مقالة منهجية

تقييم حالة الإخصاب من خلال تتبع المورفولوجيا النووية للنطفو النووي للنطفو في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبوسيس

DOI:

10.3791/59916

⸱

أغسطس 29, 2019

 , 
1Graduate School of Horticulture, Chiba University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نبرهن على طريقة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل على أساس مورفولوجيا الحيوانات المنوية النووية في الإخصاب المزدوج في أرابيدوبسيس باستخدام مجهر الظهارة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النباتات المزهرة لديها نظام استنساخ جنسي فريد يسمى "الإخصاب المزدوج"، حيث كل من خلايا الحيوانات المنوية الصمامات على وجه التحديد مع خلية البيض أو خلية مركزية. وهكذا، يحدث حدثان مستقلان للإخصاب في وقت واحد تقريبا. تتطور خلية البويضة المخصبة والخلية المركزية إلى الزيجوت والحيوانات المنوية، على التوالي. ولذلك، فإن السيطرة الدقيقة على الإخصاب المزدوج أمر ضروري لتطوير البذور الناجمة عن ذلك. يحدث الإخصاب المزدوج في اللجامفيت الإناث (كيس الجنين)، والتي هي مخبأة بعمق ومغطاة بأنسجة البويضة والمبيض سميكة. هذا البناء الأنسجة pistil يجعل مراقبة وتحليل الإخصاب المزدوج من الصعب جدا، وخلق الوضع الحالي الذي العديد من الأسئلة المتعلقة بآلية الإخصاب المزدوج لا تزال دون إجابة. وللتقييم الوظيفي لمرشح محتمل لتنظيم الإخصاب، من المهم إجراء تحليل للإخصاب. للحكم على الانتهاء من الإخصاب في التلاحيّة العربية، تُستخدم أشكال إشارات الفلورة التي تصف نوى الحيوانات المنوية كمؤشرات. يشار إلى خلية الحيوانات المنوية التي تفشل في الإخصاب بإشارة الفلورة المكثفة خارج اللجام الإناث، في حين أن خلية الحيوانات المنوية التي يتم إخصابها بنجاح يشار إليها بإشارة منزوعة المكثف بسبب karyogamy مع نواة اللجام الإناث. توفر الطريقة الموضحة هنا أداة لتحديد الإخصاب الناجح أو الفاشل في ظروف الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النباتات المزهرة تنتج البذور من خلال الإخصاب المزدوج، وهي عملية يتم التحكم فيها مباشرة من خلال التفاعلات بين البروتينات المترجمة على غشاء البلازما gamete1،2. المزهرة نبات الذكور gametes، زوج من خلايا الحيوانات المنوية، وتطوير في حبوب اللقاح. أنبوب حبوب اللقاح الذي ينمو بعد التلقيح يسلم زوج من خلايا الحيوانات المنوية إلى اللجام الإناث، وخلية البيض والخلية المركزية، والتي تتطور في كيس الجنين. بعد أن يجتمع المدرس الذكور والإناث، والبروتينات على سطح gamete تعزيز الاعتراف، والتعلق، والانصهار لاستكمال الإخصاب المزدوج. في الدراسات السابقة، تم تحديد البروتينات غشاء الجاميت الذكور الخلية المولدةمحددة 1 (GCS1)/HAPLESS2 (HAP2) 3،4 وGAMETE أعرب 2 (GEX2)5 كمنظمي الإخصاب المشاركة في اندماج gamete و المرفق، على التوالي. لقد حددنا مؤخرًا بروتين غشاء خاص بـ gamete للذكور، DUF679 DOMAIN MEMBRANE PROTEIN 9 (DMP9)، كمنظم للإخصاب يشارك في تفاعل gamete. وجدنا أن انخفاض التعبير DMP9 يؤدي إلى تثبيط كبير من تخصيب خلايا البيض خلال الإخصاب المزدوج في A. thaliana6.

كما يحدث الإخصاب المزدوج في كيس الجنين، الذي هو جزء لا يتجزأ من البويضة التي هي ملفوفة أكثر مع أنسجة المبيض، فمن الصعب مراقبة وتحليل حالات عمليات الإخصاب المزدوج. ولهذا السبب، لا تزال هناك العديد من النقاط غير الواضحة التي تعوق الفهم الكامل للآلية الكاملة لمراقبة الإخصاب المزدوج. إن إنشاء تقنيات مراقبة لتتبع سلوك الغمت أثناء الإخصاب المزدوج في ظل ظروف الجسم الحي أمر لا غنى عنه للتحليل الوظيفي للمرشحين المحتملين لمنظمي الإخصاب. وقد أسفرت الدراسات الحديثة خطوط علامة حيث يتم تسمية الهياكل دون الخلوية gamete مع البروتينات الفلورية. في هذه المقالة، نقوم بإظهار بروتوكول بسيط وسريع لمراقبة الإخصاب المزدوج الذي حدث في كيس جنين مشتق من البتيلات الملقحة بشكل مصطنع. باستخدام خط علامة نواة خلية الحيوانات المنوية HTR10-mRFP7، يمكن التمييز بين حالة الإخصاب لكل غمت أنثى على أساس مورفولوجيا الإشارات النووية للنطفو. بروتوكولنا الذي يركز على مثل هذا التغيير المورفولوجي لنوى الحيوانات المنوية عند الإخصاب يمكن أن يحصل بكفاءة على كمية كافية من البيانات لإثبات الإحصائية. تم استخدام خط DMP9-الضربة القاضية مع خلفية HTR10-mRFP(DMP9KD/HTR10-mRFP)كنباتات ذكرية لإظهار نمط تخصيب واحد. كما أن البروتوكول مناسب للتحليل الوظيفي لمنظمي الإخصاب الآخرين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التلقيح الاصطناعي

