يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز

7.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/59926

⸱

يونيو 25, 2019

 , 
1Department of Pharmacology, University of Texas Southwestern Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء فحوصات لوسيفيراز سريعة منخفضة التكلفة في متوسطة الإنتاجية باستخدام غوسيا لوسيفيراز المرتبطة بالأنسولين كوكيل لإفراز الأنسولين من خلايا بيتا. يمكن إجراء الفحص مع معظم قارئات لوحة الانارة والماصات متعددة القنوات.

الملخص

إجراء الفحوصات المستندة إلى الأجسام المضادة لجمع الأنسولين المفرزة بعد العينة عادة ما يتطلب بضع ساعات إلى يوم من وقت الفحص ويمكن أن تكون مكلفة، اعتمادا على الفحص المحدد. فحوصات لوسيفيراز المفرزة تعجل النتائج وتخفض تكلفة التذوق لكل عينة بشكل كبير. هنا نقدم نهج غير المستخدمة نسبيا لقياس النشاط إفراز الأنسولين من خلايا البنكرياس بيتا باستخدام غوسيا لوسيفيراز إدراجها وراثيا داخل الببتيد C. أثناء المعالجة بروتيوليك من بروسولين, يتم استئصال الببتيد C الإفراج عن لوسيفيراز داخل الحويصلات إفراز الأنسولين حيث يتم تفرزه مع الأنسولين. يمكن الحصول على النتائج في غضون دقائق بعد جمع عينة بسبب سرعة الاختبارات لوسيفيراز. وهناك قيد من المقاييس هو أنه هو قياس نسبي لإفراز الأنسولين وليس كمية مطلقة. ومع ذلك، هذا البروتوكول هو اقتصادي، قابلة للتحجيم، ويمكن تنفيذها باستخدام معظم قارئات لوحة الإضاءة القياسية. تسهل الماصات التناظرية والرقمية متعددة القنوات خطوات متعددة من القياس. العديد من الاختلافات التجريبية المختلفة يمكن اختبارها في وقت واحد. بمجرد أن يتم تحديد مجموعة مركزة من الشروط، ينبغي قياس تركيزات الأنسولين مباشرة باستخدام الاختبارات المستندة إلى الأجسام المضادة مع منحنيات قياسية لتأكيد نتائج اختبار لوسيفيراز.

المقدمة

الطريقة المعروضة هنا يسمح إفراز الأنسولين من خط خلية بيتا المعدلة وراثيا أن يتم فحصها بسرعة وبأسعار معقولة في شكل 96 لوحة جيدا. المفتاح لهذا البروتوكول هو نسخة معدلة من الأنسولين مع لوسيفيراز غوسيا بطبيعة الحال (GLuc, ~ 18 كدا) إدراجها (انظر الشكل1) في C-الببتيد لتوليد الأنسولين-غاوسيا (InsGLuc)1,2. البروتينات الأخرى الكبيرة، مثل GFP (~25 kDa)، تم إدخالها بنجاح في الببتيد C من الأنسولين وعرضت المعالجة المتوقعة بعد الترجمة من proinsulin-GFP إلى الأنسولين وGFP-C-الببتيد3،4. للكشف عن الشبهات في هذا البروتوكول، وقد تم CoLuc الأمثل للتعبير الثدييات واثنين من الطفرات قد أدخلت لتعزيز الحركية مثل توهج5،6. يمكن بسهولة اختبار تركيبات متعددة وتكرار من ظروف العلاج في شكل 96 جيدا لوحة ويمكن الحصول على نتائج إفراز مباشرة بعد التجربة.

