تعدد الكيمياء المناعية الفلورية هي التكنولوجيا الناشئة التي تمكن التصور من أنواع الخلايا متعددة داخل سليمة شكلي الثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ من (FFPE) الأنسجة. تقدم هي المبادئ التوجيهية لضمان متعددة 7 ألوان ناجحة مع تعليمات لتحسين الأجسام المضادة والكواشف، وإعداد الشرائح، والتصميم ونصائح لتجنب المشاكل الشائعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحسين والتصميم وتجنب المزالق في الكيمياء المناعية الفلورية متعددة اليدوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقييم البيئة الدقيقة للأنسجة السليمة لتحليل تسلل الخلايا والتنظيم المكاني أمر ضروري لفهم تعقيد عمليات المرض. وتشمل التقنيات الرئيسية المستخدمة في الماضي الكيمياء المناعية (IHC) والفلورة المناعية (IF) التي تمكن تصور الخلايا كلقطة في الوقت المناسب باستخدام ما بين 1 و 4 علامات. ولكل من التقنيات أوجه قصور، بما في ذلك صعوبة تلطيخ الأهداف غير المضادة للجينات والقيود المتصلة بالتفاعل بين الأنواع. IHC موثوق بها واستنساخها، ولكن طبيعة الكيمياء والاعتماد على الطيف الضوئي المرئي يسمح فقط لعدد قليل من العلامات لاستخدامها ويجعل التعريب المشترك تحديا. استخدام IF يوسع علامات المحتملة ولكن عادة ما يعتمد على الأنسجة المجمدة بسبب الفلورة الأنسجة واسعة النطاق بعد تثبيت رسمي. قياس التدفق الخلوي، وهي تقنية تمكن من وضع علامات متزامنة على الepitopes متعددة، يلغي العديد من أوجه القصور في IF وIHC، ومع ذلك، فإن الحاجة إلى فحص الخلايا كما تعليق خلية واحدة يفقد السياق المكاني للخلايا التخلص من البيولوجية الهامة العلاقات. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) الجسور هذه التكنولوجيات مما يسمح لمتعدد epitope الفينولات الخلوية في البارافين ثابت ة رسمية جزءا لا يتجزأ (FFPE) الأنسجة مع الحفاظ على الهندسة المعمارية البيئية الدقيقة الشاملة والمكانية علاقة الخلايا داخل الأنسجة غير المعطلة سليمة. عالية الكثافة الفلورسنت الفلوروفور التي ترتبط بشكل مشترك إلى epitope الأنسجة تمكن تطبيقات متعددة من الأجسام المضادة الأولية دون القلق من الأنواع محددة عبر التفاعل من قبل الأجسام المضادة الثانوية. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا قد ثبت لإنتاج صور موثوقة ودقيقة لدراسة المرض، فإن عملية إنشاء استراتيجية تلطيخ mfIHC مفيدة يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وصارمة بسبب التحسين والتصميم واسعة النطاق. من أجل جعل الصور القوية التي تمثل التفاعلات الخلوية دقيقة في الموقع والتخفيف من فترة التحسين للتحليل اليدوي، المعروضة هنا هي طرق لإعداد الشريحة، وتحسين الأجسام المضادة، وتصميم متعددة، فضلا عن الأخطاء التي تواجهها عادة خلال عملية تلطيخ.
المقدمة
التصور من البيئة الدقيقة الورم سليمة (TME) أمر ضروري في تقييم ليس فقط التسلل الخلوي في الأورام الخبيثة الصلبة ولكن الخلية إلى تفاعلات الخلية كذلك. وقد ظهرت متعددة الفلورسنت الكيمياء المناعية (mfIHC) كأداة فعالة لمتعددة مستضد الفينولمنت من الخلايا في دراسة السرطان والأمراض المرتبطةبها 1،2،3،4، 5و6و7. هذا، جنبا إلى جنب مع البرامج الجديدة والبرامج المصممة لتحليل مجموعاتالبيانات الكبيرة، تمكن من مراقبة التفاعلات المعقدة بين الخلايا 1،2،4. عامل الحد من معدل في الحصول على البيانات هو في كثير من الأحيان نوعية الأنسجة الملونة قبل التحليل.
