إعداد وتوصيف Nanoliposomes لفخ البروتينات الكروية المائية النشطة بيولوجيا

ملخص

تصف هذه الدراسة الترطيب الكلاسيكي باستخدام طريقة فيلم الدهون الرقيقة لإعداد nanoliposome متبوعاً بتوصيف الجسيمات النانوية. يتم تغليف بروتين 47 كيلودا-هيدروفيليك وكروي، تارين، بنجاح كاستراتيجية لتحسين الاستقرار، وتجنب التطهير السريع، وتعزيز الإفراج الخاضع للرقابة. ويمكن تكييف هذه الطريقة مع تغليف الجزيئات الكارهة للماء.

الملخص

وقد تم تطبيق كبسولات نانوية Liposome لأغراض عديدة في الصناعات الصيدلانية ومستحضرات التجميل والصناعات الغذائية. وتشمل سمات liposomes توافقها البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، وعدم السمية، والقدرة على فخ كل من المركبات المائية والكارهة للماء. يتم تطبيق الترطيب الكلاسيكي للأغشية الدهنية رقيقة في المذيبات العضوية هنا كتقنية لتغليف التارين، اللكتين النبات، في nanoliposomes. يتم وصف حجم Nanoliposome، والاستقرار، وكفاءة الفخ، والتوصيف المورفولوجي بالتفصيل. يتم إعداد nanoliposomes باستخدام 1,2-ديوليل-سن-الجلسرين-3-فوسفوتيلونامين (DOPE)، 1،2-ديستيويل-سن-غليسيرو-3-فوسفويلولامين-N-[أمينو(البولي ايثيلين غليكول)-2000] (ملح الأمونيوم. DSPE-MPEG 2000)، وcholesterylhemisuccinate (CHEMS) كمكونات رئيسية. يتم حل الدهون لأول مرة في الكلوروفورم للحصول على فيلم الدهون رقيقة التي يتم إعادة ترطيبها في وقت لاحق في محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على البروتين أن تكون محاصرة وحضانة بين عشية وضحاها. ثم، يتم تطبيق تقنيات sonication والنتوء لتوليد الحويصلات unilamellar نانوية الحجم. يتم تحديد حجم ومؤشر التشتت المتعدد للnanovesicles عن طريق تشتت الضوء الديناميكي، في حين يتم تقييم مورفولوجيا النانوفيكل عن طريق المسح المجهري الإلكتروني. يتم تحديد كفاءة الفخ من خلال نسبة كمية البروتين غير المغلف إلى الكمية الأصلية من البروتين المحملة في البداية. يتم الحصول على liposomes متجانسة مع متوسط حجم 155 نانومتر وقيمة مؤشر تعدد التشتت من 0.168. يتم تحقيق كفاءة عالية في الفخ من 83٪.

المقدمة

وقد ارتفع في السنوات الأخيرة عدد الدراسات التي تحقق في كفاءة نظم إيصال المخدرات. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تجاوز قيود مثل التطهير السريع، وسوء التوزيع البيولوجي، والذوبان في درجة الحموضة الفسيولوجية وعدم كفاية الكمية الخلوية. وقد برز استخدام النظم النانوية مع التقدم المحرز مؤخرا في علاج السرطان، المطبق لزيادة التركيز داخل الخلايا من الأدوية داخل الخلايا السرطانية مع تقليل السمية في الخلايا السليمة. وعلاوة على ذلك، يجري حالياً تطبيق الجسيمات النانوية التي يتم الحصول عليها من مجموعة مختلفة من المواد (أي البوليمرات، والدندريمرات، والدهون، والفيروسات، والأنابيب النانوية الكربونية، والمعادن مثل أكسيد الحديد والذهب) لتعزيز آثار مكافحة السرطان والحد من النظم سمية^1. وقد تم تطبيق كبسولات نانوية Liposome على وجه الخصوص لأغراض عديدة في الصناعات الصيدلانية ومستحضرات التجميل والصناعات الغذائية. في السنوات الأخيرة ، تم صياغة مختلف المنتجات المغذيات مثل الفيتامينات والانزيمات والمستخلصات العشبية باستخدام تكنولوجيا liposome².

Liposomes هي حويصلات كروية تتكون من واحد أو أكثر من ثنائيات الدهون متحدة المركز التي شكلت تلقائيا من خلال تشتت الدهون الفوسفاتية في وسائل الإعلام المائية^3،4. وتقع الرؤوس القطبية للفوسفوليبيدات على الأسطح الخارجية والداخلية للأغشية، في اتصال مع البيئة المائية. وعلى النقيض من ذلك، تشكل سلاسل الأحماض الدهنية النواة الكارهة للماء من الأغشية ومحمية من الماء^5. بعض الصفات من liposomes التي تجعلها نظم تسليم المخدرات جذابة وتشمل التوافق البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، وعدم السمية، والقدرة على فخ كل من المركبات المائية والكارهة للماء⁶.

