصل الحمض النووي على الفور، وحماية الحمض النووي الريبي من تدهور الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الـ RNPs يتجاوز النسخ والترجمة؛ وبالتالي، فإنه يتجنب قضايا مثل قوة المروج والاستخدام الأمثل codon عندما تستمد عناصر بلازميد من نوع مختلف.

دراسات فقدان الوظيفة هي واحدة من النهج العامة للتحقيق في الوظائف المحتملة للجينات ذات الأهمية. من أجل دراسة وظيفة الجينات أثناء التجديد، ينبغي أن يتم تنفيذ خروج المغلوب بشكل مثالي قبل الإصابة مباشرة لتجنب الآثار على التنمية. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يقتصر الخروج على كل من المراكز الوطنية للتحقق ومنطقة التجديد. قد يؤدي خروج الجين المستهدف في جميع النفثالينات غير صحيح (بما في ذلك تلك الموجودة في الدماغ، وهو الحال في أنظمة Cre-LoxP)، إلى آثار لا علاقة لها بالتجدد التي يمكن أن تشوش تفسير النتائج. لحسن الحظ، يوفر هيكل الحبل الشوكي axolotl فرصة فريدة من نوعها للخروج من الخروج مقيدة بالوقت والفضاء في NSCs. معظم الـ NSCs الحبل الشوكي على اتصال مع القناة المركزية وتشكل الغالبية العظمى من الخلايا في اتصال مع القناة المركزية16،17. لذلك، حقن مجمع CAS9-gRNA في القناة المركزية، تليها الكهربائي، يسمح بالتسليم إلى NSCs الحبل الشوكيفي المنطقة المطلوبة في وقت محدد 4،18،19. ويبين هذا البروتوكول كيفية تنفيذ ذلك، مما يؤدي إلى اختراق شديد في المراكز الوطنية للنشح في الحبل الشوكي المستهدف، ثم يجري تحليل لاحق لدراسة الآثار على التجدد وسلوك مجلس الأمن القومي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ويجب إجراء جميع التجارب الحيوانية وفقاً للوائح المحلية والوطنية المتعلقة بتجارب الحيوانات وبموافقة مجلس الاستعراض المؤسسي ذي الصلة.

1. إعداد مزيج CAS9-gRNA RNP

  1. تصميم وتوليف gRNAs.
    ملاحظة: يرجى الرجوع إلى منشورات أخرى لتصميم وتوليف الـ gRNAs، بما في ذلك منشور يتعلق حصراً بالساكسولوت15و20و21و22.
  2. الحصول على بروتين CAS9-NLS عن طريق إعداد في المنزل أو شرائه تجاريا.
  3. إعداد مزيج CAS9-gRNA عن طريق خلط 5 ميكروغرام من البروتين CAS9-NLS، 4 ميكروغرام من gRNA، 0.9 ميكرولتر من 10X CAS9 العازلة، وملء حجم إلى 10 ميكرولتر مع خالية من nuclease H2O. Aliquot الخليط وتخزينها في -80 درجة مئوية إذا لم تستخدم على الفور.

2. إعداد لوحات أغاروز للكهرباء

  1. إعداد 200 مل من 2٪ (الوزن / المجلد) حل أجاروز في 1X DPBS. حل عن طريق تسخين الحل في الميكروويف وتصب على أطباق بيتري 10 سم إلى عمق حوالي 10 ملم (عميق بما فيه الكفاية لتغطية الحيوان كله).
  2. السماح لوحات لتترسخ في درجة حرارة الغرفة. تخزين لوحات في 4 درجة مئوية إذا لم تستخدم على الفور.
  3. باستخدام المشرط الجراحية، وقطع لوحة أجاروز لجعل شق لعقد الذيل على التوالي، وبئر لتركيب في جسم الحيوان، وبئرين إضافيين لوضع الأقطاب الكهربائية (الشكل1E).
  4. ضع اللوحة على الجليد واملأها حتى حافة مع الجليد البارد 1X DPBS. استخدم نفس الحل DPBS لصنع الأطباق لضمان التوصيل الكهربائي المتسق في الإعداد.