وتشمل التقنيات السابقة المستخدمة في الخلايا الظاهرية في TME الكيمياء المناعية (IHC)، والفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي التي تشكل جميعها قيودا ً كبيرة. يستخدم IHC رسميًا أجزاء البارافين المدمجة (FFPE) التي يتم إزالة البارافين وترطيبها قبل أن تلطخت بجسم مضاد واحد في أغلب الأحيان. استخدام بيروكسيداز الفجل (HRP) ملزمة الأجسام المضادة الثانوية ورد الفعل الكيميائي يسمح التصور من epitope مضاد للجينات واحد8. في حين أن IHC موثوق بها وتنفيذها على أنسجة FFPE التي من السهل العمل مع، والقيود على الطيف الضوئي المرئي يعني واحد فقط أو اثنين من علامات يمكن أن تكون موثوقة متميزة والتوطين المشترك من المستضدات من الصعب جدا8. وهناك طريقة لتوسيع العلامات المتاحة وبالتالي المستضدات التي يمكن فحصها على مقطع واحد هو تغيير إلى الفلورة التي تسمح باستخدام مجموعة أوسع من الطيف البصري. بالنسبة للأنسجة المجمدة أو FFPE، يتم نقلها إلى الشرائح والأجسام المضادة المستخدمة التي يتم مترافقة مع مختلف الفلوروفور. في حين أن هذا يزيد من عدد المستضدات التي يمكن التحقيق فيها، هناك العديد من القيود الهامة. أولا، لأن كل الأجسام المضادة عادة ما يكون واحد فقط فلوروفور تعلق، وسطوع في كثير من الأحيان ليست قوية بما فيه الكفاية للتغلب على الفلورة الأنسجة. ولهذا السبب، يتم تنفيذ معظم IF على الأنسجة المجمدة التي هي مكلفة لتخزين ويصعب العمل مع. يتوفر عدد محدود من العلامات الفلورية للاستخدام بسبب التداخل الطيفي وتفاعل الأنواع المتقاطعة خاصة عند استخدام الأجسام المضادة غير المتقارنة. تدفق قياس الخلايا، والذي يتكون من معالجة الأنسجة الطازجة في تعليق خلية واحدة ووضع العلامات مع الأجسام المضادة الفلورسنت كان المعيار الذهبي للمناعة للنماذج المناعية لعقود9،10. فائدة قياس التدفق هو القدرة على تسمية الأجسام المضادة متعددة دون القلق على التفاعل عبر الأنواع كما يتم الجمع بين معظم. لأن الخلايا هي "تصور" من قبل آلة وليس عيون الإنسان، وهناك أكثر بكثير الفلوروفور المتاحة ولكن هذا يأتي مع تكلفة. ويجب أن يتم التعويض يدويا، الأمر الذي يمكن أن يغير إلى حد كبير النتائج التي تسفر عن مجموعات سكانية إيجابية وسلبية زائفة. أهم قيد على قياس التدفق هو أن بنية الأنسجة وبالتالي تفقد جميع المعلومات المكانية بسبب ضرورة تعليق الخلايا المفردة.
تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) باستخدام المجهر الفلورسنت الآلي في تركيبة مع برامج جديدة يجمع بين فوائد IHC، IF وقياس التدفق الخلوي من خلال السماح للأنسجة متعددة مستضد تلطيخ مع تضخيم إشارة و الاحتفاظ بالعلاقات المكانية دون الحاجة إلى التعويض. يتم وضع أنسجة FFPE على الشرائح المشحونة التي، بعد استرجاع مستضد، تخضع لجولة من تطبيق الأجسام المضادة الأولية إلى مستضد الهدف من الفائدة تليها الأجسام المضادة الثانوية مع علامة كيميائية HRP، على غرار IHC. بعد وضع الأجسام المضادة الثانوية، وHRP رد فعل محدد يؤدي إلى الفلوروفور ملزمة بشكل مشترك إلى epitope من الفائدة11. مرة واحدة يتم تسمية الأنسجة، يتم الانتهاء من جولة أخرى من التدفئة الشرائح إزالة مجمع الأجسام المضادة الأولية والثانوية المطبقة سابقا ترك فقط علامة الفلورسنت ملزمة إلى epitope الأنسجة11. وهذا يسمح لإعادة تطبيق الأجسام المضادة المتعددة من أي نوع دون القلق من التفاعل المتبادل11،12. ولتقليل أي حاجة إلى تعويض يدوي لأصباغ فلورية متعددة، تُستخدم مجموعة من الفلوروفورات ذات التداخل الطيفي القليل بما في ذلك وصمة عار مضادة نووية لإكمال الـ MFIHC. لحساب الفلورة الذاتية التي تواجهها مع أنسجة FFPE، يطرح البرنامج الفلورة الذاتية من الصورة النهائية باستخدام صورة من شريحة فارغة وهو أمر ممكن بسبب قوة الفلورة مستضد محددة بعد فلوروفور تضخيم الإشارة. باستخدام برامج جديدة مصممة لمجموعات البيانات الكبيرة، يمكن تحديد مواقع الخلايا وتحليلها للسياق المكاني1و2و4. الحد الأكثر أهمية من هذه التقنية هو وقت التحسين. وجدت هنا منهجية مفصلة مع تعليمات للتصميم التجريبي واستراتيجية التلطيخ والتصوير. سوف تكون MFIHC مفيدة للمختبرات التي ليس لديها حاليا نظام تلطيخ الآلي الأمثل التي ترغب في فهم أفضل للسياق المكاني للتفاعلات من خلية إلى خلية في أنسجة FFPE سليمة باستخدام تقنية يدوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الأعمال من قبل مجلس المراجعة الداخلية في جامعة ميشيغان.
1. تحسين الأجسام المضادة الأولية وإعداد الشريحة
- تحديد التركيز المثالي للأجسام المضادة للمضاعفات باستخدام IHC التقليدية.
- اختبار الأجسام المضادة للمضاعفات عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية اليدوية (IHC)13.
- استخدام أنسجة محددة تحتوي على نوع خلية وفيرة لكل جسم مضاد تم اختباره مثل استخدام أنسجة اللوزتين لاختبار الأجسام المضادة CD3.
- استخدم التركيز المرجعي للIHC الموصى به من قبل الشركة ثم أكمل IHC مع تركيزات الأجسام المضادة في التركيزات الموصى بها وكذلك التركيزات أعلى وتحت التركيز الموصى به.
- إعداد رسمي البارافين الثابتة جزءا لا يتجزأ من الأنسجة على الشرائح.
- باستخدام ميكروتومي، قطع كتل من أنسجة FFPE في سمك بين 4 و 6 م وتنطبق على الشرائح المشحونة.
ملاحظة: استخدام الماء المقطر يضمن تركيب الأنسجة المناسبة والالتزام في جميع أنحاء متعددة. - ضع الشرائح مسطحة، والأنسجة الجانب حتى، والسماح لتجف في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تخزين الشرائح في مربع الشريحة بعيدا عن درجة الحرارة القصوى حتى جاهزة لإكمال متعددة.
- باستخدام ميكروتومي، قطع كتل من أنسجة FFPE في سمك بين 4 و 6 م وتنطبق على الشرائح المشحونة.
2. طريقة تلطيخ العامة
- إعداد حلول الغسيل واسترجاع المستضد
- إعداد محلول غسل 0.1٪ TBST عن طريق خلط 9 لتر من الماء منزوع الأيونات، 1 لتر من التريس المخزنة المالحة (TBS) و 10 مل من بوليسوربات 20.
- إعداد كل من حلول استرجاع مستضد (الحموضة 6 و pH 9; جدول المواد) عن طريق تخفيف إلى 1X مع الماء منزوع الأيونات.
- إزالة البارافين والإماهة
- خبز الشرائح، والكذب شقة، والأنسجة الجانب حتى في60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في فرن التهجين 1. قم بإزالة الشرائح من الفرن والسماح بيبرد لمدة 5-10 دقائق على الأقل ثم ضعها في حامل شرائح عمودي.