يمكن إعداد Liposomes باستخدام خطوات عمليات مختلفة مثل التحريض، سونيكيشن، البثق، التحلل، التجميد، والذوبان. وتشمل الطرق الكلاسيكية التبخر في المرحلة العكسية، وحقن المذيبات، وغسيل الكلى المنظفات. الطريقة الأكثر تطبيقًا هي ترطيب الدهون الرقيقة، والمعروفة أيضًا باسم طريقة Bangham، والتي تستخدم للحصول على أشكال الدهون الحويصلية^7و8و9^و10و11. Lamellarity (عدد ثنائيات الدهون الفوسفاتية) وحجم الجسيمات هي المعلمات الكلاسيكية المستخدمة لوصف liposomes إما 1) حويصلات unilamellar (ULVs)، التي شكلتها ثنائية الدهون الفوسفاتية فريدة من نوعها ومتفاوتة في الحجم على النحو التالي: '1) unilamellar الصغيرة الحويصلات (سيارات الدفع الرباعي، ~ 0.02-0.20 ميكرومتر)، 2) حويصلات unilamellar كبيرة (LUVs، ~ 0.2-1.0 ميكرومتر)، و 3) الحويصلات يونيلاميلار العملاقة (GUVs، > 1 ميكرومتر)؛ أو 2) الحويصلات multilamellar (MLVs، >0.1 م) 3،^12. حجم الحويصلة هو معلمة هامة عند النظر في الاستخدام العلاجي، كما هو الحال في علاج السرطان، حيث أحجام <200 نانومتر مثالية للسماحnanovesicles لعبور الحاجز البطانية والوصول إلى الأنسجة الورمية 4.

هنا، تم وصف إجراء التغليف بعد الترطيب الكلاسيكي لتقنية فيلم الدهون رقيقة⁷ باستخدام التارين، وهو نبات اللكتين يتميز بالبروتين الكروي المائي^13،14،15 . يتم إنتاج الحويصلات نانوية الحجم من خلال بما في ذلك خطوات sonication والنتوء في التقنية الرئيسية، مما أدى إلى nanovesicless s liposomal مستقرة مع كفاءة عالية الفخ^16.

البروتوكول

1- إعداد كبسولات النانو الليبوسومال من التارين¹⁶

ملاحظة: ينبغي إعداد جميع الاستعدادات في ثلاثة أضعاف من أجل الحصول على حجم أكبر (7 مل) وتمكين العينة من الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي فائق (انظر التفاصيل أدناه).