وهناك ميزة رئيسية، كمالوحظ سابقا 2، هو انخفاض تكلفة هذا القياس إفراز القائم على لوسيفيراز (< 0.01 دولار/جيد) الذي يميزه عن التكاليف الأعلى نسبيا والجوانب التقنية للاختبارات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISAs) ( > $2/well) ومتجانسة الوقت حل فلوري (HTRF) أو غيرها من Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) الأجسام المضادة القائمة (> $1/well) الاختبارات. بالمقارنة مع هذه الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة، والتي تقيس تركيز الأنسولين من خلال الرجوع إلى منحنى قياسي، يقيس اختبار InsGLuc النشاط الإفرازي كمقارنة نسبية للسيطرة على الآبار على اللوحة. ولهذا السبب، تتطلب كل تجربة إدراج ضوابط مناسبة. وهذا التمييز هو مقايضة تسمح بإجراء قياسات سريعة وغير مكلفة. ومع ذلك، تم إثبات إفراز InsGLuc أن تكون مرتبطة ارتباطا وثيقا مع إفراز الأنسولين كما يقاس ELISA1،2. وقد تم توسيع نطاق هذه التكنولوجيا لفحص عالية الإنتاجية1،2،7 ، وأدى إلى تحديد المغيرات الجديدة لإفراز الأنسولين بما في ذلك مثبط قناة البوتاسيوم بوابة الجهد7 فضلا عن مثبط المنتج الطبيعي من وظيفة الخلية بيتا، الكرومومايوسين A28. استخدام InsGLuc هو الأكثر ملاءمة للباحثين الذين يخططون لاختبار باستمرار العديد من ظروف العلاج المختلفة لتأثيرها على إفراز الأنسولين. في تجارب المتابعة من الضروري تكرار النتائج الرئيسية في خط الخلية بيتا الأبوية، وعلى النحو الأمثل في المورين أو الجزر البشرية، وقياس إفراز الأنسولين باستخدام فحص الأجسام المضادة القائمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1 - إعداد الكواشف والوسائط والمخازن المؤقتة (الجدول 1)

  1. إعداد الوسائط الكاملة MIN6 في 500 مل من ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام / لتر) دولبيككو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) مع الإضافات التالية: 15٪ مصل جنين يوفي (FBS)، 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستريبتوميسين، 292 ميكروغرام / مل L-الجلوتامين، و 50 ميكروM (الـ(ميركابتوثانول
    ملاحظة: يتم الحفاظ على خط الخلايا مستقرة في هذه الحالة في 250 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية G418.
  2. إعداد كريبس- رينجر بيكربونات العازلة (KRBH) عن طريق جعل حل يحتوي على 5 m KCl، 120 m كلوريد الصوديوم،15 m HEPES (ح 7.4)، 24 م NAHCO 3، 1 mM MgCl2،2 mM CaCl2، و 1 ملغ / مل راديوي المناعة الصف الزلال المصل (BSA). الجلوكوز يضاف حيث ما هو محدد من 2 M الأسهم.
    ملاحظة: يتم استخدام KRBH لحضن الخلايا مع وبدون التحفيز من أجل تقييم الأنسولين و / أو إفراز لوسيفيراز غاوسيا.
  3. إعداد حل coelenterazine (CTZ) الأسهم على النحو التالي. إعداد الميثانول الحمضي بإضافة 106 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى 10 مل من الميثانول. بعد ذلك، حل CTZ lyophilized في الميثانول الحمضية في 1 ملغ / مل وتخزينها في -80 درجة مئوية في أنابيب المسمار كاب.
    ملاحظة: تحتفظ هذه المخزونات بنشاط كاف ٍ في الاختبارات الروتينية للفحص لوسيفيراز، حتى بعد سنة واحدة من التخزين المناسب.
  4. إعداد غاوسيا لوسيفيراز (GLuc) مخزن الكبح على أساس الأدب9 وكذلك معلومات براءات الاختراع10 للمساعدة في نصف عمر من كاسياس لوسيفيراز غاوسيا في 96 شكل لوحة بئر. استخدام الصيغة: 25 m تريس pH 8, 1 mm EDTA, 5% الجلسرين, 1 ملغ / مل Na2PO4,300 mm أسكوربات الصوديوم, 200 mNa2SO3 في الماء. تجميد المخزونات عند -20 درجة مئوية. بعد الذوبان، قم بتخزين المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية.
  5. لإعداد حل العمل غاوسيا لوسيفيراز، إضافة 4.2 μL /مل من 1 ملغ / مل (2.36 mM) حل المخزون CTZ إلى العازلة الكبح GLuc. وهذا يؤدي إلى حل عمل 2X من 10 ميكرومتر CTZ التي سيكون لها تركيز نهائي 5 ميكرومتر في الاختبارات.

