يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير داخل الظهارة من الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في الميورين الأمعاء الدقيقة

8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59853

⸱

يونيو 24, 2019

 , 
1Center for Immunity and Inflammation, Department of Pathology, Immunology and Laboratory Medicine, Rutgers New Jersey Medical School

في هذه المقالة

ملخص

نحن نوصف طريقة لتصور GFP المسمى + IELs باستخدام التصوير داخل vital من الأمعاء الدقيقة مورين عن طريق عكس الغزل القرص المجهر confocal. هذه التقنية تمكن من تتبع الخلايا الحية داخل الغشاء المخاطي لمدة تصل إلى 4 ح ويمكن استخدامها للتحقيق في مجموعة متنوعة من التفاعلات المعوية المناعية الظهارية.

الملخص

الخلايا الليمفاوية داخل الظهارية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا التّية (γ δ IEL) تلعب دوراً رئيسياً في المراقبة المناعية للظهارة المعوية. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود ليجاننهائي لمستقبلات الخلية T γδ, فهمنا لتنظيم التنشيط iEL γδ ووظيفتها في الجسم الحي لا يزال محدودا. وهذا يتطلب وضع استراتيجيات بديلة لاستجواب مسارات الإشارة التي تنطوي على تنظيم وظيفة IEL δ ومدى استجابة هذه الخلايا للبيئة الدقيقة المحلية. على الرغم من أن الـ IELs من المفهوم على نطاق واسع للحد من نقل الممرض، فإن استخدام التصوير داخل الفيتال كان حاسماً لفهم الديناميات المكانية المكانية للتفاعلات الظهارية IEL/في حالة ثابتة واستجابة لمسببات الأمراض الغازية. هنا، نقدم بروتوكولا لتصور سلوك الهجرة IEL في الغشاء المخاطي المعوي ة من الماوس مراسل الخلية ت gfp باستخدام مقلوب الغزل القرص cofocal الليزر المجهري. على الرغم من أن عمق التصوير الأقصى لهذا النهج محدود بالنسبة لاستخدام المجهر المسح الضوئي بالليزر اثنين من الفوتونات، والغزل القرص مجهر الليزر البؤري يوفر ميزة الحصول على صورة عالية السرعة مع انخفاض photobleaching و الصورة الضرر. باستخدام برنامج تحليل الصور 4D، يمكن تحليل سلوك مراقبة الخلايا T وتفاعلاتها مع الخلايا المجاورة بعد التلاعب التجريبي لتوفير نظرة ثاقبة إضافية في تفعيل IEL ووظيفة داخل الغشاء المخاطي المعوي.

المقدمة

توجد الخلايا اللمفاوية داخل الظهارة داخل الظهارة المعوية، وتوجد على طول غشاء الطابق السفلي وبين الخلايا الظهارية المجاورة في الفضاء الجانبي بين الخلايا1. هناك تقريبا واحد IEL لكل 5-10 خلايا الظهارية; هذه العبوات اللي ة كحراس لتوفير المراقبة المناعية للامتداد الكبير للحاجز الظهاري المعوي2. تشكل الـ IELs التي تعبر عن مستقبلات الخلايا t (TCR) ما يصل إلى 60% من إجمالي عدد السكان في الأمعاء الدقيقة في المورين. الدراسات في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا التائية تتثبت من دور وقائي لهذه الخلايا استجابة لإصابة الأمعاء والتهاب والعدوى3,4,5. على الرغم من جيل من Tcrd خروج المغلوب الماوس6, فهمنا لالبيولوجيا IEL γδ لا يزال محدودا ويرجع ذلك جزئيا إلى حقيقة أن الليجانس المعترف بها من قبل tcr γδ لم يتم تحديدها بعد7. ونتيجة لذلك، فإن عدم وجود أدوات لدراسة هذه الخلايا السكان جعلت من الصعب التحقيق في دور تنشيط ووظيفة tCR γδ في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية. لسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير تقنيات التصوير الحي لتصور سلوك الهجرة IEL δ δ والتفاعلات مع الخلايا المعوية المجاورة كوسيلة لتوفير نظرة إضافية على وظيفة IEL والقدرة على الاستجابة للمحفزات الخارجية في الجسم الحي.

