مقالة منهجية

شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية

DOI:

10.3791/59873

⸱

أغسطس 14, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, Groupe Hospitalier Sud, Hospices Civils de Lyon, 2Circulating Cancer (CIRCAN) Program, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 3University of Lyon, Claude Bernard University, Cancer Research Center of Lyon, 4Biolidics Limited, 5Institut de Pathologie Multisites des HCL-Site Sud, Hospices Civils de Lyon, 6Acute Respiratory Disease and Thoracic Oncology Department, Lyon Sud Hospital, Hospices Civils de Lyon Cancer Institute, 7EMR-3738 Therapeutic Targeting in Oncology, Lyon Sud Medical Faculty, Lyon 1 University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) هو موضوع شائع في البحوث المترجمة. يصف هذا البروتوكول فحصًا شبه تلقائي للفلورة المناعية (IF) لتوصيف PD-L1 وتعداد CTCs في عينات المرضى من سرطان الرئة غير الصغيرة (NSCLC).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إلقاء الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) المستمدة من الورم الأساسي في مجرى الدم أو الجهاز اللمفاوي. هذه الخلايا النادرة (1-10 خلايا لكل مل من الدم) تبرر سوء التكهن وترتبط بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام أقصر في العديد من السرطانات (مثل الثدي والبروستاتا والقولون والمستقيم). حاليا، ومكافحة EpCAM المغلفة المغناطيسي حبة القائم على نظام التقاط CTC هو اختبار معيار الذهب المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لتعداد CTCs في مجرى الدم. ويستند هذا الاختبار على استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة مع علامات المضادة للEpCAM، والتي تستهدف على وجه التحديد الخلايا السرطانية الظهارية. وقد أوضحت العديد من الدراسات أن EpCAM ليست العلامة المثلى للكشف عن رابع كلوريد الكربون. في الواقع، CTCs هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا السرطانية وقادرة على الخضوع لانتقال الظهارية إلى mesenchymal (EMT) المرتبطة الانتشار النقيلي والغزو. هذه CTCs قادرة على الحد من التعبير عن سطح الخلية علامة الظهارية EpCAM، في حين زيادة علامات mesenchymal مثل vimentin. ولمعالجة هذه العقبة التقنية، تم تطوير أساليب عزل أخرى تستند إلى الخصائص الفيزيائية للمراكز. تتيح التقنيات الميكروفلويدية اتباع نهج خالٍ من الملصقات لإثراء رابع كلوريد الكربون من عينات الدم الكاملة. تستخدم التكنولوجيا المرنة الحلزونية قوى السحب بالقصور الذاتي ودين مع التدفق المستمر في القنوات المنحنية التي يتم إنشاؤها داخل رقاقة microfluidic حلزونية. يتم فصل الخلايا على أساس الاختلافات في الحجم واللدونة بين خلايا الدم الطبيعية والخلايا السرطانية. يفصّل هذا البروتوكول الخطوات المختلفة لتوصيف التعبير المبرمج لـ ctcs عن الـ CTCs، الذي يجمع بين جهاز سائل صغير حلزوني مع مجموعة علامات الفلورة المناعية القابلة للتخصيص (IF).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) دورًا حاسمًا في الاستجابة للسرطانات من خلال عملية تعرف باسم "المراقبة المناعية" للسرطان. يتم تعزيز وظائفها المضادة للورم من قبل الأجسام المضادة حاجز نقطة التفتيش المناعية مثل مثبطات CTLA-4 ومثبطات PD-1/PD-L1. في سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، العلاجات المضادة للPD-1/PD-L1 تؤدي إلى معدلات استجابة تتراوح بين 0٪ -17٪ في المرضى الذين يعانون من الأورام السلبية PD-L1 و 36٪ -100٪ في تلك التي تعبر PD-L1. تظهر الاستجابات القوية لحصار PD-1/PD-L1 الذي لوحظ في الورم الميلانيني وNSCLC من خلال الأدلة على تحسن معدل الاستجابة الإجمالي (RR)، والفوائد السريرية الدائمة، والبقاء على قيد الحياة الخالي من التقدم (PFS). حاليا، العلاجات المضادة للPD1 هي معيار الرعاية في الخط الثاني NSCLC العلاج مع nivolumab بغض النظر عن التعبير PD-L1 ومع pembrolizumab في المرضى الذين يعبرون PD-L1 ≥ 1٪. في علاج الخط الأول، ومعيار الرعاية هو pembrolizumab وحدها في المرضى الذين يعانون من NSCLC التعبير PD-L1 ≥ 50٪ ويمكن تعزيزها يحتمل أن تكون مع العلاج الكيميائي (platin ودواء دوبلت اعتمادا على النوع الفرعي الأنسجة)1،2.

ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج لإدارة المريض قابل للنقاش3، حيث أن تعبير PD-L1 في الخلايا السرطانية عن طريق الكيمياء المناعية (IHC) ربما ليس العلامة الحيوية المصاحبة الأكثر مثالية. أخرى مثل عبء طفرة الورم4 (TMB)، عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI)، و / أو ميكروبيوتا ربما تكون مثيرة للاهتمام في هذا الإعداد إما وحدها أو في تركيبة. ومن المعروف NSCLC أن تكون الأورام غير متجانسة، إما مكانيا (من موقع الورم إلى آخر واحد) أو زمنيا (من التشخيص إلى التكرار). المرضى الذين يعانون من NSCLC عادة ما تكون هشة، والخزعات الأنسجة الغازية المتكررة قد تكون مشكلة. في الواقع، يتراوح معدل إعادة خزعة في التقدم الأول من 46٪ -84٪ اعتمادا على سلسلة، وإعادة خزعة ناجحة (وهذا يعني مع التحليل النسيجي والجزيئي الكامل) يتراوح بين 33٪-75٪. وهذا يعني أن 25٪ -67٪ من المرضى لا يمكن الحصول على تحليل شامل لإعادة خزعة خلال التقدم الأول5،6،7،8.

وبالتالي فإن ظهور "الخزعات السائلة" قد ولّد حماساً كبيراً في هذا السياق الخاص، حيث أنه يمكّن من إعادة تقييم حاسمة للتغيرات الجزيئية أثناء تطور المرض من خلال فحص تعميم الحمض النووي الحر (cfDNA) المستمد من تعميم الخلايا السرطانية (CTCs). يتم تحرير هذه الخلايا الحية من الورم في مجرى الدم، حيث أنها تدور بحرية. على الرغم من عدم استخدامها بشكل روتيني، يبدو أن تحليل CTCs واعد للغاية في حالة التوصيف الجزيئي والفينوتي، والتكهن، والأهمية التنبؤية في سرطان الرئة (عنطريق DNAseq، RNAseq، ميرنا وتحليل البروتين). في الواقع، من المرجح أن تحتوي الـ CTCs على خصائص فينوتيبيك للمرض النشط بدلاً من العلامات الأولية (التي تم اكتشافها عند التشخيص). وعلاوة على ذلك، تتجاوز CTCs مشكلة عدم التجانس المكاني للأنسجة السرطانية، والتي قد تكون مشكلة حاسمة في الخزعات الصغيرة. وبالتالي، فإن تعبير PD-L1 على CTCs قد يلقي الضوء على الاختلافات المستمدة من استخدامه كعلامة بيولوجية تنبؤية باستخدام أنسجة الورم.

في الآونة الأخيرة، تم اختبار تعبير PD-L1 في CTCs من NSCLC. تقريبا جميع المرضى اختبار9 كانت PD-L1 إيجابية، مما يعقد تفسير النتيجة واستخدامها السريري. وبشكل عام، تم الكشف عن CTCs إيجابية PD-L1 في 69.4٪ من العينات من متوسط 4.5 خلايا / مل10. بعد بدء العلاج الإشعاعي، زادت نسبة CTCs إيجابية PD-L1 بشكل كبير، مما يشير إلى رفع تنظيم التعبير PD-L1 استجابة للإشعاع11. وبالتالي، يمكن استخدام تحليل CTCs PD-L1 لرصد التغيرات الديناميكية للورم والاستجابة المناعية، والتي قد تعكس الاستجابة للعلاج الكيميائي، والإشعاع، والعلاج المناعي المحتمل (IT).

وحتى الآن، تعتمد عزلة CTCs وتوصيف PD-L1 على أساليب مختلفة مثل التقاط أجهزة مكافحة الحصى المغناطيسية المغلفة بالخرز، والاختبار القائم على التخصيب، والاختبار القائم على الحجم12و13 من مركبات مكافحة الإرهاب. ومع ذلك، تم الكشف عن CTCs فقط في 45٪ -65٪ من المرضى الذين يعانون من NSCLC النقيلي، مما يحد من قدرتهم على توفير أي معلومات لأكثر من نصف المرضى NSCLC النقيلي. وبالإضافة إلى ذلك، كان عدد الـ CTC منخفضاً في معظم هذه الدراسات باستخدام النهج القائم على الحجم10. وعلاوة على ذلك، أدت هذه الطريقة إلى اختلافات مثل الكشف عن خلايا CD45 (-)/DAPI(+) مع "أنماط الأورام الخبيثة" في مجرى الدم من المتبرعين الأصحاء. وتبرز هذه الشواغل الحاجة إلى طريقة حساسة للغاية لجمع رابع كلوريد الكربون المرتبطة بالنمط الظاهري المناعي لخلايا CD45 (-) غير النمطية من الدم الكامل السليم باستخدام علامات حيوية إضافية للسرطان (أي TTF1، فيمنتين، EpCAM، وCD44) في NSCLC.

