Method Article

التحسين والتصميم وتجنب المزالق في الكيمياء المناعية الفلورية متعددة اليدوية

DOI:

10.3791/59915

⸱

July 26th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Molecular and Cellular Physiology, University of Michigan, 3Department of Pathology, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعدد الكيمياء المناعية الفلورية هي التكنولوجيا الناشئة التي تمكن التصور من أنواع الخلايا متعددة داخل سليمة شكلي الثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة. تقدم هي المبادئ التوجيهية لضمان متعددة 7 ألوان ناجحة مع تعليمات لتحسين الأجسام المضادة والكواشف، وإعداد الشرائح، والتصميم ونصائح لتجنب المشاكل الشائعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقييم البيئة الدقيقة للأنسجة السليمة لتحليل تسلل الخلايا والتنظيم المكاني أمر ضروري لفهم تعقيد عمليات المرض. وتشمل التقنيات الرئيسية المستخدمة في الماضي الكيمياء المناعية (IHC) والفلورة المناعية (IF) التي تمكن تصور الخلايا كلقطة في الوقت المناسب باستخدام ما بين 1 و 4 علامات. ولكل من التقنيات أوجه قصور، بما في ذلك صعوبة تلطيخ الأهداف غير المضادة للجينات والقيود المتصلة بالتفاعل بين الأنواع. IHC موثوق بها واستنساخها، ولكن طبيعة الكيمياء والاعتماد على الطيف الضوئي المرئي يسمح فقط لعدد قليل من العلامات لاستخدامها ويجعل التعريب المشترك تحديا. استخدام IF يوسع علامات المحتملة ولكن عادة ما يعتمد على الأنسجة المجمدة بسبب الفلورة الأنسجة واسعة النطاق بعد تثبيت رسمي. قياس التدفق الخلوي، وهي تقنية تمكن من وضع علامات متزامنة على الepitopes متعددة، يلغي العديد من أوجه القصور في IF وIHC، ومع ذلك، فإن الحاجة إلى فحص الخلايا كما تعليق خلية واحدة يفقد السياق المكاني للخلايا التخلص من البيولوجية الهامة العلاقات. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) الجسور هذه التكنولوجيات مما يسمح لمتعدد epitope الفينولات الخلوية في البارافين ثابت ة رسمية جزءا لا يتجزأ (FFPE) الأنسجة مع الحفاظ على الهندسة المعمارية البيئية الدقيقة الشاملة والمكانية علاقة الخلايا داخل الأنسجة غير المعطلة سليمة. عالية الكثافة الفلورسنت الفلوروفور التي ترتبط بشكل مشترك إلى epitope الأنسجة تمكن تطبيقات متعددة من الأجسام المضادة الأولية دون القلق من الأنواع محددة عبر التفاعل من قبل الأجسام المضادة الثانوية. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا قد ثبت لإنتاج صور موثوقة ودقيقة لدراسة المرض، فإن عملية إنشاء استراتيجية تلطيخ mfIHC مفيدة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وصارمة بسبب التحسين والتصميم واسعة النطاق. من أجل جعل الصور القوية التي تمثل التفاعلات الخلوية دقيقة في الموقع والتخفيف من فترة التحسين للتحليل اليدوي، المعروضة هنا هي طرق لإعداد الشريحة، وتحسين الأجسام المضادة، وتصميم متعددة، فضلا عن الأخطاء التي تواجهها عادة خلال عملية تلطيخ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصور من البيئة الدقيقة الورم سليمة (TME) أمر ضروري في تقييم ليس فقط التسلل الخلوي في الأورام الخبيثة الصلبة ولكن الخلية إلى تفاعلات الخلية كذلك. وقد ظهرت متعددة الفلورسنت الكيمياء المناعية (mfIHC) كأداة فعالة لمتعددة مستضد الفينولمنت من الخلايا في دراسة السرطان والأمراض المرتبطةبها 1،2،3،4، 5و6و7. هذا، جنبا إلى جنب مع البرامج الجديدة والبرامج المصممة لتحليل مجموعاتالبيانات الكبيرة، تمكن من مراقبة التفاعلات المعق....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الأعمال من قبل مجلس المراجعة الداخلية في جامعة ميشيغان.

1. تحسين الأجسام المضادة الأولية وإعداد الشريحة

  1. تحديد التركيز المثالي للأجسام المضادة للمضاعفات باستخدام IHC التقليدية.
    1. اختبار الأجسام المضادة للمضاعفات عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية اليدوية (IHC)13.
    2. استخدام أنسجة محددة تحتوي على نوع خلية وفيرة لكل جسم مضاد تم اختباره مثل استخدام أنسجة اللوزتين لاختبار الأجسام المضادة CD3.
    3. استخدم التركيز المرجعي للIHC الموصى به من قبل الشركة ثم أكمل IHC مع تركيزات الأجسام المضادة في التركيزات الموصى بها وكذلك التركيزات أعلى وتحت التركيز الموصى به.
    2. <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العملية الشاملة للحصول على اختبار متعدد الألوان 7 ألوان يتبع نمط متكرر. يصف الشكل 1 العملية في شكل رسم تخطيطي. مرة واحدة يتم قطع الشرائح وتجفيفها أو وردت من المختبر وخبز في فرن التهجين في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم المضي قدما في إزالة البارافينية والإماهة، وإصلاح الشرائح في formalin مرة أخرى تليها استرداد مستضد. تبدأ كل جولة من تعدد الإرسال في استرجاع المستضد وتنتهي عند إزالة الأجسام المضادة (الشكل1).

