وصف الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) هو موضوع شائع في البحوث المترجمة. يصف هذا البروتوكول فحصًا شبه تلقائي للفلورة المناعية (IF) لتوصيف PD-L1 وتعداد CTCs في عينات المرضى من سرطان الرئة غير الصغيرة (NSCLC).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
شبه التلقائي PD-L1 توصيف وتعداد الخلايا السرطانية المتداولة من غير الصغيرة خلية سرطان الرئة المرضى عن طريق الفلورة المناعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتم إلقاء الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) المستمدة من الورم الأساسي في مجرى الدم أو الجهاز اللمفاوي. هذه الخلايا النادرة (1-10 خلايا لكل مل من الدم) تبرر سوء التكهن وترتبط بالبقاء على قيد الحياة بشكل عام أقصر في العديد من السرطانات (مثل الثدي والبروستاتا والقولون والمستقيم). حاليا، ومكافحة EpCAM المغلفة المغناطيسي حبة القائم على نظام التقاط CTC هو اختبار معيار الذهب المعتمدة من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لتعداد CTCs في مجرى الدم. ويستند هذا الاختبار على استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة مع علامات المضادة للEpCAM، والتي تستهدف على وجه التحديد الخلايا السرطانية الظهارية. وقد أوضحت العديد من الدراسات أن EpCAM ليست العلامة المثلى للكشف عن رابع كلوريد الكربون. في الواقع، CTCs هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا السرطانية وقادرة على الخضوع لانتقال الظهارية إلى mesenchymal (EMT) المرتبطة الانتشار النقيلي والغزو. هذه CTCs قادرة على الحد من التعبير عن سطح الخلية علامة الظهارية EpCAM، في حين زيادة علامات mesenchymal مثل vimentin. ولمعالجة هذه العقبة التقنية، تم تطوير أساليب عزل أخرى تستند إلى الخصائص الفيزيائية للمراكز. تتيح التقنيات الميكروفلويدية اتباع نهج خالٍ من الملصقات لإثراء رابع كلوريد الكربون من عينات الدم الكاملة. تستخدم التكنولوجيا المرنة الحلزونية قوى السحب بالقصور الذاتي ودين مع التدفق المستمر في القنوات المنحنية التي يتم إنشاؤها داخل رقاقة microfluidic حلزونية. يتم فصل الخلايا على أساس الاختلافات في الحجم واللدونة بين خلايا الدم الطبيعية والخلايا السرطانية. يفصّل هذا البروتوكول الخطوات المختلفة لتوصيف التعبير المبرمج لـ ctcs عن الـ CTCs، الذي يجمع بين جهاز سائل صغير حلزوني مع مجموعة علامات الفلورة المناعية القابلة للتخصيص (IF).
المقدمة
تلعب الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) دورًا حاسمًا في الاستجابة للسرطانات من خلال عملية تعرف باسم "المراقبة المناعية" للسرطان. يتم تعزيز وظائفها المضادة للورم من قبل الأجسام المضادة حاجز نقطة التفتيش المناعية مثل مثبطات CTLA-4 ومثبطات PD-1/PD-L1. في سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة (NSCLC)، العلاجات المضادة للPD-1/PD-L1 تؤدي إلى معدلات استجابة تتراوح بين 0٪ -17٪ في المرضى الذين يعانون من الأورام السلبية PD-L1 و 36٪ -100٪ في تلك التي تعبر PD-L1. تظهر الاستجابات القوية لحصار PD-1/PD-L1 الذي لوحظ في الورم الميلانيني وNSCLC من خلال الأدلة على تحسن معدل الاستجابة الإجمالي (RR)، والفوائد السريرية الدائمة، والبقاء على قيد الحياة الخالي من التقدم (PFS). حاليا، العلاجا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد جُمعت العينات في المستقبل في إطار مجموعة "سيركان" (CIRCAN'CIRculating CANcer) المتمركزة في مستشفى جامعة ليون بعد موافقة خطية من المريض. تم دمج هذه الدراسة في مجموعة CIRCAN_ALL. تم الاعتراف بالدراسة CIRCAN_ALL على أنها غير تدخلية من قبل حزب الشعب الكمبودي جنوب شرق الرابع بتاريخ 04/11/2015 تحت المرجع L15-188. تم الاعتراف بنسخة معدلة على أنها غير تدخلية في 20/09/2016 تحت المرجع L16-160. تم الإعلان عن دراسة CIRCAN_ALL لمراسل تكنولوجيا المعلومات والحرية في دار الضيافة المدنية في ليون في 01/12/2015، تحت المرجع 15-131. تم جمع الدم عندما لاحظ الأطباء أقرب مؤشر على تطور الورم.
ملاحظة: استخدم جميع الكواشف والمواد الموضحة في
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وكان الشرط المسبق الأول هو الحصول على مجموعات غير ملوثة (خالية من العوامل المعدية) من مركبات الكربون الكلورية فلورية لزراعة الأنسجة وتجنب الخلفية IF ولدت. ومكّن بروتوكول إزالة التلوث من تنظيف جميع الأنابيب والمضخات، وأدى إلى جمع ناقلات الأمراض الكهربائية والكهربائية بمعدل استرداد جيد دون تلوث بكتيري. تمت مقارنة العينات المخصب دون ومع سير العمل بروتوكول إزالة التلوث من الجهاز microfluidic دوامة. للتحقق من صحة بروتوكول إزالة التلوث، تم استخدام خط الخلية A549 في غياب الدم كله وإثرى مباشرة باستخدام الجهاز الميكروفلويديك دوام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد أثيرت نقطتان رئيسيتان في هذه الدراسة، الأولى فيما يتعلق بأداء سير العمل لنقله إلى التطبيقات السريرية، والثانية تتعلق بانخفاض الذاتية لتحليل صور الفلورة التي تم الحصول عليها.