1. وزن المكونات الدهنية باستخدام توازن تحليلي، كما هو موضح في الجدول 1.
2. إذابة مكونات الدهون في الكلوروفورم باستخدام قارورة حجمية 250 مل التي تناسبها في المبخر الدوارلتجنب فقدان المواد.
3. يُحرّك المزيج بسرعة 150 لفة في الدقيقة لمدّة 15 دقيقة.
4. إزالة الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوارة في الحالات التالية:
   1. ضبط الفم قارورة الحجم إلى الوضع القياسي (25 درجة) لتحقيق الكفاءة المثلى، في حين في اتصال مع الماء من حمام التدفئة.
      ملاحظة: يجب أن يميل ذراع المعدات عند 25 درجة للحفاظ على الاتصال بين قارورة الحجم وحمام الماء، مع عدم التأثير على كفاءة التبخر أو إتلاف العينة. يمكن أن يختلف الموقف القياسي وفقا للعلامة التجارية المعدات.
   2. تعيين درجة حرارة المكثف إلى الحد الأدنى من 3 درجة مئوية.
   3. تعيين درجة حرارة حمام التدفئة إلى 40 ± 1 درجة مئوية.
   4. تعيين دوران إلى 120 دورة في الدقيقة.
   5. ضبط الفراغ إلى 207 مبار ونقطة الغليان إلى 20 درجة مئوية.
   6. بعد 25 دقيقة، قم بإزالة القارورة وتجاهل المذيب المتبخر، والمتبقية في المكثف، بشكل مناسب.
      ملاحظة: يتم تشكيل فيلم رقيقة وغير شفافة، تتكون من مكونات liposome، في هذه الخطوة ويمكن تصورها بسهولة. ويجب تخزين المذيب المتبخر المتبقي في المكثف في متلقي التخلص (المكلور) لكي تتولى من قبل شركة متخصصة التخلص المناسب.
5. ترطيب فيلم الدهون للوصول إلى تركيز الدهون 0.01 M في 0.3 M محلول كبريتات الأمونيوم (الحموضة = 7.4) التي تحتوي على التارين في 1 ملغ / مل لتر إلى حجم نهائي من 10 مل.
   1. يُحرّك المزيج لمدّة 40 دقيقة ويُحضن بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن اعتبار هذه الخطوة نقطة توقف. الحضانة بين عشية وضحاها ليست إلزامية.
6. بعد الحضانة، sonicate التعليق لمدة 1 دقيقة عند 25 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة. RT) للحد من حجم الحويصلة وتجنب التجميع.
   ملاحظة: تم إجراء تخفيض الحجم في sonicator بالموجات فوق الصوتية في الحالات التالية: 130 W و 40 كيلو هرتز.
7. قم بإجراء قذف من 12 دورة من خلال غشاء مسام بولي كربونات بـ 0.2 م.
   ملاحظة: قبل عملية البثق، اختبار الجمعية مصغرة الطارد باستخدام الماء لتجنب تسرب العينة. غشاء المسام 0.1 ميكرومتر هو أيضا مناسبة. في هذه الحالة، قبل تسخين حامل الطارد مصغرة فوق درجة حرارة انتقال الدهون لتسهيل البثق، مع الحفاظ على الخصائص الفيزيائية الكيميائية لكل من الدهون والبروتينات.
   1. تناسب أجزاء من الطارد مصغرة، كما هو موضح في دليل الشركة المصنعة.
   2. وضع غشاء البولي بين اثنين من الفلتر قبل الرطب يدعم ووضعها في حامل.
   3. إدراج حقنة فارغة 1 مل في الجهاز، وملء حقنة أخرى إلى حجمها الكلي مع تعليق liposomal، وإدراجه على الجانب الآخر.
   4. قم بإجراء قذف من 12 دورة من خلال غشاء مسام بولي كربونات بـ 0.2 م. دفع العينة من حقنة واحدة إلى أخرى، ببطء. جمع تعليق مقذوف في أنبوب تبريدها مسبقا.
      ملاحظة: يجب استبدال غشاء البولي فقط عندما يصبح من الصعب نقل العينة من حقنة إلى أخرى. يجب أن يصبح التعليق الشحمي واضحًا أثناء عملية البثق نتيجة لتخفيض الحجم بسبب تشكيل سيارات الدفع الرباعي. يمكن فقدان حوالي 0.2 مل من العينة أثناء هذه الخطوة.
8. يُفصل اللطوائب عن طريق التبذير.
   ملاحظة: الحفاظ على العينات في حمام الجليد حتى ultracentrifuge على استعداد لاستخدامها. فصل سيارات الدفع الرباعي من المكونات المتبقية وكبريتات الأمونيوم عن طريق ultracentrifugation باستخدام جهاز طرد مركزي فائق مع دوار الأرجوحة دلو (انظر التفاصيل أدناه).
   1. وزن العينة في أنبوب التيتانيوم الذي يناسب الدوار والتوازن بين الأنابيب. تحقق من الحد الأدنى من حجم المطلوبة وفقا للدوار المستخدمة لتجنب إتلاف الأنابيب، وضبط حجم تعليق liposomal مع كبريتات الأمونيوم، إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يجب دائماً دعم دلو التأرجح على المنصة عندما يكون خارج جهاز الطرد المركزي لتجنب خدش "خطوط حمار وحشي" (أي الخطوط السوداء والبيضاء في الأسفل)، والتي تستخدمها هيئة الطرد المركزي لتحديد سرعة الدوران.
   2. قم بتشغيل الفراغ قبل استخدام الطرد المركزي للسماح له بالتبريد.
   3. تناسب أنابيب التيتانيوم في دلو سوينغ.
      ملاحظة: رفع الأنابيب إلى الموضع الذي يفترضه عند تشغيل للتأكد من أنها مجهزة تماما.
   4. الافراج عن فراغ، وفتح باب الطرد المركزي، ووضع الدوار في الداخل.
      ملاحظة: انتبه إلى علامة الدائرة في الجزء السفلي من الدوار، والتي يجب أن تناسب في الاتجاه المعاكس لنفس علامة الدائرة في جهاز الطرد المركزي نفسه.
   5. أغلق باب الطرد المركزي، اضغط على فراغ وانتظر حتى يصل الفراغ من 200 إلى <20 ميكرون أو من 26 باسكال إلى <3 باسكال.
   6. ضبط المعلمات في عرض فائقة الطرد المركزي إلى 150،000 × ز (ما يعادل 29،600 دورة في الدقيقة لدلو سوينغ المذكورة أعلاه) لمدة 90 دقيقة في 4 درجة مئوية (التسارع: الحد الأقصى، التباطؤ: الحد الأقصى).
      ملاحظة: دائماً تحويل السرعة إلى س ز إذا تم تعيين الطرد المركزي معينة في دورة في الدقيقة. استخدام موقع الطرد المركزي لتحويل وحدة وفقا للدوار المستخدمة.
   7. اضغط على استدعاء، تحقق من الشروط، واضغط على ابدأ في التشغيل.
      ملاحظة: انتظر حتى يصل الطرد المركزي إلى السرعة المطلوبة.
   8. بعد 90 دقيقة، والإفراج عن الفراغ عن طريق الضغط على زر فراغ وفتح باب الطرد المركزي عندما يصل الفراغ 200-700 ميكرون (ما يعادل 26-93 باسكال).
   9. إيقاف تشغيل الطرد المركزي، وإزالة الدوار من الداخل، وتركها على مقاعد البدلاء مع الدلاء لتجف.
   10. الحفاظ على عينات فائقة الطرد المركزي على الجليد.
9. بعناية، supernatant منفصلة عن بيليه عن طريق تحويل الأنبوب رأسا على عقب إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل المتاح لفصل supernatant وبيليه.
   ملاحظة: قم بتخزين الـ supernatant الذي يحتوي على البروتين غير المغلف عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. وسوف تستخدم لتحديد كفاءة التغليف. بيليه يظهر كهلام شفافة.
10. تعليق بيليه التي تحتوي على البروتين مغلفة في HEPES المخزنة المالحة المخزنة (3 مل من 1X HBS).
    ملاحظة: يتم إعداد HBS 2X (حل الأسهم) عن طريق تخفيف الكميات التالية من الكواشف في الماء المقطر: 140 مل NaCl، 1.5 مليون متر Na₂HPO_4،50 MM HEPES، ثم ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 والحجم النهائي إلى 100 مل. Na₂HPO₄ يمكن استبداله بـ NaHCO₃أو حذف لتجنب التداخل إذا كان التركيز الشحمية هو الذي سيتم تحديده. يجب تخفيف محلول مخزون HBS 2x في الماء المقطر للحصول على HBS 1x قبل الاستخدام.