وبالتالي، قمنا بتقييم جهاز microfluidic دوامة يستخدم القصور الذاتي ودين سحب القوات لفصل الخلايا على أساس الحجم واللدونة من خلال رقاقة microfluidic. تشكيل تدفقات دوامة عميد موجودة في رقاقة microfluidic النتائج في CTCs أكبر تقع على طول الجدار الداخلي والخلايا المناعية أصغر على طول الجدار الخارجي للرقاقة. وتكتمل عملية التخصيب عن طريق سرقة الخلايا الأكبر حجما ً إلى منفذ التجميع كجزء من رابع كلوريد الكربون المخصب. هذه الطريقة حساسة ومحددة بشكل خاص (الكشف عن حوالي 1 CTC/مل من الدم كله)14 ويمكن أن تكون مرتبطة مع تحليلات الفلورة المناعية المخصصة (IF). وستمكن هذه الأدوات من وضع عتبة إيجابية للتفسير السريري. وهكذا يتم وصف سير العمل الذي يمكّن علماء الأحياء من عزل وخصائص CTCs ذات النمط المناعي المناعي بمعدل عال من الانتعاش والخصوصية. يصف البروتوكول الاستخدام الأمثل للجهاز الميكروفلويديك اللولبي لجمع CTCs، والاختبارات IF الأمثل التي يمكن تخصيصها وفقا لنوع السرطان، واستخدام البرمجيات الحرة مفتوحة المصدر لقياس وتحليل صور الخلايا لأداء شبه تلقائي حساب الخلايا وفقا لتلطيخ الفلورسنت. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنفيذ تعدد الإرسال المجهر اعتمادا على عدد من مرشحات الفلورسنت / علامات المتاحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد جُمعت العينات في المستقبل في إطار مجموعة "سيركان" (CIRCAN'CIRculating CANcer) المتمركزة في مستشفى جامعة ليون بعد موافقة خطية من المريض. تم دمج هذه الدراسة في مجموعة CIRCAN_ALL. تم الاعتراف بالدراسة CIRCAN_ALL على أنها غير تدخلية من قبل حزب الشعب الكمبودي جنوب شرق الرابع بتاريخ 04/11/2015 تحت المرجع L15-188. تم الاعتراف بنسخة معدلة على أنها غير تدخلية في 20/09/2016 تحت المرجع L16-160. تم الإعلان عن دراسة CIRCAN_ALL لمراسل تكنولوجيا المعلومات والحرية في دار الضيافة المدنية في ليون في 01/12/2015، تحت المرجع 15-131. تم جمع الدم عندما لاحظ الأطباء أقرب مؤشر على تطور الورم.

ملاحظة: استخدم جميع الكواشف والمواد الموضحة في جدول المواد مع شروط التخزين الخاصة بإعداد العينات قبل التحليلية واختبار الفلورة المناعية. استبدال الكواشف و /أو تعديل شروط التخزين يمكن أن يؤدي إلى أداء اختبار دون المستوى الأمثل.

1. إزالة التلوث من دوامة الجهاز microfluidic

ملاحظة: إزالة التلوث من الجهاز السوائل الدقيقة دوامة هو شرط لإزالة جميع الخلفية المناعية المتولدة من تلوث البكتيريا، واستكشاف النُشُم السَّمَّم ة الكتك، وتكون قادرة على تمييزها عن الخلايا المناعية الطبيعية. تم تحسين البروتوكول لعينات الدم التي تم جمعها في K2أنابيب EDTA في غضون 6 ساعة بعد أخذ عينات الدم وإثراء باستخدام الجهاز الميكروفلويديك دوامة في ظروف نظيفة. استخدام هذا الفحص لأنواع أخرى من العينات (السوائل البيولوجية الأخرى) قد تتطلب تحسين إضافية. وينبغي أن يتم هذا البروتوكول لإزالة التلوث مرة واحدة في الأسبوع.