ملاحظة: قبل بدء العملية، مطلوب زوج من الملقط رقم 5.

  1. تنمو A. thaliana (كول-0) في 22 درجة مئوية تحت 16 ساعة ضوء / 8-ساعة دورة مظلمة في غرفة النمو.
    ملاحظة: قطع وإزالة أول ساق زهرة المتقدمة مع مقص لتعزيز تطوير براعم الإبط. النباتات المتنامية بقوة (2-3 أسابيع بعد قطع ساق الأولى؛ ارتفاع النبات حوالي 25 سم) هي مناسبة للتحليل.
  2. لإزالة السبالة (الشكل 1B) ، البتلة (الشكل 1C) ، والستايمن (الشكل 1D) من براعم الزهور في المرحلة 118 (الشكل 1A) باستخدام الملقط رقم 5. برعم مع بت من بتلات ينظر في الجزء العلوي هو أفضل.
    ملاحظة: استخدام مناسبة خط علامة gamete الإناث. في هذا البروتوكول، استخدمنا نبات نوع البرية كوالد الإناث.
  3. بعد 15 إلى 18 ساعة من الإنعدام، خذ الكنات من زهرة DMP9KD/HTR10-mRFP في المرحلة 138 عن طريق الضغط على خيوط مع ملقط.
  4. للتلقيح، وبات بلطف وصمة العار من pistil المبتورة عدة مرات مع anther dehiscent.

2. إعداد الأوفيول للمراقبة

ملاحظة: البنود التالية مطلوبة: زجاج الشريحة مع الشريط على الوجهين المرفقة، No. 5 ملقط، إبرة حقن 27 G، والمجهر تشريح.

  1. 7 إلى 8 ح بعد التلقيح (HAP)، وجمع pistil ووضعها على الشريط على الوجهين، ثم اضغط بلطف مع ملقط لإصلاح pistil على الشريط (الشكل2A،A').
    ملاحظة: معظم البويضات في pistil تلقي أنبوب حبوب اللقاح واحد على الأقل 10 HAP9. إذا فشل كل من أو أي من خلايا الحيوانات المنوية من أنبوب حبوب اللقاح الأول في الإخصاب، سيتم جذب أنبوب حبوب اللقاح الثاني من قبل البويضة بسبب نظام استعادة الإخصاب10. لتحليل مورفولوجيا نواة الحيوانات المنوية من أنبوب اللقاح الأول ، فمن المستحسن إكمال إعداد البويضة من قبل 10 HAP على أبعد تقدير.
  2. قطع الطرفين العلوي والسفلي من المبيض باستخدام إبرة حقن تحت المجهر تشريح (الشكل2B،B').
  3. شق جدار المبيض على طول جانبي replum (الشكل2C،C')عن طريق تحريك غيض من إبرة الحقن.
    ملاحظة: أدخل إبرة الحقن بشكل ضحل لمنع فصل البويضة من الحاجز.
  4. Evert جدار المبيض باستخدام إبرة الحقن (الشكل2D،D').
  5. قرصة قاعدة الحاجز الذي ترتبط البويضات، ورفعه بعناية مع ملقط (الشكل2E).
  6. نقل البويضات في قطرة من الماء على زجاج الشريحة، وتغطي بلطف مع غطاء الزجاج للمراقبة تحت المجهر الفلوري (الشكل2E،E').

3. الفحص المجهري

ملاحظة: في هذا البروتوكول، استخدمنا مجهر الظهارة مجهزة مكعب فلتر الفلورة (انظر جدولالمواد)، وكاميرا رقمية، والبرمجيات المصاحبة.

  1. الحصول على صور من البويضات التي تحتوي على نوى الحيوانات المنوية المسمى مع mRFP باستخدام عدسة موضوعية 20X أو 40X والكاميرا الرقمية المجهزة.
  2. تأكد من عدد نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
    ملاحظة: يمكن تضمين البويضات التي تحتوي على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في حجم السكان للتحليل الإحصائي.
  3. تأكد من شكل وموقع كل نواة من ونواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس جنين.
    ملاحظة: مباشرة بعد إطلاق سراحمن أنبوب حبوب اللقاح، يتم ترجمة زوج من نوى الحيوانات المنوية المكثفة التي تحمل علامة mRFP بين البويضة والخلية المركزية. تشير نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP التي تم اكتشافها على جانب نهاية التشالازال إلى تخصيب الخلايا المركزية، على سبيل المثال. باستخدام مناسبة الإناث gamete غشاء علامة خط، كما هو مبين في الشكل التكميلي 1، ما إذا كانت خلية الحيوانات المنوية تمر plasmogamy (بعد الانصهار الغشاء ولكن قبل karyogamy) يمكن رصدها بوضوح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم جمع البويضات من pistil الملقحة مع DMP9KD/HTR10-mRFP في 7-8 HAP ولاحظ.