تم تحديد سير عمل أداء ومحسن لتعداد CTC في البداية باستخدام فحص IF للتخصيص بعد إثراء الخلية عن طريق نظام microfluidic خالية من علامات CTC (جهاز ميكروفلويديك حلزوني). باستخدام سير العمل هذا، أكدت دراسة تجريبية أن جميع العينات من المرضى NSCLC النقيلي تحتوي على خلايا غير نمطية، والتي كانت جميع CD45 (-). ويمكن بدلا من ذلك أ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
جان فيليب أوريل وكاثرين ويكي لي هم من موظفي شركة Biolidics التي تنتج الأدوات المستخدمة في هذه المقالة. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا العمل بمنح بحثية من أسترازينيكا (لندن، المملكة المتحدة)، وشركة بوليديكس (سنغافورة)، ورابطة مكافحة السرطان (سون ولوار، فرنسا). ويشكر المؤلفان شركتي أسترازينيكا وبيوليليكس على دعمهما المالي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-phé نيليندول (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | شروط التخزين: +4 ° سي |
| بي دي فاكس كلين & 5 لتر | BD Biosciences | 340345 | عامل تنظيف قائم على المبيض. شروط التخزين: مبيض بدرجة حرارة |
| الغرفة 1٪ محلول تنظيف 100 مل | Biolidics | CBB-F016012 | مبيض. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| ألبومين مصل البقر (BSA) 7.5٪ | Sigma | A8412 | ظروف التخزين: +4 درجة ؛ C |
| CD45 الجسم المضاد أحادي النسيلة (استنساخ HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | ظروف التخزين: +4 درجة ؛ برنامج C |
| CellProfiler | برنامج تحليل الصور | المعهد | |
| جهاز الطرد المركزي | Hettich | 4706 | شروط التخزين: |
| أنبوب الطرد المركزي بدرجة حرارة الغرفة 50 مل | Corning | 430-829 | شروط التخزين: |
| أنبوب الطرد المركزي بدرجة حرارة الغرفة 15 مل | Biolidics | CBB-F001004-25 | ظروف التخزين: درجة حرارة |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral Microfluidic. شروط التخزين: عامل تنظيف كولتر كلينز بدرجة حرارة الغرفة |
| &ndash ؛ 5 لتر | بيكمان كولتر | 8448222 | كاشف تنظيف لجميع الأغراض. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | رقاقة Microfluidic. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | شروط التخزين: كاشف مضاف مخفف بدرجة حرارة الغرفة |
| &ndash ؛ 20 مل | Biolidics | CBB-F016009 | شروط التخزين: +4 درجة ؛ C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | غرفة عينة مع القطن. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| عامل حجب FCR | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | شروط التخزين: +4 درجة ؛ C |
| مصل عجل الجنين (FCS) | Gibco | 10270-106 | شروط التخزين: +4 ° حل تركيب C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | . شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| Fungizone - 50 مجم | كاشف مضاد للفطريات Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | . شروط التخزين: +4 درجة ؛ قش |
| إدخال C FX1 مع غطاء قفل | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | شريحة غرفة. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| الجسم المضاد أحادي النسيلة PanCK (استنساخ AE1 / AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | شروط التخزين: +4 & deg ؛ C |
| Paraformaldehyde 16٪ | ThermoFisher | 11490570 | Fixation الحلول. شروط التخزين: +4 درجة ؛ C |
| PD-L1 الجسم المضاد أحادي النسيلة (استنساخ 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend BLE329706 | شروط التخزين: +4 & deg; C | |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | Ozyme | BE17-512F | شروط التخزين: +4 & درجة ؛ C |
| Fossil Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x &ndash ؛ 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| Pluronic F-68 10٪ | Gibco | 24040-032 | محلول مضاد للربط. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| شرائح البولي ليسين | ThermoFisher | J2800AMNZ | شروط التخزين: أنبوب |
| مخروطي من مادة البولي بروبلين بدرجة حرارة الغرفة 50 مل | فالكون | 352098 | شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| RBC Lysis Buffer &ndash ؛ 100 مل | G Biosciences | 786-649 | شروط التخزين: +4 درجة ؛ C |
| RBC Lysis Buffer – 250 مل | G Biosciences | 786-650 | ظروف التخزين: +4 ° C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | ظروف التخزين: +4 درجة ؛ C |
| Shandon Cytopsin4 الطرد المركزي | ThermoFisher | A78300003 | جهاز طرد مركزي مخصص. شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| معزل السيليكون | Grace bio-Labs | 664270 | شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| ماء معقم منزوع الأيونات &ndash ؛ 100 مل | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | ظروف التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| مجهر الفلورسنت المستقيم Axio Imager D1 | Zeiss | شروط التخزين: درجة حرارة الغرفة | |
| معقم جراحي Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | شروط التخزين: حقنة درجة حرارة |
| الغرفة BD Discardit II 20 مل معقمة | BD Biosciences | 300296 | شروط التخزين: |
| فلتر حقنة درجة حرارة الغرفة 0.22 & micro ؛ م 33 مم معقم | ClearLine | 51732 | ظروف التخزين: درجة حرارة الغرفة |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope المرتبط بالبرنامج |
المراجع
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