  1. إعداد الكواشف
    1. إعداد المخزن المؤقت للتخفيف
      1. تعقيم 20 مل من الكاشف المضافة مخفف باستخدام فلتر حقنة 0.22 م وإضافة مباشرة إلى 1 لتر من 1Xالفوسفات العازلة المالحة (PBS) درجة فائقة نقية (جدول المواد).
    2. تعقيم الكواشف والقش المدخلات
      1. تعقيم المخزن المؤقت لـ RBC lysis والمخزن المؤقت لإعادة التعليق (RSB; جدول المواد) باستخدام فلتر حقنة 0.22 م ومخزون في أنبوب مخروطي بولي بروبلين 50 مل جديد لكل حل.
      2. تعقيم القش المدخلات عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة1 ساعة في كاشف التنظيف لجميع الأغراض (جدول المواد). نقل القش إلى عامل التنظيفالقائم على التبييض (جدول المواد) وحضانة في RT لمدة 1 ساعة.
      3. شطف القش المدخلات مرتين مع PBS معقمة لمدة ساعة واحدة لكل وتخزينالقش المدخلات معقمة في كيس معقمة جراحيا (جدول المواد).
  2. تطهير الجهاز الميكروفلويدسي اللولبي
    1. التطهير باستخدام كاشف التنظيف لجميع الأغراض
      1. افصل غطاء الزجاجة المخفف عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل ما يصل إلى 250مل من الكاشف التنظيف لجميع الأغراض (جدول المواد) في زجاجة فارغة جديدة.
      2. المسمار غطاء زجاجة مخفف والقش إلى زجاجة من 250 مل تنظيف الكاشف لجميع الأغراض تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. إرفاق هذه الزجاجة إلى ميناء مخفف من الجهاز microfluidic دوامة عن طريق الشد مرة أخرى المسمار البني.
      3. نقل ما يصل إلى 100 مل من التبييض (1٪ التركيز النهائي؛ جدول المواد) إلى حاوية النفايات الموردة في مجموعة تشغيل (الشكل1A).
      4. تحميل القش إدخال معقمة جديدة على الجهازmicrofluidic دوامة (جدول المواد) في منفذ الإدخال. قم بتحميل أنبوب طرد مركزي جديد بـ 50 مل في منفذ الإدخال. تحميل أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة في منفذ الإخراج.
      5. المضي قدما في رئيس الجهاز microfluidic دوامة عن طريق النقر على رئيس الوزراء على الجهاز microfluidic دوامة (3 دقائق). قم بإزالة أنبوب الإدخال بعد اكتمال القسط الرئيسي.
      6. نقل ما يصل إلى 15 مل من كاشف التنظيف لجميع الأغراض إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة مع ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية وإرفاق الأنبوب إلى منفذ الإدخال من الجهاز microfluidic دوامة.
      7. قبل بدء التشغيل، تحقق من أن الحل خال من الفقاعات المفرطة. إذا كانت الفقاعات موجودة، إزالتها عن طريق الطموح البطيء مع ماصة.
      8. تحميل رقاقة microfluidic إزالة التلوث في الجهاز microfluidic دوامة. تشغيل برنامج 3 على الجهاز الميكروفلويديك دوامة عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة).
        ملاحظة: البرنامج 3 من الجهاز الميكروفلويديك دوامة تمكن من الإثراء السريع للناقلات المقطعية في 31 دقيقة.
      9. استمر في خطوة تنظيف الجهاز الميكروفلويديك اللولبي باستخدام الحجم المتبقي من كاشف التنظيف لجميع الأغراض في أنبوب الإدخال.
      10. تجاهل أنبوب الإدخال بعد الانتهاء من خطوة التنظيف، تاركاً وراءه قش الإدخال.
    2. إزالة التلوث باستخدام عامل التنظيف القائم على التبييض
      1. افصل غطاء زجاجة الكاشف للتنظيف لجميع الأغراض عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل ما يصل إلى 250 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض (جدولالمواد)في زجاجة فارغة جديدة (الشكل1A).
      2. المسمار غطاء زجاجة الكاشف التنظيف لجميع الأغراض والقش إلى زجاجة تحتوي على عامل التنظيف القائم على التبييض تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. إرفاق هذه الزجاجة إلى ميناء مخفف من الجهاز microfluidic دوامة عن طريق الشد مرة أخرى المسمار البني.
      3. نقل ما يصل إلى 15 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض إلى أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة باستخدام ماصة المصلية تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية. تحميل 50 مل موقف إدخال أنبوب الطرد المركزي. قم بتحميل أنبوب فارغ في موضع الإخراج.
      4. قبل معالجة تشغيل، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
      5. تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة). بعد التشغيل، انتقل مباشرة إلى خطوة التنظيف باستخدام الحجم المتبقي من عامل التنظيف القائم على التبييض في أنبوب الإدخال.
      6. تجاهل أنابيب الإدخال والإخراج.
    3. شطف الجهاز الميكروفلويديك دوامة.
      1. افصل غطاء زجاجة عامل التنظيف القائم على التبييض عن منفذ مخفف الجهاز اللولبي microfluidic عن طريق فك المسمار البني. تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية، نقل القش من زجاجة تحتوي على عامل التنظيف القائم على التبييض إلى زجاجة جديدة تحتوي على العازلة مخفف. المسمار زجاجة إلى الجهاز microfluidic دوامة.
      2. نقل ما يصل إلى 15 ملمن المياه المعقمة (جدول المواد) إلى أنبوب جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي أنبوب الإدخال باستخدام ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية. تحميل 50 مل موقف إدخال أنبوب الطرد المركزي. قم بتحميل أنبوب فارغ في موضع الإخراج.
      3. قبل معالجة تشغيل، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
      4. تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة). بعد تشغيل، انتقل مباشرة إلى خطوة التنظيف باستخدام الحجم المتبقي من المياه المعقمة في أنبوب الإدخال.
      5. تجاهل أنابيب الإدخال والإخراج.