- علاج الشرائح في الحلول التالية بالتتابع: xylene في triplicate، تليها معالجة واحدة من الإيثانول 100٪، 95٪ الإيثانول، وأخيرا70٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة لكل منها باستخدام مجموعة تلطيخ الشريحة 1.
- غسل رف من الشرائح لمدة 2 دقيقة مع الماء منزوع الأيونات عن طريق الغمر في مربع الشريحة البلاستيكية تليها التثبيت عن طريق الغمر في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة محايدة المخزنة الرسمية لمدة 30 دقيقة13. اغسل الشرائح في الماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين ثم انتقل إلى استرجاع المستضد.
- مستضد الاسترجاع
- ضع رف الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة مملوء بالخط الداخلي (حوالي 300 مل) مع المخزن المؤقت لاسترداد المستضد بالساعة 6 أو درجة الحموضة 9.
ملاحظة: يمكن أن يكون المخزن المؤقت استرداد مستضد إما pH 6 أو pH 9 التي قد تحتاج إلى تحسين لكل epitope. ومع ذلك، ابدأ باستخدام درجة الحموضة 9 للأجسام المضادة التي تربط النعوت النووية ودرجة الحموضة 6 لجميع الأجسام المضادة الأخرى. - تغطية مربع مع التفاف من البلاستيك واستخدام الفرقة المطاطية لتأمين. ضع الصندوق في الميكروويف على حافة اللوحة الدوارة (يجب أن يكون الميكروويف مجهزاً بتكنولوجيا العاكس للتدفئة حتى). تسخين الشرائح لمدة 45 s في 100٪ السلطة تليها 15 دقيقة في 20٪ السلطة13.
ملاحظة: قد يحتاج العلاج بالموجات الدقيقة إلى تحسين الميكروويف المستخدم. - دع الشرائح تبرد لمدة 15-20 دقيقة تقريبًا.
- ضع رف الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة مملوء بالخط الداخلي (حوالي 300 مل) مع المخزن المؤقت لاسترداد المستضد بالساعة 6 أو درجة الحموضة 9.
- إعداد حلول العمل من الأجسام المضادة والفلوروفورفية في حين الشرائح باردة.
- إعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية عن طريق حل 0.5 غرام من حبيبات الزلال المصل البقري في 50 مل من TBST. بدلا من ذلك، استخدم 50 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لإذابة حبيبات.
- جعل كل حل عمل الأجسام المضادة الأولية للتركيز الأمثل المحدد في القسم 1، في تخفيف الأجسام المضادة الأولية. تقدير حوالي 200 ميكرولتر لكل شريحة.
- إعداد حل العمل فلوروفور عن طريق تخفيف كل فلوروفور في مخفف الفلوروفوري بتركيز 1:100.
ملاحظة: قد تحتاج إلى تحسين هذا استناداً إلى الأجسام المضادة. تقدير حوالي 100 درجة مئوية لكل شريحة. - في اليوم الأخير من تلطيخ, إعداد 4′,6-دياميديينو-2-فينيليندول (DAPI) حل العمل بإضافة 3 قطرات من DAPI في 1 مل من TBST.
- تلطيخ الشرائح (الغسيل والحظر)
- إزالة مربع من الميكروويف بعد التبريد وخلع التفاف البلاستيك، وغسل الشرائح مع الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة تليها غسل 2 دقيقة في مربع الشريحة البلاستيكية شغلTBST13.
- بعد تجفيف كل شريحة حول الأنسجة مع مهمة حساسة مسح الحرص على عدم السماح للأنسجة تجف، وتتبع حول الجزء الخارجي من الأنسجة باستخدام قلم حاجز الخوف من الماء. لا تلمس الأنسجة مع مسح المهمة الحساسة أو القلم.