3. تكوين الكهربائي

  1. تكوين الكهربائي. إعداد نبض poring تتكون من نبض ة ثنائي القطب واحد من 70 V، مع مدة 5 مللي ثانية، فاصل زمني من 50 مللي ثانية، وليس تسوس الجهد. إعداد نبض نقل أن يكون أربعة نبضات ثنائية القطب من 40 V، مع مدة 50 مللي ثانية، الفاصل الزمني من 999 مللي ثانية، و10٪ تسوس الجهد.
  2. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بالكهرباء واضبط الملقط ليكون على بعد 7 مم. غمر الأقطاب الكهربائية في كوب من DPBS قبل وفيما بين الكهربائي.

4. إعداد وتحميل الشعيرات الدموية الزجاج الحقن الدقيق

  1. إجراء اختبار منحدر على الساحبة micropipette المشتعلة / البني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحديد قيمة الحرارة.
  2. سحب الشعيرات الدموية حقن مع نهايات مدبب باستخدام المعلمات التالية: الحرارة = قيمة اختبار المنحدر، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 100.
  3. مراقبة الإبرة تحت مجهر مجسم. باستخدام ملقط غرامة، كسر الشعرية في زاوية بحيث يكون لها طرف مائل. كسر في موقف حيث أنها رقيقة بما فيه الكفاية لاستهداف القناة المركزية، في حين يجري قوية بما فيه الكفاية لاختراق الجلد.
    ملاحظة: النقطة التي يبلغ قطرها حوالي 20 درجة مئوية أو حوالي 50٪ من قطر الحبل الشوكي هي نقطة انطلاق جيدة. قد تكون هناك حاجة إلى محاولات متعددة للحصول على كسر الأمثل.
  4. إضافة حل FCF الأخضر السريع إلى مزيج RNP بنسبة 1:30 وتحميل حوالي 5 ميكرولتر من مزيج الحقن في الشعرية مع طرف ماصة Microloader.
  5. جبل الشعرية على مضخة تعمل بالهواء المضغوط، مع طرف مائل ة تواجه إلى أسفل.

5. تكوين مضخة تعمل بالهواء المضغوط

  1. تكوين مضخة تعمل بالهواء المضغوط. تعيين عقد إلى 0.5 جنيه لكل بوصة مربعة (رطل مربع)، وإخراج إلى 2 رطل لكل بوصة مربعة، والمدة إلى بوابات.
  2. اختبار إعدادات المضخة الشعرية والهوائية عن طريق غمس الشعرية في قطرة من الماء والضغط على دواسة القدم لحقن. تأكد من أن مزيج الحقن يخرج في تيار بطيء ولكن ثابت.
  3. ضبط ضغط عقد إذا كان مزيج حقن تبدأ تسرب تلقائيا أو يتم امتصاص الماء حتى الشعرية. زيادة ضغط الإخراج أو كسر أكثر من الشعرية إذا كان مزيج الحقن يخرج بطيئة جدا. تقليل ضغط الإخراج إذا كان الحقن يخرج بسرعة كبيرة.

6. حقن مزيج RNP في الحبل الشوكي

  1. التخدير axolotls في 0.03٪ محلول البنزوكاين لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  2. التقاط الحيوان مع ملقط حلقة ووضعها على سرير من السيليكون، مع الجانب الأيسر من الحيوان التي تواجه صعودا والذيل يشير نحو اليمين. وضع موقع الحقن في منتصف مجال عرض مجهر مجسم (الشكل1A).
  3. ضبط micromanipulator بحيث الشعرية تأتي في 60 درجة من الجانب الأيمن من مجال الرؤية (الشكل1B).
  4. تحديد الحبل الشوكي والقناة المركزية (الشكل1ج).
    ملاحظة: الحبل الشوكي هو الهيكل الأنبوبي فوق الوتر.
  5. تهدف إلى القناة المركزية، نقل الشعرية إلى الأمام لاختراق بلطف الجلد والعضلات في القناة المركزية للحبل الشوكي. الحد من حركة الشعرية إلى خطوات صغيرة، كما الحبل الشوكي هو الحق تحت عضلات الذيل.
  6. اضغط مع الاستمرار على دواسة القدم لحقن المزيج في القناة المركزية. لاحظ ما إذا كان مزيج RNP ينتشر على طول القناة المركزية كخط أزرق في كلا الاتجاهين، مما يدل على أن الشعرية قد تم وضعها بشكل صحيح (الشكل1D).
  7. إذا لم يحدث هذا، والحفاظ على دواسة القدم الضغط أثناء تحريك الشعرية قليلا في والخروج حتى يبدأ مزيج RNP في الذهاب. إذا أصبحت الشعيرات الدموية مسدودة بواسطة الأنسجة، قم بتطهيرها عن طريق إخراجها في الماء عند ضغط أعلى.
  8. ضبط ضغط الإخراج بحيث يكون كافيا فقط للتسبب في مزيج RNP لنشر في القناة المركزية، ولكن ليس كثيرا أنه يفجر الهيكل.
  9. الاستمرار في الضغط على دواسة القدم حتى ينتشر مزيج الحقن أكثر على طول القناة المركزية، حتى تصل إلى الحويصلة الطرفية في نهاية الحبل الشوكي والبطينين في الدماغ.
    ملاحظة: قد يستغرق هذا ما يصل إلى 2 دقيقة اعتماداً على حجم الحيوان. قد يكون من الضروري زيادة الضغط بعد بعض الوقت للتسبب في مزيج RNP لدخول البطينين الدماغ.
  10. المضي قدما في أقرب وقت ممكن إلى الكهربائي بعد الحقن الناجح.