إن تحسين كل خطوة في العملية أم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا تزال عينات الأنسجة السليمة من خزعة الورم الصلبة واستئصال الجراحة أدوات تشخيصية وتنبؤية هامة لتحليل المرض وكذلك تشخيص المريض. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) هو تقنية جديدة تجمع بين فوائد الكيمياء المناعية (IHC)، الفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي. وقد سمحت الأساليب السابقة للتحقيق في الخلايا في الموقع لتقييم ترتيبات الخلية إلى الخلية في بيئة الأنسجة8، ومع ذلك ، فإن انخفاض عدد الepitopes التي يمكن فحصها يحد من التحليل المعقد. تدفق قياس الخلايا، على الرغم من أن مفيدة في تحليل العدي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا إد ستاك، الذي كان سابقاً من بيركين إلمر، على مساعدته في إعداد وتحسين تلطيخ المضاعفات الأصلية. كما يود المؤلفون أن يشكروا كريستين شميت من أكويا للعلوم الحيوية على نصائحها باستخدام برنامج التحليل. البحوث التي وردت في هذا المنشور بدعم من المعاهد الوطنية للسرطان والصحة تحت جائزة رقم P30CA046592، K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم صندوقي جيفري أ. كولبي لسرطان القولون وتوم ليو التذكاري دعما إضافيا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100٪ إيثانولفيشرHC8001GAL
70٪ إيثانولفيشرHC10001GL
95٪ إيثانولبرنامج تحليل HC11001GL
فيشرCLS135783inForm الإصدار 2.3.0
مانتاد الحاملThermoFisherP36961ProLong
حل حجب الماسناقلاتSP-6000Bloxall
مصل الأبقار ألبومين (BSA)سيجما لايف ساينسزA9647-100G
غطاء زلاتفيشر12-548-5E
مهمة دقيقةكيمبرلي كلارك34120
مخفف الفلورسنتأكويا بيوساينسزARD1A01EAأوبال TSA مخفف
فلوروفور 520أكويا العلوم البيولوجيةFP1487001KT1:100
فلوروفور 540أكويا بالعلومالبيولوجية FP1494001KT1:100
فلوروفور 570أكويا للعلومالبيولوجية FP1488001KT1:100
فلوروفور 620أكويا بيوساينسزFP1495001KT1:100
فلوروفور 650أكويا بيوساينسزFP1496001KT1:100
فلوروفور 690Akoya BiosciencesFP1497001KT1:100
Fluorophore DAPIAkoya BiosciencesFP14903 قطرات في TBST أو
PBS صندوق مقاوم للحرارةTissue-Tek25608-904صندوق منزلق بلاستيكي أخضر
غرفة مرطبIbi ScientificAT-12
فرن تهجينفيشر Biotech
قلم حاجز مسعورناقلاتH-4000ImmEdge
مجهربيركين إلمرCLS140089تعويذة محطة عمل علم الأمراض الكمي
الميكروويفباناسونيكNN-A661Sمع تقنية العاكس
الفورمالين المحايدالمخزن فيشر ScientificSF100-410٪ الفورمالين المخزن المحايد
الأس الهيدروجيني 6 عازلة استرجاع المستضدAkoya BiosciencesAR600AR6
درجة الحموضة 9 عازلة استرجاع المستضدAkoya BiosciencesAR900AR9
محلول ملحي مخزن الفوسفاتفيشرBP3994PBS
صندوق شرائح بلاستيكيTissue-Tek25608-906
غلاف بلاستيكيفيشرNC9070936
بولي سوربات 20فيشرBP337-800توين 20
أساسي الجسم المضاد CD163LeciaNCL-LCD1631:400
الجسم المضاد الأساسي CD3DakoA04521:400
الجسم المضاد الأساسي CD8Spring BioM53901:400
الجسم المضاد الأساسي FOXP3DakoM35151:400
الأجسام المضادة الأوليةإشارات خلية126531:500
الجسم المضاد الأساسي PD-L1خلية الإشارات136841:200
الجسم المضاد الثانويAkoya BiosciencesARH1001EAأوبال بوليمر
مجموعة بقعالشريحة علوم المجهر الإلكتروني6254001
تريس محلول ملحيمخزن كورنينج46-012-CMTBS
رف منزلق عموديعلوم المجهر الإلكتروني50-294-72
زيلينفيشرX3P1GAL
مسح الكيراتين

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
  2. Barua, S., et al. A Funct....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplex Fluorescent ImmunohistochemistryFormalin Fixed Paraffin Embedded TissueAntibody OptimizationMultiplex DesignSlide PreparationAntigen RetrievalFluorophore ApplicationMonoplex AssaySpatial AnalysisTumor Microenvironment

Related Articles