إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

سرطان المعدة هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعًا في جميع أنحاء العالم وثالث سبب رئيسي للوفاة بالسرطان. في عام 2018، تم تشخيص أكثر من 1,000,000 حالة جديدة من سرطان المعدة على الصعيد العالمي، وقتل ما يقدر بـ 783,000 شخص بسبب هذا المرض¹. لا يزال معدل الإصابة بسرطان المعدة والوفيات مرتفعة جداً في بلدان شمال شرق آسيا^2و3. على الرغم من التقدم الكبير في مجال علاج السرطان، لا يزال تشخيص المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة المتقدم ضعيفا، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات من حوالي 25٪^{4،5،6، 7،}. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لسرطان المعدة

علاج سرطان المعدة هو التحدي بسبب عدم تجانسه عالية^8،9. وهكذا، فإن مسألة كيفية التصدي لتحديات عدم تجانس الورم لتحقيق الطب الدقيق أمر أساسي لبحوث السرطان. في المختبر وفي نماذج الجسم الحي تلعب أدوارا حاسمة في توضيح الآليات غير المتجانسة وبيولوجيا سرطان المعدة. ومع ذلك، على الرغم من أن هناك العديد من خطوط خلايا سرطان المعدة والعديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا التقليدية للبحوث ما قبل السريرية، ومساوئ هذه النماذج تحد من تطبيقاتها¹⁰. لأن خصائص هذه النماذج قد تغيرت في الثقافة، فإنها لم تعد نموذج عدم تجانس الورم، واستجاباتها لم تكن قادرة على التنبؤ الاستجابات في البشر¹¹. هذه القضايا تحد بشدة من إمكانية تحديد المجموعات الفرعية من مرضى السرطان التي سوف تستجيب للأدوية المستهدفة. الثقافة على المدى القصير من الأورام الأولية يوفر وسيلة سريعة نسبيا وشخصية للتحقيق في الخصائص الدوائية المضادة للسرطان، والتي من المرجح أن تكون السمة المميزة لعلاج السرطان شخصية.

ويفضل xenografts المستمدة من المريض (PDXs) كنموذج بديل قبل السريرية لالتنميط استجابة المخدرات¹². وبالإضافة إلى ذلك، نماذج PDX تقدم أداة قوية لدراسة بدء وتطور السرطان^13،14. نماذج PDX الحفاظ على المظهر الهيستلوجي للخلايا السرطانية، والاحتفاظ بالتباين داخل الورم، وتعكس بشكل أفضل المكونات البشرية ذات الصلة من الورم microenvironment^15،16. ومع ذلك، فإن الحد من نماذج PDX المستخدمة على نطاق واسع هو معدل نجاح منخفض لإنشاء ونشر الأورام الصلبة البشرية بشكل تسلسلي. في هذه الدراسة، يتم وصف أساليب ناجحة بشكل لائق لإنشاء نماذج PDX وخطوط الخلايا الأساسية.

تمت الموافقة على هذه الدراسة البشرية من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات المؤسسية في مركز السرطان جامعة صن يات سين (SYSUCC، قوانغتشو، الصين). تمت الموافقة على الدراسة الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة صن يات سين. ملاحظة: أجريت جميع التجارب وفقاً للقوانين والمبادئ التوجيهية المؤسسية ذات الصلة، بما في ذلك المبادئ التوجيهية للحماية من التعرض المهني ضد مسببات الأمراض المنقولة بالدم.

1. إعداد عينة

1. الحصول على أنسجة سرطان المعدة (P0 = مرور 0) مباشرة من العملية. يجب أن تكون عينة الورم أكبرمن 0.5 سم 3.
2. إعداد 3-4 مل من محلول الأسهم: على سبيل المثال، RPMI-1640 المتوسطة (1X) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 100 U / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل ستربيتماسين.
3. وضع عينة الورم الطازجة في الأوراق المالية الحل في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 4 ساعات.