على مدى العقد الماضي، وسعت التصوير داخل الحيوية بشكل كبير فهمنا للأحداث الجزيئية التي تنطوي على جوانب متعددةمن البيولوجيا المعوية، بما في ذلك الخلايا الظهارية سفك 8، وتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري9 ،10،عينة الخلية النقوي من المحتويات المضيئة11،12، وتفاعلات المضيف ميكروب11،13،14،15،16 . في سياق علم الأحياء IEL، وقد ألقى استخدام المجهر داخل الفيتال الضوء على ديناميات المكانية الصدغية من الحركة IEL والعوامل التي تتوسط سلوك المراقبة13،14،15، 16. تطور TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) مراسل الفئران, الذي تسميات + IELs من قبل التعبير النووي GFP17, كشفت أن المحطات المثيلة هي motile عالية داخل ظهارة ومعرض سلوك مراقبة فريدة من نوعها التي تستجيب للميكروبات العدوى17,13,14. في الآونة الأخيرة، تم تطوير آخر ماوس مراسل الخلية t γδ (Tcrd-GDL) الذي يعبر عن GFP في السيتوبلازم للسماح تصور الخلية بأكملها18. وقد استخدمت منهجية مماثلة للتحقيق في متطلبات مستقبلات كيميائية محددة، مثل مستقبلات G البروتين مقرونة (GPCR)-18 و -55، على ديناميات الحركة IEL19،20. في غياب مراسل خلية محددة، استخدمت الأجسام المضادة المترافقة الفلورسنت ضد CD8α لتصور وتتبع حركة IEL في الجسم الحي19،20. على الرغم من أن المجهر المسح الضوئي بالليزر باثنين من الفوتونات يستخدم عادة في التصوير داخل الفيتال، فإن استخدام المجهر الليزري البؤري للقرص الدوار يوفر مزايا فريدة لالتقاط صور عالية السرعة وعالية الدقة متعددة القنوات مع الحد الأدنى من الضوضاء الخلفية. هذه التكنولوجيا مثالية لتوضيح الديناميات المكانية المكانية المكانية للتفاعلات المناعية/الظهارية داخل البيئة الدقيقة المعقدة للغشاء المخاطي المعوي. وعلاوة على ذلك، من خلال استخدام مختلف نماذج الماوس المعدلة وراثيا و / أو خروج المغلوب، وهذه الدراسات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التنظيم الجزيئي للمناعة المعوية و / أو وظيفة الخلية الظهارية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد أجريت جميع الدراسات في جمعية تقييم واعتماد مختبر رعاية الحيوانات (ALAC) المعتمدة منشأة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها روتجرز نيو جيرسي كلية الطب الطب المقارن الموارد.

1. إعداد الماوس

ملاحظة: الإجراء التالي، بما في ذلك تحضير الحيوانات والجراحة، يستغرق 30-40 دقيقة قبل الجراحة، تشغيل المجهر وتسخين الحاضنة المغلقة على المجهر إلى 37 درجة مئوية.

  1. إجراء تجارب على الفئران TcrdEGFP 8-10 أسابيع القديمة على خلفية C57BL/6، والتي تم الحصول عليها من برنارد ماليسن (INSERM، باريس، فرنسا). ووفقاً للإجراء المعتمد من قبل الاتحاد الدولي للقضاء على الفقدان، يقوم بالتخدير بواسطة حقن الكيتامين (120 ملغم/كغم) وإكسيلازين (10 ملغم/كغم) على أساس وزن الحيوان. تقييم مستوى التخدير عن طريق معدل التنفس (55-65 نفسا في الدقيقة الواحدة)21، وقرصة إصبع القدم وردود الفعل الشاحب.
  2. بمجرد الوصول إلى التخدير بالطائرة الجراحية، قم بتأمين الساقين الخلفيتين للفأر باستخدام شريط إلى وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، والتي يمكن رصدها بواسطة ميزان الحرارة المستقيم. إذا كانت هناك علامات على أن التخدير هو قبالة (على سبيل المثال، زيادة معدل التنفس، وامض و / أو العين العضلات الوخز استجابة لانعكاس بالببرال)، إعادة إدارة 50 ميكرولتر من الكيتامين / إكسيلازين في وقت واحد حتى يتم تخدير الماوس تماما.
  3. إعداد الصبغة النووية عن طريق تخفيف 50 μL من Hoechst 33342 (10 ملغ / مل) مع 315 ميكرولتر من 0.9٪ المالحة; التركيز النهائي هو 37.5 ملغم/كغم على أساس وزن الماوس (200 ميكرولتر الحجم التقريبي). مرة واحدة يتم تخدير الماوس، وحقن ببطء Hoechst باستخدام حقنة درنة من خلال الجيوب الوريدية الرجعية المدارية.
    ملاحظة: انتظر 1-2 دقيقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية للسماح للماوس بالتكيف مع التغير في حجم التداول بعد الحقن المداري الرجعية.
  4. ضع كمية صغيرة من مواد التشحيم على العينين لمنعها من الجفاف.