2. كفاءة التغليف

ملاحظة: تحديد كفاءة التغليف باستخدام بروتوكول بيترسون¹⁷من أجل تجنب تداخل الدهون في تحديد كمية البروتين. وينبغي تحليل جميع العينات (معايير BSA وsupernatant liposome) في ثلاثة أضعاف. أيضا إعداد أنبوب فارغ.

1. إعداد الكواشف الأسهم وحلول العمل¹⁷
   1. لمكواش الأسهم، وإعداد النحاس وطرطرات كربونات (CTC) عن طريق خلط 10 مل من كربونات الصوديوم 20٪، 200 ميكرولتر من كبريتات النحاس 0.1٪، 200 ميكرولتر من 0.2٪ طرطرة البوتاسيوم مع 9.6 مل من الماء المقطر. إعداد 100 مل من كبريتات دودسيل الصوديوم 10٪ (SDS) و 0.8 N هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم NaOH).
   2. لحلول العمل، وإعداد 10 مل من 0.15٪ ديوكسيشولات الصوديوم (DOC) و 72٪ حمض ثلاثي كلورو الخليك (TCA). حل 10 ملغ من الزلال المصل البقري (BSA) في 10 مل من الماء المقطر للحصول على 1 ملغ / مل الحل القياسي. إعداد الكاشف A عن طريق إضافة أجزاء متساوية من CTC، هيدروكسيد الصوديوم، SDS، و H₂O. إعداد الكاشف B عن طريق تخفيف الكاشف الفينول Folin-Ciocalteu 1:5 في الماء المقطر.
      ملاحظة: الكاشف A يتطلب 1 مل لكل أنبوب رد فعل، بينما يتطلب الكاشف B 0.5 مل. لتحديد الأحجام النهائية للكواشف A و B، قم أولاً بتحديد عدد أنابيب التفاعل التي سيتم استخدامها، مع الأخذ في الاعتبار ثلاثة تركيزات متميزة من BSA، فارغة، وعينات في ثلاثة أضعاف. يجب أن يكون الكاشف A متجانسًا بشكل جيد قبل الاستخدام ويمكن تخزينه عند 25 درجة مئوية (RT) لمدة أسبوعين. الكاشف B هو أيضا مستقرة في 25 درجة مئوية (RT) إذا تم تخزينها في زجاجة العنبر.
2. هطول الامطار
   ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة في أنابيب الطرد المركزي الصغير.
   1. تمييع supernatant liposome بالماء إلى حجم نهائي من 1 مل تحتوي على 5-100 ميكروغرام من البروتين.
      ملاحظة: يجب ملء أنبوب فارغ مع 1 مل من الماء المقطر.
   2. إضافة 0.1 مل من 0.15٪ DOC، والتجانس عن طريق الدوامة، وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
   3. إضافة 0.1 مل من 72٪ TCA، مزيج جيدا، والطرد المركزي في 3000 × ز وRT لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: DOC-TCA يعزز هطول الأمطار البروتين، وتشكيل مرحلتين متميزة. يمكن استرداد البروتين المستهدف عن طريق الطرد المركزي، وتجنب تداخل الدهون.
   4. تجاهل بعناية supernatant عن طريق رفع الأنبوب إلى أسفل ووضعها على ورقة ماصة. حفظ بيليه للخطوة اللاحقة.
      ملاحظة: بيليه يمكن أن يكون من الصعب جدا أن نرى، ولكن يجب أن تتحول الأنبوب رأسا على عقب حتى لو لم يكن مرئيا.
3. قياس الطيف الضوئي
   1. تعليق بيليه التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.2.4 في 1 مل من الماء المقطر. مزيج جيدا للتأكد من أن يتم حل بيليه ونقل العينة إلى أنبوب اختبار جديد.
   2. إعداد تخفيفات الزلال (BSA) المعايير إلى حجم نهائي من 1 مل.
      ملاحظة: يجب إعداد معايير البروتين بين 5-100 درجة مئوية/مل.
   3. إضافة 1 مل من الكاشف A إلى الأنابيب من الخطوة 2.3.1 و 2.3.2 دون استثناء، مزيج جيدا، وحضانة لمدة 10 دقيقة في RT.
      ملاحظة: SDS يمكن تخفيف التدخلات الدهون المحتملة مع المساعدة في الذوبان البروتين.
   4. إضافة 0.5 مل من الكاشف B إلى الأنابيب من الخطوة 2.3.1 و 2.3.2، مزيج جيدا، وحضانة لمدة 30 دقيقة في RT في حين محمية من الضوء.
      ملاحظة: كاشف الفينول فولين-Ciocalteu هو خليط من فوسفمولبيدات وفوسفوتونغستات المستخدمة في الاختبارات اللونية لبعض المركبات التي تحتوي على النيتروجين، مثل البروتينات. تعقيد النحاس يزيد من تفاعل الفينولات نحو هذا الكاشف، مما يؤدي إلى مجمع أزرق / أرجواني وفقا لتركيز البروتين.
   5. تحديد الامتصاص في 750 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   6. حساب تركيز البروتين في supernatant على أساس منحنى القياسية على النحو التالي.
      1. قيمة امتصاص المؤامرة (عبس) مقابل تركيز BSA (ملغ / مل) للحصول على معامل الزاوي (ك) النظر في خط الميل الخطي.
      2. تحديد تركيز البروتين الفائق(C) بنسبة بين قيمة الامتصاص ومعامل الزاوي (ك)، ثم اضرب بالحجم الإجمالي على النحو التالي:
         