- ضع كل شريحة في الغرفة المرطبة وأضف محلول حظر (حوالي 4 قطرات) إلى الأنسجة. حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تلطيخ الشرائح (تطبيق الأجسام المضادة الأساسي)
- خذ كل شريحة وإزالة حل حظر عن طريق النقر على جانب الشريحة على كومة من المناشف الورقية واستخدام مهمة حساسة مسح لإزالة عامل حظر الزائدة من جميع أنحاء الأنسجة.
- وضع الشريحة مرة أخرى في غرفة رطبة وإضافة ما يقرب من 200 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية العاملة. الحضانة في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة في RT.
- غسل مع TBST لمدة 2 دقيقة عن طريق الغمر في triplicate13.
ملاحظة: بعد كل خطوة غسل تغيير TBST سيساعد على ضمان صورة أنظف.
- تلطيخ الشريحة (تطبيق الأجسام المضادة الثانوية)
- دبس قبالة TBST المتبقية من كل شريحة وتطبيق ما يقرب من 3 إلى 4 قطرات من الأجسام المضادة الثانوية (خليط من الأرانب والماوس الثانوي HRP المترافق الأجسام المضادة). حضانة لمدة 10 دقائق في غرفة مرطبة في RT13.
ملاحظة: إذا كان التخطيط لاستخدام جسم مضاد أساسي يتطلب جسم ًا مضادًا ثانويًا غير الماوس أو الأرنب أو اختيار استخدام جسم مضاد ثانوي بديل، قم بتطبيق HRP الثانوي المترافق المناسب على الشرائح والحضانة في RT لمدة 45 دقيقة. قد تكون هناك حاجة إلى وقت الحضانة للثانوية البديلة14. - بعد الحضانة، يغسل مع TBST لمدة 2دقيقة في 33.
- دبس قبالة TBST المتبقية من كل شريحة وتطبيق ما يقرب من 3 إلى 4 قطرات من الأجسام المضادة الثانوية (خليط من الأرانب والماوس الثانوي HRP المترافق الأجسام المضادة). حضانة لمدة 10 دقائق في غرفة مرطبة في RT13.
- تلطيخ الشرائح (تطبيق فلوروفور)
- تطبيق ما يقرب من 100 درجة مئوية من حل العمل فلوروفور وحضانة في غرفة رطبة في RT لمدة 10 دقيقة13.
- غسل مع TBST لمدة 2 دقيقة في triplicate13.
- إزالة الأجسام المضادة
- الشرائح الميكروويف (45 ق في 100٪ ثم 15 دقيقة في 20٪) في مربع مقاومة للحرارة (انظر الخطوة 2.3.2) لإزالة الأجسام المضادة13،14.
ملاحظة: هذا يكمل جولة واحدة من تعدد المضاعفات. هذه هي النقطة الوحيدة التي يمكن عندها إيقاف البروتوكول مؤقتاً. لإيقاف البروتوكول مؤقتًا، اترك الشرائح مغمورة في المخزن المؤقت لاسترداد المستضد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- الشرائح الميكروويف (45 ق في 100٪ ثم 15 دقيقة في 20٪) في مربع مقاومة للحرارة (انظر الخطوة 2.3.2) لإزالة الأجسام المضادة13،14.
- مواصلة جولات إضافية من تلطيخ. كرر الخطوتين 2.5.1-2.9.1 لبقية أزواج الأجسام المضادة للفلورة. وبمجرد استخدام جميع الأجسام المضادة والفلوروفورية، انتقل إلى الفرع 2-11.
- DAPI التطبيق والتركيب
- بعد آخر جولة تلطيخ في متعددة، وإزالة آخر تطبيق الأجسام المضادة مع مستضد استرداد الحل pH 613. اغسل بالماء منزوع الأيونات متبوعاً بـ TBST لمدة دقيقتين لكل13دقيقة.
- تطبيق ما يقرب من 150 درجة مئوية من الحل DAPI العمل على الشرائحوالحضانة في غرفة مرطبة لمدة 10 دقيقة في RT 1.
- يغسل مع TBST لمدة 30 s تقريبا وجبل الأغطية مع جبل antifade. تطبيق طلاء الأظافر واضحة في الزوايا الأربعة من غطاء بمجرد أن جفت وسائل الإعلام المتصاعدة لتأمين غطاء (اختياري).