2. جراحة الفأر: البطن لفضح الغشاء المخاطي المعوي

  1. إجراء شق عمودي 2 سم من خلال الجلد والصفاق على طول خط الوسط من أسفل البطن لخارج منطقة الأمعاء ليتم تصويرها.
  2. باستخدام ملقط الزاوية، وسحب بعناية cecum من تجويف الصفاوية وتحديد منطقة الأمعاء الدقيقة ليتم تصويرها. يجب الحرص على عدم تمزيق الأوعية الدموية المساريقية خلال هذه العملية. لتقليل الضرر أو النزيف المحتمل، تجنب الاستيلاء على الأمعاء أو معسر هابس هابس.
  3. حدد منطقة ملائمة من الأمعاء الدقيقة (2-3 سم) للتصوير الذي يحتوي على أقل قدر من محتويات البراز. إعادة بعناية التجويف الدقيق والأمعاء الدقيقة المتبقية إلى تجويف الصفاون، مع ترك الجزء من الاهتمام خارجيا.
    ملاحظة: تجنب ثقب الأوعية الدموية أو تعطيل الأوعية الوعائية المساريقية خلال هذه الخطوة.
  4. ضع زوجين من الملقط على جانبي الموضع الكامنة بين الأوعية الدموية، وفرك بلطف نصائح الملقط معا لخلق ثقب في الغشاء (الشكل1)22. وهذا سوف يسمح للإبرة لتمرير من خلال mesentery عند إغلاق تجويف الصفايا تحت الأمعاء.
  5. أغلق الشق مع الحفاظ على حلقة الأمعاء الخارجية. باستخدام ملقط الزاوية ومنحنية، تفتق نقطة إبرة تعلق على خياطة 5 سم، واختراق جانب واحد من البصاق، انتقل من خلال ثقب المحرز في الخطوة السابقة، وحتى من خلال الجانب الآخر من بطانة البصاق. ضع خيطاً واحداً في الأعلى، وآخر بالقرب من الجزء السفلي من الشق.
    ملاحظة: تجنب الإضرار بالأوعية الدموية أثناء هذه الخطوة.
  6. كرر هذه العملية لإغلاق الجلد تحت حلقة الأمعاء، عن طريق وضع خياطة واحدة في منتصف الشق، بين الغرز السابقة في البِاقَلة الكامنة.
    ملاحظة: من المهم فقط أن تُستبعد المنطقة التي يجب تصويرها؛ وهذا سوف يقلل من الحركة الدخيلة أثناء التصوير. تأكد من تجنب ربط قبالة الشرايين المساريقية.
  7. استخدام الكواتيري الكهربائي لجعل خط من ثقب على طول الحدود المضادة للخط. مباشرة بعد الكي، وتطبيق بضع قطرات من الماء على سطح الأمعاء لمنع أضرار إضافية الأنسجة الناجمة عن الحرارة. قم بلط مُنَزَه بـ Kimwipe لإزالة الماء المتبقي.
  8. قطع شق أفقي صغير على الحافة البعيدة للأنسجة الكيّة باستخدام مقص فاناس والمضي قدما في قطع طول الخط الكي نحو الطرف القريب من الجزء الخارجي من الأنسجة (حوالي 1.5 سم في الطول) لفضح الغشاء المخاطي السطح.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم الملقط لإزالة أي محتوى برازي زائد متبقي على السطح المخاطي المكشوف.
  9. تغطية بطن الماوس مع Kimwipe رطبة لمنع الأنسجة من أن تصبح جافة. نقل الماوس إلى المجهر في وعاء مغطى.