4. تحديد كفاءة التغليف وفقا للصيغة التالية:
   
5. حيث البروتين المحمل = 10 ملغ، البروتين غير المغلف = قيمة C التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.6.2.
   ملاحظة: في هذه الحالة، يتم استخدام ما مجموعه 10 ملغ التارين المذاب في محلول كبريتات الأمونيوم (1 ملغ / مل) لإجراء عملية التغليف، لأن هذا التركيز يكفي للحصول على آثار مرضية في المختبر^{13،16، 18}.

3. حجم وتحديد الاستقرار

ملاحظة: يتم تقييم توزيع الحجم ومؤشر التشتت poliDispersity (PdI) من الاستعدادات liposomal بواسطة تشتت الضوء الديناميكي (DLS). يشير PdI بالقرب من 0.1 إلى إعداد متجانس. لتحديد الاستقرار، تخزين liposomes في 4 درجة مئوية والتحقق من حجم التوزيع ومتوسط الحجم بانتظام.

1. قم بتشغيل معدات DLS قبل 30 دقيقة من الاستخدام لتسخين مصباح الليزر.
2. نقل إعداد liposomal التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.10 إلى cuvette التحجيم المتاح.
3. تعيين معلمات المعدات على النحو التالي: نوع المشتت = الماء (RI = 1.33)؛ المادة = الدهون (RI = 1.45)؛ وRT.
4. اضغط على ابدأ وانتظر بينما تنتهي المعدات من قراءتها.
5. إزالة cuvette وإيقاف المعدات.
   ملاحظة: إما نقل العينة من cuvette مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل المتاح للتحليلات اللاحقة، أو التخلص منها إذا كان هناك كمية كافية لقراءة جديدة.

4- التوصيف المورفولوجي

ملاحظة: يتم تنفيذ توصيف Liposome وفقا لمورتي ورامارامي¹⁹. يتم إعداد العينات التي تحتوي على nanoliposomes التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.10 في ثلاثة أضعاف.

1. إصلاح الأغطية الزجاجية (قطرها 13 ملم) في الجزء السفلي من طبق بيتري مع شريط على الوجهين. قطع الشريط إلى قطع صغيرة (الحجم المناسب لإصلاح الأغطية)، وإزالة ورقة واقية تحت، وإصلاحه على الجزء السفلي من طبق بيتري. مع مساعدة من ملاقط، وإزالة ورقة واقية على رأس الشريط وإصلاح الأغطية على ذلك.
   ملاحظة: كن حذراً في الخطوات التالية عدم تحرير الأغطية واستخدام شريط قوي.
2. قم بتغليف الأغطية بالبولي L-يسين. ضع أوراق الفلتر الرطب داخل طبق بيتري للحفاظ على الرطوبة والحضانة لمدة ساعة واحدة في RT (25 درجة مئوية).
3. بعد الطلاء، شطف الأغطية بالماء المقطر.
4. ملء الأغطية مع قطرة من العينة من الخطوة 1.10 والسماح لهم لتجف لمدة 1 ساعة في RT.
5. لإصلاح العينات، وتغطي لهم مع 4٪ الجلوتالارهايد أعدت في 0.1 M الفوسفات العازلة، والحموضة = 7.2. ضع أوراق الفلتر الرطب داخل طبق بيتري واختم الطبق للحفاظ على مستويات الرطوبة. حضانة في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
6. شطف الأغطية 3X لمدة 5 دقائق مع نفس المخزن المؤقت الفوسفات.
7. عينات الجفاف على النحو التالي: 35٪ الإيثانول 1X لمدة 15 دقيقة، 50٪ الإيثانول 1X لمدة 15 دقيقة، 75٪ الإيثانول 1X لمدة 15 دقيقة، 95٪ الإيثانول 2X لمدة 15 دقيقة، والإيثانول المطلق 3X لمدة 20 دقيقة.
8. تجفيف العينات كيميائياً عن طريق الغمر 2x في 1-2 مل من سداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS) لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: يجب التلاعب HMDS بعناية داخل غطاء محرك الدخان. وينبغي أن يسمح للعينات لتجف بين عشية وضحاها داخل المجفف أو داخل غطاء الدخان في RT.
9. جبل العينات المجففة على كعب مع شريط لاصق الكربون موصل.
10. تبصق سطح غطاء في فراغ مع طبقة موصلة كهربائيا (20 نانومتر سمك) من الذهب البلاديوم.
11. تسجيل الصور باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) في وضع فراغ منخفض والجهد المنخفض (20 كيلو فولت).