3. تفاصيل المكتبة، monoplexes، ومتعددة
- اختر الشرائح لبناء مكتبة فلوروفور.
- ل7 ألوان متعددة جمع 7 خلايا المناعة الشرائح الأنسجة الغنية (أي اللوزتين والطحال، الخ) للمكتبة.
ملاحظة: اختر شرائح التحكم لاستخدامها في مكتبة فلوروفور مع كل شريحة تمثل كل فلوروفور فريدة من نوعها التي سيتم استخدامها في المضاعف. يجب أن يكون للشرائح التحكم epitope وفيرة من الاختيار، ويمكن أن يكون نفس النوع من الأنسجة لكل فلوروفور.
- ل7 ألوان متعددة جمع 7 خلايا المناعة الشرائح الأنسجة الغنية (أي اللوزتين والطحال، الخ) للمكتبة.
- شرائح مكتبة وصمة عار والصور للاستخدام مع monoplexes ومتعددة.
- اتبع الخطوتين 2.1-2.9.1 باستخدام شرائح التحكم والتحكم في شرائح الأنسجة المفضلة. وضع فلوروفور مختلف على كل شريحة بتركيز 1:100؛ يجب أن تحتوي شريحة واحدة على DAPI فقط.
- انتقل إلى القسم 2.11 باستثناء حذف تلطيخ DAPI وبدلاً من ذلك استخدام TBST وجبل كما هو موضح.
- بعد السماح الشرائح الجافة بين عشية وضحاها، صورة مع جميع القنوات DAPI، CY3، CY5، CY7، تكساس الأحمر، شبه الموصلات نقاط الكم، وfluorescein isothiocyanate (FITC) وضع التعرض ل 250 مللي ثانية مع ميزة حماية التشبع1.
ملاحظة: يمكن تعيين أوقات التعرض عند 50−250 مللي ثانية13. - تحميل صور المكتبة على البرنامج واستخدامها في تحليل monoplexes ومتعددة.
- اختر الشرائح للحيرات الأحادية.
- اختر شرائح التحكم التي تحتوي على epitope وفيرة من الاختيار على أساس الأجسام المضادة الأمثل (القسم 1). لكل جولة من تلطيخ ليتم القيام به في متعددة، حدد هذا العدد من الشرائح عنصر التحكم لإنشاء monoplexes.
ملاحظة: الغرض من monoplex تحديد أفضل موضع (ترتيب) لكل جسم مضاد ليتم استخدامها في المضاعف.
- اختر شرائح التحكم التي تحتوي على epitope وفيرة من الاختيار على أساس الأجسام المضادة الأمثل (القسم 1). لكل جولة من تلطيخ ليتم القيام به في متعددة، حدد هذا العدد من الشرائح عنصر التحكم لإنشاء monoplexes.
- اللولب اللولب.
- اتبع الأقسام 2.1-2.11 باستخدام الأجسام المضادة الأساسية بترتيب مختلف (موضع) لكل شريحة من الشرائح. يجب أن يكون لكل شريحة جسم مضاد أساسي واحد فقط يتم تطبيقه بترتيب (موضع) مختلف عن الشرائح الأخرى.
ملاحظة: لكل شريحة حيث تدعو الجولة إلى عدم وجود جسم مضاد أو فلوروفور أساسي، بدلاً من ذلك استخدام مخفف الأجسام المضادة الأولية ومخفف الفلوروفوري13.
- اتبع الأقسام 2.1-2.11 باستخدام الأجسام المضادة الأساسية بترتيب مختلف (موضع) لكل شريحة من الشرائح. يجب أن يكون لكل شريحة جسم مضاد أساسي واحد فقط يتم تطبيقه بترتيب (موضع) مختلف عن الشرائح الأخرى.
- شرائح الصورة وتحليل monoplex.