2. إنشاء نموذج PDX (الشكل 1)

1. لضمان وجود منطقة جراحية معقمة، قم بتطهير جميع المواد بالأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 30 دقيقة قبل نقلها إلى المختبر الحيواني.
   ملاحظة: غرفة العمليات تحتاج إلى تطهيرها مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، قبل أن ننظف المكتب مع ثنائي كلورو حمض الإيزوسيانوريك حمض الصوديوم suppositoria مطهر. ثم يستخدم البوفيدون اليود لتطهير الجلد.
2. باستخدام الملقط والمقص، تشريح بعناية أنسجة الورم وتقليم لهم إلى عدة قطع صغيرة (ما يقرب من 1 مم³ مكعبات) في ظروف معقمة.
3. تخدير الإناث 5-7 أسابيع من العمر NOD-SCID-IL2rg (NSG) الفئران عن طريق التعرض ل1-1.5٪ isoflurane مع آلة التخدير.
   1. التخدير الماوس حتى يتوقف عن النضال ولكن يحافظ على التنفس حتى.
      ملاحظة: أنبوب 50 مل هو معدات بسيطة تعمل على غرار آلة التخدير. استخدام مرهم العين البيطرية لمنع الجفاف غير ضروري بسبب وقت التشغيل القصير.
4. قم بعمل شق 1 سم على كلا الجناحين الظهري باستخدام مقص معقم، وزرع قطعة ورم واحدة في كل جانب من جوانب الماوس.
   1. للتأكد من أن قطعة الورم لا تنزلق، استخدم ملقط معقم لتعطيل الأنسجة تحت الجلد. ثم، مقطع قطعة من أنسجة الورم، ووضعها في الموقع العميق.
5. إغلاق منطقة الزرع عن طريق خياطة تحت الجلد مع الإبر خياطة الجراحية، ووضع علامة على آذان الماوس مع علامات الأذن المسمى
6. تعقيم الجرح باليود.
7. وضع الفئران بلطف في قفص فارغ بعد الجراحة مع الحفاظ على recumbency صارمة. إيلاء اهتمام وثيق لحالة الفئران. يستيقظون ويبدأون في المشي حوالي 3-4 دقائق في وقت لاحق. وضع الفئران التي خضعت لعملية جراحية في قفص جديد آخر منفصلة عن تلك التي لم تخضع لعملية جراحية.
8. تقييم حجم الورم عن طريق جس موقع الزرع. قياس الأورام مع الفرجار فيرنييه مرتين في الأسبوع.
9. بمجرد أن يصل الورم إلى 10 مم في القطر، تزداد الحالة الحيوانية سوءاً، أو تقرح الورم، ويؤدي إلى قتل الماوس بطريقة معتمدة من قبل IRB. إعادة زرع شظايا الورم الطازجة حصادها في 2 الفئران الجديدة للتمرير، أو تخزين العينات مؤقتا في PBS على الجليد لعزل خطوط الخلايا الأولية.

3. حفظ الأنسجة بالتبريد

ملاحظة: يشير هذا الجزء بشكل أساسي أساليب "مجموعة التبريد مجموعة الأنسجة الحية". يتم سرد المجموعات والمعدات الرئيسية في جدولالمواد.

1. قتل الفئران مع طريقة وافق IRB عندما يكون الورم أكبر من 10 ملم في القطر.
2. باستخدام ملقط معقمة ومقص، عزل ببطء الورم من الفئران.
3. غسل أنسجة الورم مع DPBS في طبق 10 سم. تشريح وإزالة المناطق النخرية والأنسجة الدهنية والجلطات الدموية والأنسجة الضامة مع ملقط ومقص.
4. قطع أنسجة الورم إلى أقصى سمك 1 ملم مع قالب.
5. تُغسل الشرائح مع DPBS في طبق بحجم 10 سم.
   ملاحظة: تتضمن عملية التزجيج استخدام أنابيب تحمل اسم V1/V2/V3 في الخطوات 3.6-3.8. المكونات الرئيسية هي DMSO والسكروز.
6. نقل شرائح إلى أنبوب V1 مع ملقط، واحتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
7. صب الحل V1 وشرائح في طبق 10 سم. نقل شرائح إلى أنبوب V2 مع ملقط، واحتضان أنبوب V2 في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
8. صب الحل V2 وشرائح في طبق 10 سم. نقل شرائح إلى أنبوب V3 مع ملقط، واحتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   1. إذا كانت عدة شرائح لا تزال عائمة، لفة وعكس الأنبوب لفترة وجيزة، ووضع الأنبوب في 4 درجة مئوية مرة أخرى حتى تغرق جميع الشرائح تماما. إذا لزم الأمر، تجاهل الشرائح العائمة.
9. صب الحل V3 وشرائح في طبق 10 سم.
10. قطع أصحاب الأنسجة إلى الطول المناسب، ووضعها على الشاش المعقمة. نقل شرائح على أصحاب. التفاف أصحاب مع الشاش، ووضعها في النيتروجين السائل باستخدام ملقط، تليها الحضانة لمدة 5 دقائق.
11. تسمية قارورة المبردة مع معلومات الأنسجة.
12. نقل أصحاب مع شرائح الأنسجة في قارورة المبردة، والتي يتم تخزينها في النيتروجين السائل.