2. صيانة للحفاظ على دوامة Microfluidic جهاز خالية من البكتيريا

ملاحظة: يجب أن تتم الصيانة الروتينية في نهاية اليوم خلال خطوة التنظيف الأخيرة.

  1. نقل ما يصل إلى 7 مل من عامل التنظيف القائم على التبييض في أنبوب الطرد المركزي الجديد 50 مل باستخدام ماصة المصلية تحت خزانة السلامة الميكروبيولوجية. المسمار أنبوب التنظيف القائم على التبييض في ميناء الإدخال من الجهاز microfluidic دوامة.
  2. قبل معالجة تشغيل نظيفة، تحقق من أن عينة الإدخال خالية من فقاعات المفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات عن طريق aspirating لهم ببطء مع ماصة.
  3. تشغيل نظيفة على الجهاز microfluidic دوامة.

3. الإثراء قبل التحليلية من CTC من عينات دم المريض

  1. جمع 7.5 مل من الدم في أنبوب K2EDTA والحفاظ على تحت التحريض لطيف لتجنب ترسيب الخلايا وتخثر. عملية في غضون 6 ساعة.
    ملاحظة: إذا تم جمع الدم في أنبوب جمع الدم الحمض النووي خالية من الخلايا التي تحتوي على المواد الحافظة، وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى المعالجة. تأكد من أن عينة الدم المخزن المؤقت للتحليل RBC و المخزن المؤقت RBS في RT قبل المتابعة مع خطوة التخصيب.
  2. نقل ما يصل إلى 7.5 مل من الدم كله إلى أنبوب جديد 50 مل أنبوب الطرد المركزي أنبوب الإدخال باستخدام ماصة المصلية تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية.
  3. الطرد المركزي في 1600 × ز لمدة 10 دقائق في RT. جمع جزء البلازما مع ماصة دون إزعاج معطف برتقالي. استبدال كسر البلازما عن طريق إضافة حجم مكافئ مباشرة من PBS تصل إلى 7.5 مل.
  4. إضافة بلطف RBC lysisالعازلة (جدول المواد) إلى عينة الدم إلى حجم نهائي من 30 مل (لأنبوب K2EDTA) أو 37.5 مل (لأنبوب جمع الدم الحمض النووي خالية من الخلايا). يعكس بلطف أنبوب جمع الدم 10x وحضانة لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظة: عينة الدم يتحول أحمر أغمق أثناء تحليل RBC. إذا لم يتم ملاحظة أي تغيير (من الأحمر الداكن وغير شفاف) بعد 10 دقائق، عكس بلطف أنبوب 3X وترك للوقوف لمدة 5 دقائق أخرى كحد أقصى. لا تترك العينة في المخزن المؤقت تحليل RBC لأكثر من 15 دقيقة لأنه يمكن أن يعرض للخطر جودة العينة وأداء الفحص.
  5. طرد مركزي عينة الدم lysed في 500 × ز لمدة 10 دقيقة في RT، مع الفرامل الطرد المركزي على (أو أعلى سرعة التباطؤ). استخدم ماصة باستور أو ماصة مصلية لإزالة الـ supernatant برفق حتى يصل الحجم إلى علامة 4-5 مل. ثم، استخدم نصائح micropipette المصفاة لإزالة supernatant المتبقية.
  6. باستخدام P1000 micropipette مع طرف تصفيتها، إضافة 1.0 مل من RSB إلى جدار أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل. لتجنب إدخال فقاعات في المزيج، إعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا حتى عينة متجانسة.
  7. إضافة إضافية 3 مل من RSB إلى جدار أنبوب إدخال أنبوب الطرد المركزي 50 مل (إجمالي حجم 4 مل). تجنب إدخال فقاعات في المزيج. امزج تعليق الخلية برفق عن طريق الأنابيب برفق صعودا وهبوطا.
    ملاحظة: في حالة عدم القدرة على قطع كتل الخلايا (التي يتم تعريفها بكونها مرئية أو حجب طرف الماصة)، قم بتصفية العينة من خلال مصفاة خلية بمقدار 40 ميكرومتر لإزالة أي كتل. إضافة 150 درجة مئوية من RSB إلى العينة للتعويض عن فقدان مستوى الصوت من التصفية. لاحظ أن هذا الأسلوب هو أن تستخدم لماما وفقط عند ملاحظة كتل كبيرة.
  8. قبل الشروع في خطوة الإثراء، تحقق من أن العينة خالية من فقاعات مفرطة، وإذا وجدت موجودة، وإزالة فقاعات والحرص على عدم تجاهل أي عينة. إذا كانت فقاعات صغيرة موجودة، لا يلزم إزالتها.
  9. معالجة العينة على الجهاز الميكروفلويديك دوامة.