7. الكهربائي

  1. نقل الحيوان مع ملقط حلقة على لوحة الكهربائي agarose أعدت (الشكل1E) على الجليد. وضع الذيل داخل الشق بحيث يتم وضعها من قبل agarose (الشكل1F).
  2. وضع الأقطاب الكهربائية في الآبار على جانبي الذيل. تأكد من أن كامل الحيوانات والأقطاب الكهربائية مغطاة بـ PBS الباردة.
  3. اضغط على مفتاح القدم لبدء الكهربائي.
  4. بعد اكتمال الكهرباء، أعد الحيوان إلى الماء.
  5. المضي قدما لحقن المزيد من الحيوانات إذا لزم الأمر.
  6. تأكد من أن الحيوانات الكهربائية صحية بعد التخدير يزول وأنه لا يوجد ضرر يلحق بالذيل.

8- تقييم كفاءة الخروج

  1. إصلاح ذيل الحيوان الكهربائي. جعل المقاطع العرضية من الذيل تليها تلطيخ المناعية الكيميائية لتقييم كفاءة خروج المغلوب على مستوى البروتين.
    ملاحظة: إذا كان بتر الذيل أن يتم بعد الكهربائي، يمكن استخدام الذيل قطع لهذا الغرض. الحيوانات الكهربائي مع gRNAs ضد Gfp أو التيروزينا، على سبيل المثال ، يمكن استخدامها كسيطرة سلبية4.
  2. وبدلاً من ذلك، يمكن استخراج الحبل الشوكي الكهربائي وتسلّد الحمض النووي. إجراء كتابة جينية PCR متبوعة بتسلسل Sanger أو تسلسل الجيل التالي لتقييم النسبة المئوية للموضع الوراثي المحرر15.
    ملاحظة: كفاءة التحرير الناتجة سوف تقلل من كفاءة التحرير الفعلية لNSCs، وذلك بسبب إدراج الخلايا غير الكهربائية والخلايا العصبية التي تفتقر إلى الاتصال apical إلى التجويف المركزي، وبالتالي لن تتلقى مزيج RNP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حقن والكهربائي من مجمع CAS9-gRNA ضد Sox2 في القناة المركزية الحبل الشوكي axolotl أدى إلى خسارة هائلة من النشاط المناعي SOX2 في غالبية NSCs الحبل الشوكي، مع GRNA ضد التيروزينا (تاير) كعنصر تحكم (الشكل2 A).B3-tubulin (ملطخة TUJ1) هو علامة للخلايا العصبية ولم يتم التعبير عنها في NSCs، وSOX2- TUJ1- اعتبرت الخلايا المحيطة القناة المركزية لتكون الخلايا التي تأوي حذف Sox2. وأظهرت القياس الكمي Sox2 بالضربة القاضية في عدد كبير من NSCs من قبل CAS9-Sox2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح البروتوكول الموصوف بضيق الوقت والمكان في الجين المقيد في NSCs في الحبل الشوكي axolotl. يسمح البروتوكول الحالي باستهداف محدد للشبكات الوطنية القومية في وقت وموقع محددين مع وجود نسبة عالية. فإنه يتجنب الآثار غير المرغوب فيها المحتملة الناشئة عن الجينات خروج المغلوب في NSCs في مناطق أخرى مثل الدماغ التي تحدث عند استخدام نظام Cre-LoxP. كما أنه يتجنب الآثار التنموية الناشئة عن خروج المغلوب المستمر، مما يسمح بدراسة وظيفة الجينات التي تركز على التجدد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول في الحيوانات البرية، وتجنب ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الأستاذة إيلي م. تاناكا على دعمها المستمر والطويل الأجل. وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (NSFC) منحة (317716)، ومنح بدء البحوث من جامعة جنوب الصين العادية (S82111 و 8S0109)، ومنحة مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2018M633067).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AgaroseSigma-AldrichA9539
BenzocaineSigma-AldrichE1501-100G
Benzocaine 0.03٪ (الوزن / الحجم)مزيج 500 مل من 10 & مرات ؛ TBS ، 500 مل من 400٪ (بالوزن / الحجم) Holtfreter محلول S و 30 مل من محلول مخزون البنزوكايين بنسبة 10٪ (الوزن / الحجم). املأ مستوى الصوت حتى 10 لتر ب dH2O. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
بنزوكائين 10٪ (بالوزن / الحجم)اخلطي 50 جم من البنزوكايين في 500 مل من الإيثانول 100٪ (vol / vol). يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 12 شهرا.
الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات 1.2 مم OD ، 0.94 مم معرفأداة التأتأة BF120-94-8