4. عزل الخلايا الأولية (الشكل 2)

1. تعقيم ملقط ومقص مع ارتفاع ضغط البخار في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. استئصال عينات سرطان المعدة من عينات مقطعة أو أنسجة PDX حصادها. ضع الأنسجة على الجليد، ثم نقل الأنسجة إلى طبق ثقافة معقمة 10 سم.
3. تشريح وإزالة المناطق النخرية والأنسجة الدهنية والجلطات الدموية والأنسجة الضامة مع ملقط ومقص.
4. غسل أنسجة الورم مرة واحدة مع DPBS التي تحتوي على 100 U / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل العقديات في طبق 10 سم.
5. قطع أنسجة الورم إلى 1 مم³ قطع على غطاء الطبق. يجب أن يكون سمك الحد الأقصى لكل قطعة 1 ملم.
6. نقل الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع ما يقرب من 7 مل من نوع 1 كولاجيناز وتريبسين (1:14) الحل. دوامة الخليط لفترة وجيزة.
7. حضانة الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة.
8. إضافة حجم متساو من RPMI-1640 المتوسطة (1X) تستكمل مع FBS 10٪ إلى الأنبوب. دوامة الخليط جيدا.
9. نقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة عن طريق الترشيح البطيء من خلال مرشح 40 درجة مئوية.
   ملاحظة: استخدم مرشحات 40 ميكرومتر لضمان نسبة أعلى من الخلايا السرطانية. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام مرشحات 100 ميكرومتر للحفاظ على المزيد من أنواع الخلايا، مثل الخلايا المناعية.
10. الطرد المركزي في filtrates في 113-163 × ز لمدة 5-7 دقيقة في RT. إزالة بعناية supernatant.
11. غسل بيليه مع 5 مل من PBS، وإزالة بعناية supernatant.
12. إذا كان بيليه أحمر، فإنه يحتوي على العديد من كريات الدم الحمراء. بلطف إعادة تعليق بيليه مع 500 درجة مئوية من الدم الأحمر حالة الدم العازلة اللليس. بعد 5 دقائق الحضانة، إضافة 5 مل من PBS، وإزالة بعناية supernatant.
13. إعادة تعليق بيليه مع وسط الثقافة، ونقل الخليط إلى طبق معقم 10 سم.
14. استبدل الوسط بوسيلة تحتوي على مصل كل 2-3 أيام.
15. مرور الخلايا الأولية باستخدام التربسين / EDTA عندما تصل إلى التقاء 50٪.

هنا، تم الحفاظ على أنسجة الورم من عملية في حل الأوراق المالية حتى الخطوة التالية. في غضون 4 ساعات، تم قطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة وزرعها في الأجنحة الظهرية من الفئران NSG التي تم تخديرها باستخدام القطن غارقة isoflurane. يمكن استئصال الأورام التي يزيد حجمها عن 1 سم3 لزرعها في فئران جديدة (الشكل1) أو تقطيعها بعناية والحفاظ عليها في النيتروجين السائل بعد البروتوكول. في هذه الدراسة، نمت أورام الجيل الأول ببطء أكثر من تلك التي في الأجيال اللاحقة، مع أخذ 3 أسابيع أو أكثر للوصول إلى الحجم المناسب. وكان معدل نجاح الجيل الأول من تكوين الورم تحت الجلد أكبر من 80٪. أكدنا هوية الخلايا السرطانية من نماذج PDX من قبل H & E تلطيخ تحت المجهر (الشكل3C). وأخيرا، كان معدل نجاح تشكيل الورم من أنسجة الورم المبردة ما يقرب من 95٪.