4. إثراء CTCs من الدم المريض كله مع الجهاز الميكروفلويديك دوامة

  1. تحميل رقاقة microfluidic دوامة جديدة. قم بتحميل أنبوبي طرد مركزي فارغين بمساحة 50 مل في منافذ الإدخال والإخراج.
  2. تشغيل رئيس الوزراء عن طريق النقر على رئيس على الجهاز microfluidic دوامة (3 دقيقة). قم بإزالة أنابيب الإدخال والإخراج واحمّل العينة التي سيتم معالجتها في منفذ الإدخال.
  3. تحميل أنبوب مخروطي واضح 15 مل في منفذ الإخراج لجمع CTCs المخصب. تشغيل البرنامج 3 عن طريق النقر على تشغيل واختيار البرنامج 3 (31 دقيقة).
  4. تفريغ أنبوب الإخراج والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 10 دقيقة (التسارع: 9؛ التباطؤ: 5). مع ماصة المصلية 5 مل، وإزالة توقف supernatant عند علامة 2 مل على أنبوب مخروطي 15 مل. مع micropipette، إزالة supernatant وقف في 100 علامة ميكرول على أنبوب مخروطي 15 مل. معالجة العينة المخصب مباشرة لتلطيخ الفلورة المناعية.

5. تلطيخ الفلورة المناعية

  1. تعداد على شريحة غرفة مع شبكة من نوع مقياس الهيموكيمتر عدد الخلايا لكل مل. تخفيف العينة المخصب مع 0.2٪ المضادةللربط الحل (جدول المواد) إلى تركيز يصل إلى 100،000 خلية / 100 درجة مئوية لكل سيتوسبين.
  2. ترطيب محيط غرفة العينة باستخدامالقطن (جدول المواد) مع 50 درجة مئوية من 0.2٪ الحل المضادة للربط. وضع بوليزين الزجاج الشريحة في غرفة عينة وإغلاق.
  3. معطف طرف مع 0.2٪ المضادة للربط الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 3X. إعادة تعليق العينة المخصب ونقل حل الخلية في غرفة العينة. الطرد المركزي معجهاز طرد مركزي مخصص (جدول المواد) في 400 دورة في الدقيقة لمدة 4 دقائق (تسارع منخفضة).
  4. وضع عازل السيليكون حول منطقة الترسيب. اسمحوا الجافة الزجاج الشريحة تحت مجلس الوزراء السلامة الميكروبيولوجية لمدة 2 دقيقة.
  5. إعداد حل التثبيت عن طريق تخفيف 1 مل من 16٪ بارافورماليدهايد (PFA) مع 3 مل من PBS المعقمة. إضافة 100 ميكرولتر من محلول التثبيت (4٪ PFA) لكل عينة وحضانة في RT لمدة 10 دقيقة.
    تحذير: استخدام PFA تحت مجلس الوزراء السلامة الكيميائية لمنع الاستنشاق.
  6. إعداد محلول التشبع عن طريق تخفيف المصل البقري الجنيني (FBS) في 5٪، مستقبلات Fc (FcR) حجب الكاشف في 5٪،وألبومالمصل البقري (BSA) في 1٪ في PBS معقمة (جدول المواد). إضافة 100 درجة مئوية من محلول التشبع لكل عينة وحضانة لمدة 30 دقيقة في RT. إزالة محلول التشبع.
  7. إضافة 100 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة لكل عينة (CD45 الأجسام المضادة 1/20; بانكالأجسام المضادة 1/500؛ PD-L1 الأجسام المضادة 1/200؛ Qsp التشبع الحل 100درجة مئوية) (جدول المواد). ضع شريحة بوليسين الزجاجية في طبق بيتري مقاس 100 مم × 15 مم. ترطيب ورقة ماصة مع 2 مل من الماء المعقم وإغلاق طبق بيتري مع الغطاء. ضعها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها وحمّلها من الضوء.
  8. إزالة مزيج الأجسام المضادة وتنفيذ 3 يغسل مع 200 درجة مئوية من PBS احتضان كل غسل لمدة 2 دقيقة. دع العينة تجف لمدة 5 دقائق ونحميها من الضوء. وضع 10 درجة مئويةمن حل تصاعد (جدول المواد) في مجال الترسيب وغطاء مع غطاء المجهر دون جعل فقاعة. ختم غطاء مع طلاء الأظافر.