3. الحصول على صورة بواسطة القرص الغزل كونبوكلوسكوبي

  1. ماصيت 150 ميكرولتر من 1 ميكرومتر أليكسافلور 633 في HBSS على أغطية الزجاجأسفل من طبق 35 مم. وضع الماوس بحيث السطح المخاطي فتح يتصل مباشرة غطاء.
  2. إمالة رأس المجهر مرة أخرى ووضع الماوس على طبق يغطي انزلق على مرحلة التصوير في حاضنة ما قبل تسخينها. بدلا من ذلك، وتغطي الماوس عن طريق بطانية التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
  3. إطلاق برنامج التصوير. يجب ألا تتجاوز كثافة الإثارة ووقت التعرض لكل ليزر 10-15 مللي واط أو 120-150 مللي ثانية، على التوالي، لتجنب التبييض الضوئي ولتقليل الفاصل الزمني بين النقاط الزمنية. اضبط متوسط الإطار إلى "2" واضبط وظيفة كسب EM لتقليل الضوضاء في الخلفية. حدد المعايرة الموضوعية 63x لضمان القياس الصحيح لحجم البكسل.
    ملاحظة: الإعدادات المفصلة أعلاه تهدف إلى توفير مرجع أولي، ولكن سوف تختلف تبعاً لتكوينات المجهر الفردية.
  4. باستخدام الليزر 405 نانومتر والهدف الجوي 20X، تصور النوى لتحديد موقع حقل من الزغب التي تفتقر إلى حركة ملحوظة أو الانجراف عن طريق العين. تجنب مناطق الحركة الارتبية بسبب التنفس أو التمعج أو ضربات القلب.
  5. باستخدام المسح الضوئي XY، تسجيل إحداثيات XY من مجال الاهتمام والتبديل إلى الغمر الغليسي هدف 63X.
  6. تأكد من أن الزغب في الحقل المحدد مستقر من خلال الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر لمدة تصل إلى دقيقة واحدة.
  7. أثناء الحصول على صورة حية على قناة 405 نانومتر، ضبط التركيز للعثور على الطائرة المتعامدة فقط تحت طرف متعرج. الحصول على Z-المكدسات بدءا من أسفل ظهارة طرف أسفل الفيلز حتى أنه من الصعب حل النوى، حوالي 15-20 ميكرون، وذلك باستخدام خطوة 1.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: عند التصوير بثلاث قنوات (405، 488، 640 نانومتر) باستخدام أوقات التعرض المذكورة أعلاه، فمن الممكن الحصول على جميع القنوات الثلاث بالتتابع على فترات 20 ثانية تقريبا.
  8. افتح البرنامج في وضع التحليل، 3-5 دقيقة بعد البدء في عملية الاستحواذ، لتأكيد استقرار الصورة وحركة iEL. استمر في الحصول على صور لمدة 30-60 دقيقة لكل حقل من حقول الزغب. سجل 2-3 حقول لكل ماوس. أثناء التصوير، راقب الماوس كل 5 دقائق.
    ملاحظة: إذا بدأ التخدير في التآكل، استخدم الملقط لقشر ةيبلطف عنق الفأر لتدبير 50 ميكرولتر من الكيتامين/الزيلازين في وقت واحد. استمر في مراقبة مستويات التخدير وإعادة إدارتها عند الضرورة.
  9. ليس من المستحسن لتصوير ماوس واحد لفترة أطول من 4 ح. بمجرد اكتمال الحصول على صورة، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحم تليها استرواح الصدر الثنائية.