النتائج

الشكل 1 يصف إعداد nanoliposome^16،20،21. فوسفوليبيدات، 1،2-ديوليل-سن-غليسيرول-3-فوسفوإيثانولامين (DOPE)، 1،2-ديستيويل-سن-غليسيرو-3-فوسفويلولامين-ن-[أمينو(البولي ايثيلين غليكول)-2000] (ملح الأمونيوم؛ DSPE-MPEG 2000)، وcholesterylhemisuccinate (CHEMS)، والمكونات الرئيسية liposome، تم حلها لأول مرة في الكلوروفورم للحصول على فيلم الدهون. ثم تم إعادة ترطيب فيلم الدهون في محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على البروتين المائي (تارين) لتكون محاصرين، ويتم الحضانة بين عشية وضحاها. ثم، تم تطبيق تقنيات sonication والنتوء لتوليد الحويصلات unilamellar الصغيرة. وفصلت خطوة التثرجوة عن إعداد الدهون الدهنية عن الدهون الحرة والبروتين غير المغلف، في حين تم استخدام supernatant لتحديد كفاءة الفخ.

وقد أظهرت النانوليبوسومات المنتجة باستخدام المنهجية المذكورة أعلاه توزيعاً بحجم يتراوح بين51 و396 نانومتر ومتوسط حجم قدره 155 نانومتر (الجدول 2). كان التحضير متجانسة, بما أنّ ال [بولّفرقتي] فهرسة كان 0.168. ويمكن التوصل إلى كفاءة عالية في الفخ بنسبة 83٪ إذا تم مقذوف liposomesمن خلال غشاء حجم المسام 0.2 م (الجدول 2).

تم تقييم الخصائص النانوليبولوجية من قبل SEM. الشكل 2A،B يعرض الحويصلات الشحمية على شكل دائري في نطاق 121 نانومتر وتحليلها في 20 كيلوفولت، في حين أن الشكل 2C،D يعرض غير مهيأ بشكل كاف عينات. وقد جفت النانوليبوسومات ببساطة الهواء دون تثبيت السابقة أو أي علاج آخر وصفها في هذه الدراسة. ونتيجة لذلك، لوحظت حويصلات أكبر وتالفة في نطاق 332 ميكرومتر وتحليلها في 5 كيلوفولت.

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإعداد النانوليبوسوم. تم حل DOPE، PEG، وCHEMS، المكونات الرئيسية liposome، لأول مرة في الكلوروفورم للحصول على فيلم الدهون(1، 2،3). ثم تم إعادة ترطيب فيلم الدهون في عازلة ملحية تحتوي على البروتين المائي (تارين) لتكون محاصرين، وتم إجراء الحضانة بين عشية وضحاها (4). ثم، تم تطبيق تقنيات sonication والنتوء لتوليد سيارات الدفع الرباعي(5،6). وفصلت خطوة ultracentrifugation إعداد liposomal من الدهون الحرة والبروتين غير مغلفة، في حين تم استخدام supernatant لتحديد كفاءة الفخ (7). وقد تم تعديل هذا الرقم من Correa et al.¹⁶. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الفحص الضوئي النانوليبوسوم بواسطة SEM. (ألف،باء) صور من الحويصلات الشحمية على شكل دائري في نطاق 121 نانومتر وتحليلها في 20 كيلو فولت. (C,D) صور عينات غير معدة بشكل كاف. عينات يساء معاملتها يسمح لمراقبة الحويصلات أكبر و / أو التالفة، والتي لا يمكن أن تقاوم فراغ و / أو ظروف الجهد في 5 كيلوفولت. وقد تم تعديل هذا الرقم من Correa et al.¹⁶. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مكونات ليبوسوم	الوزن (ز)	التركيز (mM)	المجلد النهائي
المخدرات	0.0420	5.7	10 مل
MPEG 2000-DSPE	0.1059	3.8
في ما يُم	0.0024	0.5

DOPE - 1،2-ديوليل-سن-غليسيرول-3-فوسفوإيثانولامين)؛ MPEG 2000-DSPE - 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [amino (البولي ايثيلين غليكول)-2000] (ملح الأمونيوم); CHEMS – تشوليستريميستشينوت.

الجدول 1: إعداد كبسولات نانوية ليبوسومال تارين.

حجم المسام الغشاء (ميكرومتر)	توزيع الحجم (نانومتر)	متوسط الحجم (نانومتر)	فهرس التشتت المتعدد (PdI)	الذروة (نانومتر)	كفاءة الفخ
0.2	51 - 396	155	0. 168	94 ± 39	0.83

تم تقييم مؤشر الحجم والتشتت المتعدد من خلال تشتت الضوء الديناميكي، في حين تم تحديد كفاءة التغليف وفقا لبيترسون¹⁷.