6. الحصول على الصور المناعية مع المجهر الفلورسنت على التوالي والبرمجيات المرتبطة بها

  1. استخدام المجهر الفلورسنت على التوالي مع منصة X / Y الآلية. استخدم هدفًا 20 x لالتقاط صور TIFF RGB 8 بت في أربع قنوات تتوافق مع صبغ الحمض النووي (4'، 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI])، صبغ PanCK (الفلورسين إيزوثيوسيانات [FITC)،PD-L1 dye (CY3)، وصبغ CD45 (CY5). قم بتشغيل مصباح الزئبق قبل 15 دقيقة من الاستخدام، وتكيف المجهر والبرامج المرتبطة به مع التصوير شبه الآلي.
  2. ضع الشريحة الزجاجية على المنصة.
  3. في قائمة الاكتساب، حدد القنوات الأربع وحمّل وقت التعرض (DAPI: 15 مللي ثانية، FITC [PanCK]: 500 مللي ثانية؛ CY3 [PD-L1]: 800 مللي ثانية; CY5 [CD45]: 1,000 مللي ثانية). قم بتعريف التجانبات للمسح الضوئي. انقر فوق التجانبات. في التجربة المتقدمة، حدد المنطقة للمسح الضوئي.
  4. ضبط التركيز على الشاشة. انقر فوق بدء التجربة.
  5. تصدير ملفات TIF من كل قناة وتسمية ملف الصورة مع هذه المعلومات على وجه التحديد: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles.tif (على سبيل المثال، Sample1_TR1_c1m01). صبغ الاسم على النحو التالي: قناة DAPI هو c1، قناة FITC هو c2، قناة CY3 هو c3، وقناة CY5 هو c4.

7. تحليل الصور المناعية مع برنامج تحليل الصور

  1. تحميل وتثبيت برنامج تحليل الصور مجانا من موقع معهد واسع. قبول كافة الافتراضية أثناء التثبيت. افتح برنامج تحليل الصور وانقر فوق ملف | خط أنابيب من الملف | تحليل_4channels_CTC.cppipe.
    ملاحظة: يقوم خط الأنابيب بتحويل صور ألوان RGB إلى تدرج رمادي، ويزيل القطع الأثرية عن طريق تنعيم الصور باستخدام عامل تصفية متوسط، ويحدد النوى والسيتوبلازم، ويحدد كثافة الفلورة لكل قناة، ويصدرها إلى ملف excel.
  2. إفلات الملفات في قائمة الملفات. تحديث بيانات التعريف لتجميع الملفات حسب التجانبات.
    ملاحظة: يتم تحديد كافة الإرشادات لتجميع الصور في البرنامج. ظهرت ملفات الاسم في الوحدة النمطية NamesAndTypes ويتم تجميع الملفات وفقا لعدد البلاط والقناة لكل عينات.
  3. انقر فوق عرض إعدادات الإخراج وتحديد إخراج افتراضي صحيح. انقر فوق تحليل الصور. افتح ملف جدول البيانات المطابق لمعلمات measure_intensity.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان الشرط المسبق الأول هو الحصول على مجموعات غير ملوثة (خالية من العوامل المعدية) من مركبات الكربون الكلورية فلورية لزراعة الأنسجة وتجنب الخلفية IF ولدت. ومكّن بروتوكول إزالة التلوث من تنظيف جميع الأنابيب والمضخات، وأدى إلى جمع ناقلات الأمراض الكهربائية والكهربائية بمعدل استرداد جيد دون تلوث بكتيري. تمت مقارنة العينات المخصب دون ومع سير العمل بروتوكول إزالة التلوث من الجهاز microfluidic دوامة. للتحقق من صحة بروتوكول إزالة التلوث، تم استخدام خط الخلية A549 في غياب الدم كله وإثرى مباشرة باستخدام الجهاز الميكروفلويديك دوام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أثيرت نقطتان رئيسيتان في هذه الدراسة، الأولى فيما يتعلق بأداء سير العمل لنقله إلى التطبيقات السريرية، والثانية تتعلق بانخفاض الذاتية لتحليل صور الفلورة التي تم الحصول عليها.