CaCl 2 < / sub > & middot ؛ 2H2OMerck102382
CAS9 ، 10xمزيج 200 ملي هيبس و 1.5 مليون KCl في الماء الخالي من RNase. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5. تصفية التعقيم ، aliquot وتخزينها في & ناقص ؛ 20 درجة ؛ C لمدة تصل إلى 24 شهرا
بروتين CAS9-NLS    الخلايا PNA BioCP03
، فالكون 10 سم351029
دومون # 5 - الملقط الدقيقالأدوات العلميةالدقيقة 11254-20
المثقف الكهربائيNepa Gene   ؛NEPA21
BEXمولد النبض CUY21EDIT II
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252-5G
Fast Green FCF Solution ، 5xإذابة 12.5 مجم من مسحوق FCF الأخضر السريع في 10 مل من 1 & مرات ؛ برنامج تلفزيوني.
مشتعل / براون مجتذب ماصة دقيقة أداة التأتأة P-97
هولتفريتر S الحل 400٪ (الوزن / الحجم)  قم بإذابة 11.125 جم من MgSO4< / sub> & middot ؛ 7H2O ، 5.36 جم من CaCl 2 < / sub > & middot ؛ 2H2O ، 158.4 جم من كلوريد الصوديوم و 2.875 جم من KCl في 10 لتر من dH2O. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
KClMerck104936
MgSO4· 7H2OMerck105886
أطراف ماصة MicroloaderEppendorf5242956003
Micromanipulator NarishigeMN-153  
NaClMerck106404
Pneumatic PicoPumpWorld Precision Instruments SYS-PV830
الملقط الدائريالأدوات العلمية الدقيقة11103-09
المجهر المجسمأوليمبوسSZX10 & nbsp ؛
تريسSigma-AldrichT6066
محلول ملحي مخزن في Tris ، 10xقم بإذابة 24.2 جم من قاعدة تريس و 90 جم من كلوريد الصوديوم في 990 مل من dH2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 بإضافة 10 مل من 37٪ (حجم / حجم) حمض الهيدروكلوريك. يمكن تخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
ملاقط ث / متغير فجوة 2 قطب كهربائي دائري من البلاتين ، قطر 10 ممNepa Gene   ؛CUY650P10
أطباق ثقافة قاعدة

المراجع

  1. O'Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
  2. Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
  3. Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
  4. Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002(2016).
  5. Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
  6. Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
  7. Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
  8. Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
  9. Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
  10. Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
  11. Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
  12. Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
  13. Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
  14. Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
  15. Fei, J. -F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
  16. Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
  17. Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Developmental Biology. 432 (1), 63-71 (2017).
  18. Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
  19. Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
  20. Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  21. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  22. Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260(2015).
  23. Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نظام CRISPR-Cas9معقد Cas9-gRNAالحقن في القناة المركزيةالتحليل الكيميائي النسيجي المناعيتفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد النمط الجينيتسلسل سانجر
الجينات المباشرة ضرب من Axolotl الحبل الشوكي الخلايا الجذعية العصبية عن طريق الكهربائي من المجمعات CAS9 البروتين-gRNA
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.