تم عزل الخلايا السرطانية الأولية كوسيلة أخرى للتحقيق في الورم الفردي. تم عزل الخلايا إما من عينات المنطوق أو نماذج PDX. تم غسل أنسجة الورم مع DPBS وقطع إلى قطع. تم هضم شظايا الأنسجة بدقة مع الكولاجين من النوع 1 والتربسين (1:14) قبل الترشيح. بعد إزالة كريات الدم الحمراء ، تم زراعة الخلايا بنفس الطريقة التي تم بها زراعة الخلايا السرطانية الأخرى. تموت الخلايا المازينشيمالية الباقيةفي الممرات اللاحقة (الشكل 2). استنادًا إلى الاختلافات في علم المورفولوجيا، يمكننا التعرف بسهولة على الخلايا السرطانية. الخلايا الطبيعية لها شكل وحجم موحد، ولكن الخلايا السرطانية تأتي في مختلف الأحجام والأشكال. بالإضافة إلى ذلك، في الخلايا السرطانية، نواة لديها هياكل غير منتظمة والسيتوبلازم صغيرة نسبيا. لذلك، تم توثيق الخلايا الأولية بشكل مستقل من قبل اثنين من علماء الأمراض تحت المجهر (الشكل3A). لمزيد من التأكيد، تم استخدام H & E تلطيخ لمراقبة مورفولوجيا الخلايا السرطانية بعد التثبيت (الشكل3B). وكان معدل العزل الناجح لخطوط الخلايا الأساسية حوالي 40 في المائة. يجب أن يتم مرور الخلايا الأساسية 4 أو 5 مرات بعد العزلة، وهناك حاجة إلى المصادقة المرضية. قد تستغرق هذه الخطوات حوالي 20 يومًا.

الشكل 1 مخطط لإنشاء نماذج xenograft المستمدة من المريض (PDX).
لإنشاء نماذج PDX بنجاح، قم باستئصال كتل الورم في غرفة العمليات للمعالجة الفورية. تقسيم الورم إلى عدة قطع صغيرة. وضع كرات القطن غارقة isoflurane في أنبوب 50 مل لالتخدير الفئران، وقطع الجروح في الأجنحة الظهرية. تشريح حادة الأنسجة تحت الجلد مع ملقط، واستخدام ملقط لوضع قطعة واحدة من الورم تحت الجلد بعيدا عن الجرح. خياطة وتعقيم الجروح. تتطلب عملية التخدير مراقبة دقيقة للعلامات الحيوية للماوس، مثل معدل التنفس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2 مخطط لعزل الخلايا الأساسية.
الحصول على عينات الورم من غرفة العمليات. اغسل أنسجة الورم بسرعة، واقطعها إلى قطع. هضم عينات الورم مع نوع 1 كولاجيناز والتربسين في 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة، وخلط الأنبوب كل 5 دقائق. ثم، إضافة حجم متساو من المتوسطة مع FBS 10٪، الطرد المركزي الخليط، ووضع فيلترات في أنبوب جديد. إزالة supernatant، وغسل بيليه. على أساس لون بيليه، تقرر ما إذا كان لlyse خلايا الدم الحمراء. نقل بيليه في طبق معقم جديد 10 سم، وثقافة الخلايا لعدة ممرات قبل فحص الخلايا السرطانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3 توثيق الخلايا السرطانية الأولية.
(أ) صور الخلايا الأولية من مرضى GC. تم عزل الخلايا مباشرة من الأنسجة الطازجة ومرورها أكثر من 5 مرات. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر (يسار)، 100 ميكرومتر (وسط) و50 ميكرومتر (يمين). (ب) صور من H & E ملطخة خلايا سرطان المعدة الأولية. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر (يسار)، 200 ميكرومتر (وسط) و100 ميكرومتر (يمين). (C) صور من أورام PDX H & E ملطخة. قضبان المقياس: 500 ميكرومتر (يسار)، 200 ميكرومتر (وسط) و100 ميكرومتر (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.