الجدول 2: الحجم، ومؤشر التشتت، وكفاءة الوقوع في فخ إعداد nanoliposome.

المناقشة

تم اختبار البروتوكول الموضح هنا من قبل Correa et al.¹⁶ لتغليف التارين، وهو مناعي ومضاد للورم تنقية من كولواسيا ايسكولنتا²². وأسفرت المنهجية عن نتائج ناجحة، مما سمح بإنتاج نانوليبوسومات مستقرة ذات حجم مناسب للتطبيقات العلاجية. صياغة يعرض الإفراج عن تسيطر عليها في مستويات درجة الحموضة المختلفة في ظل الظروف الفسيولوجية. كما أنه يقوي الخصائص الدوائية التارين، مثل تثبيط الورم الأرومي الدبقي البشري U-87 MG وسرطان الثدي MDA-MB-231 خطوط الخلايا وتحفيز خلايا نخاع العظام الفئران. لم يظهر الإعداد اللبوسومال أي آثار سامة في خلايا الفئران صحية¹⁶.

الطريقة الكلاسيكية، التي وصفها لأولمرة Bangham وآخرون 7، يسمح لإنتاج الحويصلات الشحمية متعددة اللاملار كبيرة، غير متجانسة في الحجم والشكل. يتم تطبيق تعديلات هذه الطريقة، كما ورد في هذه الدراسة، بنجاح من خلال إدراج خطوات إضافية مثل سونيكيشن والنتوء من خلال غشاء البولي 0.2 م. وهذا يسمح بإنتاج تشتت أكثر تجانسا فيما يتعلق بالحجم في نطاق نانومتر^16،23،24. ولذلك، لضمان تحقيق نتائج ناجحة، ينبغي اتباع بروتوكول التغليف والتركيبة الدهنية الموصوفة هنا بدقة.

تم اختيار تكوين nanoliposome بعناية من أجل ضمان تشكيل غشاء ثنائي الطبقة مع DOPE، MPEG 2000-DSPE، وCHEMS كمكونات رئيسية. هذه هي المكونات غشاء الحيوان الطبيعي ثنائي الطبقة وهذه الأخيرة يمكن أن تضفي سيولة للهندسة النانوية، وضمان تطبيق واسع النطاق لتسليم مركب نشط بيولوجيا في البشر.

الأننيوليبوسوم pegylation ضروري لضمان استقرار هيكل liposome. يؤدي غياب PEG إلى توسيع الحجم، ومؤشر تعدد التشتت العالي، وانخفاض كفاءة الفخ. يمكن الحصول على النتائج المثلى مع DOPE كعنصر liposome الرئيسي. ومع ذلك، هذا هو فوسفوليبيد عالية التكلفة. ويمكن تحقيق التكاليف المالية لإنتاج nanoliposome عن طريق استبدال DOPE مع الدهون المماثلة الأخرى مثل DOPC (1,2-ديوليل-سن-غليسيرو-3-فوسفوليو). CHEMS هو جزيء الكولسترول الموجود بشكل طبيعي في أغشية الخلايا الحيوانية، والتي لا ينبغي استبعادها من الصياغة، حيث أنه من المهم ضمان سيولة الدهون ثنائية الطبقة وليونة¹⁶.

ويمكن أيضا تكييف جوانب أخرى من بروتوكول التغليف. ويمكن بسهولة استبدال الكلوروفورم المستخدم في حل المكونات الدهنية بالميثانول مع عدم وجود آثار على متوسط الحجم، والتجانس، وكفاءة الفخ. ومع ذلك، يمكن أن يحدث بعض تسرب البروتين في التخزين تحت 4 °C¹⁶. خطوة الحضانة بين عشية وضحاها مع محلول كبريتات الأمونيوم التي تحتوي على التارين ليست إلزامية. ومع ذلك، للراحة يمكن أن يؤديها مع عدم وجود ضرر للخصائص البيوفيزيائية nanoliposomal، تغليف، أو خسائر كفاءة الاستقرار، كما هو مبين من قبل كوريا وآخرون¹⁶. يتم تنفيذ خطوة البثق في درجة حرارة الغرفة، والتي يمكن أن تقلل من معدل التدفق بين المحاقن إذا تم استخدام غشاء حجم المسام 0.1 م.

للتغلب على هذه المشكلة، ينبغي النظر في استخدام غشاء حجم المسام 0.2 م أو تسخين حامل الطارد فوق درجة حرارة انتقال الدهون. يجب على المحلل أن يكون حريصا على عدم الإضرار بالدهون أو البروتين الذي يمكن تعطيله وفقدان النشاط البيولوجي. بدلاً من ذلك، يمكن أن يكون إعداد liposomal dialyzed ضد HBS بدلاً من ultracentrifugation، وذلك باستخدام غشاء قطع وفقا ً للوزن الجزيئي البروتيني. إن اختيار الطبيعة الكيميائية للحاجز الذي يتم فيه تعليق النانوليبوسومبعد التموجات الفائقة يرتبط مباشرة بتطبيقه اللاحق. وبما أن وجهات نظر هذه الدراسة تشمل في الاختبارات الحية والمختبرية، فإن التعليق في محلول ملحي مُسحَرِّف من HEPES كان كافياً لضمان عدم وجود آثار سامة للخلايا ومجموعة من الأس الهيدروجيني قريبة من الظروف الفسيولوجية.