4. 4D تحليل الصور

  1. استيراد ملفات الصور مباشرة إلى برامج التجسيد 4D.
  2. إنشاء أسطح فردية لـ IELs والتجويف، ثم تتبع الأسطح مع مرور الوقت باستخدام المعلمات الموضحة في الجدول 1 كمرجع أولي. بالنسبة لـ IELs، قم بتمكين كائنات اللمس سبليت باستخدام قطر نقطة البذور المشار إليه.
  3. استخدم خوارزمية التتبع التلقائي لتحديد حركة IEL. على الرغم من أن خوارزمية التتبع دقيقة نسبيا، فإنه من الضروري لفحص بصريا المسارات لكل IEL الفردية. إذا كان المسار غير صحيح، قم بتصحيحه باستخدام دالات قطع الاتصال والاتصال ضمن علامة التبويب تحرير المسارات.
  4. لتحديد المسافة من كل IEL إلى التجويف، حدد سطح التجويف وقم بوظيفة تحويل المسافة ضمن قائمة الأدوات. عند المطالبة، حدد خارج Surface. بمجرد حساب، سيتم عرض تحويل المسافة كقناة 4.
  5. قم بتصفية الحد الأدنى للقناة الرابعة لتحديد الـ iels γδ الموجودة في الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS). يجب أن تكون هذه القيمة قريبة من 15 ميكرومتر، استناداً إلى ارتفاع خلية عمودية ظهارية. يتم الإبلاغ عن النسبة المئوية لمجموع الـ iels في هذا النطاق كتردد لـ (Δ IELs) في LIS.
  6. لمزيد من التحليل، تصدير البيانات الإحصائية بما في ذلك: IEL سرعة المسار، وتتبع النزوح، وتتبع الاستقامة وطول المسار. بدلاً من ذلك، تحليل البيانات باستخدام الوحدة النمطية Vantage. اعتمادا على التجربة، الحصول على مقاييس إضافية من البيانات المكتسبة، بما في ذلك وقت الإيذب في LIS أو IEL/التفاعلات الظهارية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام التصوير داخل الحيات من الفئران مراسل TcrdEGFP، وقد أظهرنا سابقا أن + Δ IELs يحمل سلوك مراقبة ديناميكية، التي تقوم بدوريات في ظهارة عن طريق الهجرة على طول غشاء الطابق السفلي وإلى الفضاء الجانبي بين الخلايا (LIS) في ثابت الدولة (الشكل 2, فيلم 1).

ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتقييم كيفية تثبيط مسارات إشارة خلية محددة و / أو مستقبلات يؤثر على سلوك الهجرة iEL. على سبيل المثال، interleukin (IL)-15 هو cytokine البنيوتروبيك الذي هو ضروري لـ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أتاح تطوير تقنيات الفحص المجهري داخل الفيتال فرصة غير مسبوقة لمراقبة إعادة تنظيم الهياكل الفرعية8و9و22و تفاعلات الخلية12، 25 وسلوك هجرة الخلية13،14،15،16،26 في الأنسجة التي يتعذر الوصول إليها خلاف ذلك. كا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R21 AI143892، نيو جيرسي منحة مؤسسة الصحة، بوش الطبية الحيوية غرانت (KLE). نشكر مادلين هو على مساعدتها في تحرير المخطوطة وتقديم البيانات الواردة في النتائج التمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طبق 35 مم ، رقم 1.5 CoverslipMatTekP35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 HydrazideInvitrogenA30634
BD PrecisionGlide إبر تحت الجلد - 27 جرامثيرمو فيشر ساینتيفيك14-826-48
BD حقنة معقمة ذات طرف انزلاق - 1 ملثيرمو فيشر ساینتفيك14-823-434
BD حقنة توبركولينثيرمو فيشر Scientific14-829-9
تشريح مقصThermo Fisher Scientific08-940
الكيالكهربائي Thermo Fisher Scientific50822501
غرفة حضانة مغلقةOKOLABمجهر
إبر العين ، الحجم # 3 ؛ 1/2 دائرة ، نقطة تفتق ، طول الوتر 12 ممRobozRS-7983-3
Hank's محلول الملح المتوازنSigma-Aldrich55037C
Hoechst 33342InvitrogenH3570
Imaris (v. 9.2.1) مع وحدات البدء والمسار ووحدات XT BitplaneSoftware
مقلوب DMi8LeicaMicroscope
IQ3 (v. 3.6.3)AndorSoftware
KetaminePutneyAnesthesia
KimwipesVWR21905-026
مقص McPherson-Vannas 3 " (7.5 سم) خياطة جراحية طويلة 5 × 0.15 مم حادةمستقيمة RobozRS-5600
قابلة للامتصاص ، بكرة حريرية ، ملقطفيشر ساينتيكNC0798934
4.25 بوصة (11 سم) طويل الزاوية ناعم 1.2 مم طرفRobozRS-5228
Puralube مرهم بيطريDechraمرهم العين التشحيم
قرص الغزل Yokogawa CSU-W1 مع 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO هدف الغمر بالجلسرين ، كاميرا iXon Life 888 EMCCD ، ليزر 405 نانومتر ، ليزر 488 نانومتر DPSS ، ليزر 640 نانومترأندورنظام متحد البؤر
XylazineAkornAnesthesia
غير أسود مضفر

المراجع

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090(2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير داخل الظهارة من الخلايا الليمفاوية داخل الظهارة في الميورين الأمعاء الدقيقة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.