تحتوي معظم البويضات على اثنين من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في خلية البويضة (الجانب المجهري) والخلية المركزية (الجانب الطرف الأخير من الشارازال) على التوالي (الشكل 3A)،مما يشير إلى الإخصاب المزدوج الناجح. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظت البويضات التي تحتوي على نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HTR10-mRFP تسميات الكروماتين الأبوي (أي، تصور نوى خلايا الحيوانات المنوية)، وقد تم الإبلاغ عن ديناميات في الإخصاب المزدوج7. مباشرة بعد الإفراج عن أنبوب حبوب اللقاح، لا تزال تتكثف نواة الحيوانات المنوية HTR10-mRFP المسمى. ومع ذلك، يتم إزالة المكثفات كل من نوى الحيوانات المنوية عند الاندماج مع نواة الجاميت الإناث المخصبة في karyogamy ثلاث إلى أربع ساعات بعد الانصهار غشاء gamete7. تبقى خلايا الحيوانات المنوية غير المخصبة مكثفة، كما هو موضح في كيس الجنين الذي يتم القبض على خلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل منحة كاكينجي المقدمة من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JP17H05832 إلى T.I.) وبتمويل من برنامج تعزيز البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للعلوم الجزيئية النباتية الكيميائية، جامعة شيبا (اليابان).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BX51أوليمبوسمجهر epifluorescence
غطاء زجاجيزجاج ماتسوناميC018181
DMP9KD / HTR10-mRFP< / sup>< / em>Arabidopsis thaliana< / em>, HTR10-mRFP< / em> background
Takahashi et al. (2018) 6< / sup>
شريطعلى الوجهينNichibanNW-15Sعرض 15 مم
DP72كاميرا أوليمبوسDegital
ملقطVigorأي ملقط رقم 5 متوفرة
غرفة النموNihonikaLPH-411PFQDT-SP
em>HTR10-mRFP< / em> Arabidopsis thaliana< / em> ، ecotype Columbia-0 (Col-0) background
Ingouff et al. ( 2007) 7< / sup>
إبرة الحقنTerumoNN-2719S27 G
زجاجمنزلق زجاج ماتسوناميS9443
SZX9أوليمبوستشريح المجهر
U-MRFPHQأوليمبوسمكعب مرشح مضان (إثارة: BP535-555 ، الانبعاث: BA570-625 ، مرآة ثنائية اللون: DM565)
UPlanFL N 40xأوليمبوسعدسة موضوعية (NA 1.3)،
UPlanSApo 20xOlympusObjective (NA 0.75)، جافة
< عدسة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mori, T., Kawai-Toyooka, H., Igawa, T., Nozaki, H. Gamete dialogs in green lineages. Molecular Plant. 8, 1442-1454 (2015).
  2. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Current Biology. 26, R125-R139 (2016).
  3. Mori, T., Kuroiwa, H., Higashiyama, T., Kuroiwa, T. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization. Nature Cell Biology. 1, 64-71 (2006).
  4. von Besser, K., Frank, A. C., Johnson, M. A., Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization. Development. 133, 4761-4769 (2006).
  5. Mori, T., Igawa, T., Tamiya, G., Miyagishima, S. Y., Berger, F. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis. Current Biology. 24, 170-175 (2014).
  6. Takahashi, T., et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants. Development. 145, dev170076(2018).
  7. Ingouff, M., Hamamura, Y., Gourgues, M., Higashiyama, T., Berger, F. Distinct dynamics of HISTONE3 variants between the two fertilization products in plants. Current Biology. 17, 1032-1037 (2007).
  8. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
  9. Kasahara, R. D., Maruyama, D., Higashiyama, T. Fertilization recovery system is dependent on the number of pollen grains for efficient reproduction in plants. Plant Signaling & Behavior. 8, e23690(2013).
  10. Kasahara, R. D., et al. Fertilization recovery after defective sperm cell release in Arabidopsis. Current Biology. 22, 1084-1089 (2012).
  11. Hamamura, Y., et al. Live-cell imaging reveals the dynamics of two sperm cells during double fertilization in Arabidopsis thaliana. Current Biology. 21, 497-502 (2011).
  12. Igawa, T., Yanagawa, Y., Miyagishima, S., Mori, T. Analysis of gamete membrane dynamics during double fertilization of Arabidopsis. Journal of Plant Research. 126, 387-394 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Arabidopsis Thaliana HTR10 mRFP

مقالات ذات صلة