يجب أن تعامل liposomes بدقة، على غرار الخلايا الحية، للحصول على صور SEM أعلى جودة. إجراءات التثبيت والتجفيف مهمة لضمان التصور من الحويصلات سليمة أصغر التي تدعم القيم أعلى من 20 كيلو فولت في ظل ظروف فراغ. الشكل 2 A، B يعرض الحويصلات نانوية متوافقة مع إجراء البثق. التصور من الحويصلات تتراوح بين 51-396 نانومتر ممكن إذا تم تنفيذ إعداد عينة كافية بعد هذا الإجراء. وتشمل الخطوات التثبيت، والتجفيف عن طريق زيادة تركيزات الإيثانول، والجفاف الكيميائي لتجنب تشكيل المجاميع والحويصلات الممزقة الناجمة عن الفراغ وشعاع الإلكترون. من ناحية أخرى، يظهر الشكل 2C،D الحويصلات الدهنية المجففة تحت درجة حرارة الغرفة ولا تخضع لأي علاجات الموصوفة هنا، مما يعني أنها كانت مستعدة بشكل غير كاف. نتيجة لعدم كفاية الإجراء ، يتم تشكيل الحويصلات العملاقة ، حتى بعد البثق من خلال غشاء حجم المسام 0.2 ميكرومتر. كما لوحظ تمزق الحويصلات في كلتا اللوحتين نتيجة للفراغ وتلف شعاع الإلكترون.

وقد تم استكشاف الحويصلات Nanoliposome كتغليف ونظام التسليم للجزيئات الكارهة للماء، بما في ذلك ريسفيراترول (3،5،4'-تريهيدروكسيستيلبين)، وهو مركب نشط بيولوجيا ضد خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن إجراء التغليف التغلب على الذوبان الفقراء من المركبات الدهنية بالإضافة إلى توفير التوافق البيولوجي، والتحلل البيولوجي، وعدم المناعة، والخصائص غير السمية المتأصلة في كبسولات نانوية liposome²⁵. ويجب أن تؤخذ في الاعتبار تعديلات البروتوكولات تبعاً لمسار الإدارة والغرض منها، مثل وضع تركيبات جديدة للإدارة عن طريق الفم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كبريتات الأمونيوم	سيجما ألدريتش Co	A4418
Analitycal Ballance Mettler H10Tw	Mettler Inc.	417870
بيكمان DU-640 مقياس الطيف	الضوئي بيكمان كولتر	8043-30-1090
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	Sigma-Aldrich Co	5470
BUCHI Rotavapor R-300 المبخر الدوار مع وحدة تحكم ومضخة V-300	Thermo Fischer Scientific	05-001-022PM
CHEMS (cholesterylhemisuccinate)	Sigma-Aldrich Co	C6512
كلوروفورم	سيجما-ألدريتش Co	48520-U	تحذير
كبريتات النحاس (II) (خماسي الهيدرات)	Sigma-Aldrich	Co 209198
Coverslips (قطر 13 مم)	Thermo Scientific Nunc	EW-01839-00
DOPE (1،2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine) Lipoid	GMBH	565600.1
الإيثانول المطلق	سيجما-ألدريتش	32205
Folin -Ciocalteu كاشف الفينول	Sigma-Aldrich Co	F9252
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich Co	G5882
HEPES	Sigma-Aldrich Co	H3375
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma-Aldrich Co	440191	تحذير
JOL JSM-6460 LV Sacnning المجهر الإلكتروني	JEOL LTD
الطارد الصغير 7	أفانتي القطبية الدهون	610000
MPEG 2000-DSPE 1،2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolaamine-N- [أمينو (بولي إيثيلين جلايكول) -2000] (ملح الأمونيوم) Lipoid	GMBH	588200.1
Optima L-90k أجهزة الطرد المركزي الفائقة	بيكمان كولتر	PN LL-IM-12AB
عازلة الفوسفات	Sigma-Aldrich Co	P3619
Poli-L-lysine	Sigma-Aldrich Co	P8920
البوتاسيوم L-Tartrate أحادي القاعدة	Sigma-Aldrich Co	243531
كربونات الصوديوم	Sigma-Aldrich Co	S7795
كلوريد الصوديوم	Sigma-Aldrich Co	S7653
Deoxycholate الصوديوم (DOC)	Sigma-Aldrich Co	D6750
كبريتات دوديسيل الصوديوم	Sigma-Aldrich Co	L3771
هيدروكسيد الصوديوم	Sigma-Aldrich Co	S8045
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي	Sigma-Aldrich Co	RES20908-A7
TESCAN VEGA 3 مجهر إلكتروني ماسح	Tescan	#657874
حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA)	Sigma-Aldrich Co	91230
Zetasizer Nano ZSP	Malvern Panalytical LTD
حمام تنظيف بالموجات فوق الصوتية نموذج 2510	برانسون