- باستخدام المجهر وتعيين وقت التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات التقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
ملاحظة: يمكن تعيين أوقات التعرض عند 50−250 مللي ثانية14. - باستخدام برنامج التحليل تقييم كل شريحة monoplex من خلال النظر في كثافة الفلورسنت من علامة ملطخة.
- قارن هذه الكثافة بالخلفية. إذا كان أعلى 5-10 مرات على الأقل من الخلفية، فإن موضع تلك الشريحة هو الموضع الأمثل للاستخدام في المضاعف النهائي.
- باستخدام المجهر وتعيين وقت التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات التقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
- اختر الشرائح للمضاعف.
- اختر شرائح الاهتمام وأضف شريحة إضافية لاستخدامها كشريحة فارغة للطرح من الفلورة الذاتية بعد تلطيخ والتصوير.
- وصمة عار متعددة.
- استناداً إلى نتائج monoplex، اختر الترتيب المناسب (المواضع) لكل جسم مضاد استناداً إلى الخطوة 3.5.3. تعيين كل فلوروفور إلى جسم مضاد.
ملاحظة: قد يحتاج هذا إلى تحسين; ومع ذلك، خطة لاستخدام الأجسام المضادةمشرق لعلامات أقل وفرة 1، وينبغي أن تتطابق مع الأجسام المضادة المشاركة في توطين مع الفلوروفور في طيف بعيد من بعضها البعض13،وفلوروفورس مع الطيف 540 و 570 لا ينبغي أن تكون مترجمة مشتركة بسبب إلى قضايا التداخل الطيفي1. - المضي قدما في الأقسام 2.1-2.11 ضمان الشريحة فارغة لا تتلقى الأجسام المضادة الأولية، فلوروفور، أو DAPI، بدلا من ذلك استخدام مخفف الأجسام المضادة، وثنائي الفلوروفوري، وTBST على التوالي بدلا من ذلك.
- استناداً إلى نتائج monoplex، اختر الترتيب المناسب (المواضع) لكل جسم مضاد استناداً إلى الخطوة 3.5.3. تعيين كل فلوروفور إلى جسم مضاد.
- تعدد الصور وتحليلها من أجل سلامة تلطيخ
- باستخدام المجهر وتحديد وقت التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات، والتقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
- باستخدام برنامج التحليل(جدول المواد)، وتقييم كل مضاعفات من قبل لون كاذبالفلورسنت.
ملاحظة: صورة واضحة يجب أن توضح كل علامة بوضوح. إذا كانت العلامة تبدو منتشرة ومحببة أو غير موجودة، فمن المحتمل أن العلامة لم تنجح وتحتاج إلى إعادة تحسينها. - باستخدام برنامج التحليل، قم بتقييم كل مضاعفات عن طريق عرض علم الأمراض. سوف عرض علم الأمراض تأكيد خصوصية كل علامة. مقارنة مع IHC الأمثل سابقا (القسم 1).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
العملية الشاملة للحصول على اختبار متعدد الألوان 7 ألوان يتبع نمط متكرر. يصف الشكل 1 العملية في شكل رسم تخطيطي. مرة واحدة يتم قطع الشرائح وتجفيفها أو وردت من المختبر وخبز في فرن التهجين في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم المضي قدما في إزالة البارافينية والإماهة، وإصلاح الشرائح في formalin مرة أخرى تليها استرداد مستضد. تبدأ كل جولة من تعدد الإرسال في استرجاع المستضد وتنتهي عند إزالة الأجسام المضادة (الشكل1).