تم تحديد سير عمل أداء ومحسن لتعداد CTC في البداية باستخدام فحص IF للتخصيص بعد إثراء الخلية عن طريق نظام microfluidic خالية من علامات CTC (جهاز ميكروفلويديك حلزوني). باستخدام سير العمل هذا، أكدت دراسة تجريبية أن جميع العينات من المرضى NSCLC النقيلي تحتوي على خلايا غير نمطية، والتي كانت جميع CD45 (-). ويمكن بدلا من ذلك أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جان فيليب أوريل وكاثرين ويكي لي هم من موظفي شركة Biolidics التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح بحثية من أسترازينيكا (لندن، المملكة المتحدة)، وشركة بوليديكس (سنغافورة)، ورابطة مكافحة السرطان (سون ولوار، فرنسا). ويشكر المؤلفان شركتي أسترازينيكا وبيوليليكس على دعمهما المالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4',6-diamidino-2-phé نيليندول (DAPI)OzymeBLE 422801شروط التخزين: +4 ° سي
بي دي فاكس كلين & 5 لترBD Biosciences340345عامل تنظيف قائم على المبيض. شروط التخزين: مبيض بدرجة حرارة
الغرفة 1٪ محلول تنظيف 100 ملBiolidicsCBB-F016012مبيض. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
ألبومين مصل البقر (BSA) 7.5٪SigmaA8412ظروف التخزين: +4 درجة ؛ C
CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة (استنساخ HI30) Alexa Fluor 647BioLegendBLE304020ظروف التخزين: +4 درجة ؛ برنامج C
CellProfilerبرنامج تحليل الصورالمعهد
جهاز الطرد المركزيHettich4706شروط التخزين:
أنبوب الطرد المركزي بدرجة حرارة الغرفة 50 ملCorning430-829شروط التخزين:
أنبوب الطرد المركزي بدرجة حرارة الغرفة 15 ملBiolidicsCBB-F001004-25ظروف التخزين: درجة حرارة
ClearCell FX-1 SystemBiolidicsCBB-F011002Spiral Microfluidic. شروط التخزين: عامل تنظيف كولتر كلينز بدرجة حرارة الغرفة
&ndash ؛ 5 لتربيكمان كولتر8448222كاشف تنظيف لجميع الأغراض. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
CTChip FR1SBiolidicsCBB-FR001002رقاقة Microfluidic. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
Cytospin 4ThermoFisherA78300003شروط التخزين: كاشف مضاف مخفف بدرجة حرارة الغرفة
&ndash ؛ 20 ملBiolidicsCBB-F016009شروط التخزين: +4 درجة ؛ C
EZ CytofunnelsThermoFisherA78710003غرفة عينة مع القطن. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
عامل حجب FCRMiltenyi Biotec130-059-901شروط التخزين: +4 درجة ؛ C
مصل عجل الجنين (FCS)Gibco10270-106شروط التخزين: +4 ° حل تركيب C
FluoromountSigmaF4680. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
Fungizone - 50 مجمكاشف مضاد للفطريات Bristol-Myers-Squibb90129TB29. شروط التخزين: +4 درجة ؛ قش
إدخال C FX1 مع غطاء قفلBiolidicsCBB-F013005Straw. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
KovaSlideDutscher50126شريحة غرفة. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
الجسم المضاد أحادي النسيلة PanCK (استنساخ AE1 / AE3) Alexa Fluor 488ThermoFisher53-9003-80شروط التخزين: +4 & deg ؛ C
Paraformaldehyde 16٪ThermoFisher11490570Fixation الحلول. شروط التخزين: +4 درجة ؛ C
PD-L1 الجسم المضاد أحادي النسيلة (استنساخ 29E2A3) - PhycoerythrinBioLegend BLE329706شروط التخزين: +4 & deg; C
Petri DishDutscher632180شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)OzymeBE17-512Fشروط التخزين: +4 & درجة ؛ C
Fossil Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x &ndash ؛ 1 L1st Base LaboratoryBUF-2040-1X1Lشروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
Pluronic F-68 10٪Gibco24040-032محلول مضاد للربط. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
شرائح البولي ليسينThermoFisherJ2800AMNZشروط التخزين: أنبوب
مخروطي من مادة البولي بروبلين بدرجة حرارة الغرفة 50 ملفالكون352098شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
RBC Lysis Buffer &ndash ؛ 100 ملG Biosciences786-649شروط التخزين: +4 درجة ؛ C
RBC Lysis Buffer – 250 ملG Biosciences786-650ظروف التخزين: +4 ° C
Resuspension Buffer (RSB)BiolidicsCBB-F016003ظروف التخزين: +4 درجة ؛ C
Shandon Cytopsin4 الطرد المركزيThermoFisherA78300003جهاز طرد مركزي مخصص. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
معزل السيليكونGrace bio-Labs664270شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
ماء معقم منزوع الأيونات &ndash ؛ 100 مل1st Base LaboratoryCUS-4100-100mlظروف التخزين: درجة حرارة الغرفة
مجهر الفلورسنت المستقيم Axio Imager D1Zeissشروط التخزين: درجة حرارة الغرفة
معقم جراحي BagSPS Laboratoires98ULT01240شروط التخزين: حقنة درجة حرارة
الغرفة BD Discardit II 20 مل معقمةBD Biosciences300296شروط التخزين:
فلتر حقنة درجة حرارة الغرفة 0.22 & micro ؛ م 33 مم معقمClearLine51732ظروف التخزين: درجة حرارة الغرفة
Zen lite 2.3 Lite SoftwareZeissMicroscope المرتبط بالبرنامج
برنامج الواسعالغرفةجهاز

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
  2. Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
  3. Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
  4. Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
  5. Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
  6. Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
  7. Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175(2017).
  8. Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
  9. Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726(2016).
  10. Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
  11. Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566(2019).
  12. Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
  13. Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
  14. Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
  15. Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
  16. Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23(2014).
  17. Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597(2014).
  18. Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409(2014).
  19. Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
  20. Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
  21. Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Circulating Tumor CellsPD L1 CharacterizationSpiral Microfluidic DeviceImmunofluorescence StainingCTC EnrichmentCytospin PreparationImage Analysis SoftwareFluorescent MicroscopyBlood Sample ProcessingEpithelial to Mesenchymal Transition

مقالات ذات صلة