إن تحسين كل خطوة في العملية أم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لا تزال عينات الأنسجة السليمة من خزعة الورم الصلبة واستئصال الجراحة أدوات تشخيصية وتنبؤية هامة لتحليل المرض وكذلك تشخيص المريض. تعدد الكيمياء المناعية الفلورية (mfIHC) هو تقنية جديدة تجمع بين فوائد الكيمياء المناعية (IHC)، الفلورة المناعية (IF) وقياس التدفق الخلوي. وقد سمحت الأساليب السابقة للتحقيق في الخلايا في الموقع لتقييم ترتيبات الخلية إلى الخلية في بيئة الأنسجة8، ومع ذلك ، فإن انخفاض عدد الepitopes التي يمكن فحصها يحد من التحليل المعقد. تدفق قياس الخلايا، على الرغم من أن مفيدة في تحليل العدي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا إد ستاك، الذي كان سابقاً من بيركين إلمر، على مساعدته في إعداد وتحسين تلطيخ المضاعفات الأصلية. كما يود المؤلفون أن يشكروا كريستين شميت من أكويا للعلوم الحيوية على نصائحها باستخدام برنامج التحليل. البحوث التي وردت في هذا المنشور بدعم من المعاهد الوطنية للسرطان والصحة تحت جائزة رقم P30CA046592، K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وقدم صندوقي جيفري أ. كولبي لسرطان القولون وتوم ليو التذكاري دعما إضافيا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 100٪ إيثانول | فيشر | HC8001GAL | |
| 70٪ إيثانول | فيشر | HC10001GL | |
| 95٪ إيثانول | برنامج تحليل HC11001GL | ||
| فيشر | CLS135783 | inForm الإصدار 2.3.0 | |
| مانتاد الحامل | ThermoFisher | P36961 | ProLong |
| حل حجب الماس | ناقلات | SP-6000 | Bloxall |
| مصل الأبقار ألبومين (BSA) | سيجما لايف ساينسز | A9647-100G | |
| غطاء زلات | فيشر | 12-548-5E | |
| مهمة دقيقة | كيمبرلي كلارك | 34120 | |
| مخفف الفلورسنت | أكويا بيوساينسز | ARD1A01EA | أوبال TSA مخفف |
| فلوروفور 520 | أكويا العلوم البيولوجية | FP1487001KT | 1:100 |
| فلوروفور 540 | أكويا بالعلوم | البيولوجية FP1494001KT | 1:100 |
| فلوروفور 570 | أكويا للعلوم | البيولوجية FP1488001KT | 1:100 |
| فلوروفور 620 | أكويا بيوساينسز | FP1495001KT | 1:100 |
| فلوروفور 650 | أكويا بيوساينسز | FP1496001KT | 1:100 |
| فلوروفور 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 قطرات في TBST أو |
| PBS صندوق مقاوم للحرارة | Tissue-Tek | 25608-904 | صندوق منزلق بلاستيكي أخضر |
| غرفة مرطب | Ibi Scientific | AT-12 | |
| فرن تهجين | فيشر Biotech | ||
| قلم حاجز مسعور | ناقلات | H-4000 | ImmEdge |
| مجهر | بيركين إلمر | CLS140089 | تعويذة محطة عمل علم الأمراض الكمي |
| الميكروويف | باناسونيك | NN-A661S | مع تقنية العاكس |
| الفورمالين المحايد | المخزن فيشر Scientific | SF100-4 | 10٪ الفورمالين المخزن المحايد |
| الأس الهيدروجيني 6 عازلة استرجاع المستضد | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| درجة الحموضة 9 عازلة استرجاع المستضد | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| محلول ملحي مخزن الفوسفات | فيشر | BP3994 | PBS |
| صندوق شرائح بلاستيكي | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| غلاف بلاستيكي | فيشر | NC9070936 | |
| بولي سوربات 20 | فيشر | BP337-800 | توين 20 |
| أساسي الجسم المضاد CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| الجسم المضاد الأساسي CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| الجسم المضاد الأساسي CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| الجسم المضاد الأساسي FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| الأجسام المضادة الأولية | إشارات خلية | 12653 | 1:500 |
| الجسم المضاد الأساسي PD-L1 | خلية الإشارات | 13684 | 1:200 |
| الجسم المضاد الثانوي | Akoya Biosciences | ARH1001EA | أوبال بوليمر |
| مجموعة بقع | الشريحة علوم المجهر الإلكتروني | 6254001 | |
| تريس محلول ملحي | مخزن كورنينج | 46-012-CM | TBS |
| رف منزلق عمودي | علوم المجهر الإلكتروني | 50-294-72 | |
| زيلين | فيشر | X3P1GAL |
المراجع
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880(2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095(2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32(2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