2. ثقافة الخلايا INSGLuc MIN6 والبذر لفحوصات إفراز

  1. لزراعة الخلايا MIN6، trypsinize والبذور الخلايا مرة واحدة في الأسبوع باستخدام تقنيات الثقافة الخلايا القياسية. تغيير الوسائط على الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام. تضمين المضادات الحيوية اختيار المناسبة، مثل 250 ميكروغرام / مل من G418 في وسائل الإعلام.
    1. لتوفير عدد كاف من الخلايا أسبوعيا للتجارب، والحفاظ على الخلايا في قوارير T75. البذور 6 X 106 خلايا في T75 في 10 مل من وسائل الإعلام عادة ما تسفر عن 30 X 106 إلى 40 X 106 خلايا المجموع لكل T75 بعد 7 أيام من الثقافة.
  2. لإعداد الخلايا للتصفيح في لوحات 96 جيدا، وغسل T75 confluent من InsGLuc الخلايا MIN6 مرتين مع PBS وإضافة 2 مل من التربسين. يُحتجّ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبًا أو حتى تُنفصل الخلايا عن القارورة. تحديد تركيز الخلية لكل ملليلتر.
    1. تمييع الخلايا في وسائط كاملة إلى 1 × 106 خلايا / مل لينتج عن 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة 96 جيدا. يجب أن تكون الخلايا مُتَقَدَّة ً كافية للإجراء بعد 3-4 أيام.
      ملاحظة: لتمديد فترة الثقافة، يمكن أن يكون نصف تركيز الخلية مطلي. لا يلزم إجراء تغييرات في وسائل الإعلام قبل يوم الاختبار ما لم تخضع الخلايا لعلاجات تجريبية.

3. الجلوكوز حفز الشاشي لوسيفيراز إفراز فحص

  1. في يوم الاختبار إعداد ما يكفي KRBH للتجربة (الخطوة 1.2). ويلزم بحد أدنى 50 مل من KRBH لكل لوحة 96 بئر، وبالتالي إعداد ما لا يقل عن 75 مل لضمان وجود مخزن مؤقت كاف للتجربة. إعداد العازلة إضافية إذا تركيبات مختلفة من حالات العلاج من المخدرات سوف تتطلب KRBH لتخفيف.
  2. إعداد خزان مع KRBH خالية من الجلوكوز. انزع العلبة المتوسطة من لوحة (صات) 96 جيدا عن طريق عكس بسرعة لوحة على بالوعة مختبر ثم وصمة عار بحزم على كومة من المناشف الورقية لإزالة المتوسطة الزائدة.
  3. باستخدام إما ماصة إلكترونية أو يدوية من 8 قنوات، ماصة 100 ميكرولتر /جيداKRBH من الخزان عبر لوحة (صات) 96 بئر. كرر ما مجموعه اثنين من البواز.
  4. (خطوة اختيارية من العلاجات المركبة الحادة) إذا لم يتم إجراء العلاجات الدوائية، انتقل مع الخطوتين 3.5 و 3.6 دون تعديل. لاختبار آثار الجزيئات الصغيرة على إفراز الأنسولين، يمكن إضافة المركبات إلى الخلايا خلال فترة الحضانة، فترة التحفيز، أو كليهما.
    1. إحدى التقنيات هي إضافة مركبات دفعة إلى KRBH في أنابيب 1.5 مل واستخدام ماصة رقمية 8 قنوات قابلة للتعديل لنقل المخدرات-KRBH من الأنابيب إلى الخلايا في لوحات 96 بئر.
      ملاحظة: إذا لم تتوفر ماصة قابلة للتعديل، يمكن إجراء طبق طبق من 96 بئر من عقار-KRBH ويمكن استخدام ماصة قياسية من 8 قنوات لنقل المخزن المؤقت. ويمكن إجراء تعديلات أخرى على نموذج العلاج لعلاج الخلايا لمدة 24 ح في وسائل الإعلام قبل الفحص، كما سبق وصفه1،8.
  5. أضف 100 ميكرولتر من KRBH تحتوي على التركيز المطلوب من الجلوكوز أو المركبات ووضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: اعتمادا ً على التخطيط التجريبي، من المفيد للغاية أن يكون لديك ماصة إلكترونية متعددة القنوات تسمح بانتقال مسافات القناة من عمود من ثمانية أنابيب 1.5 مل إلى الصفوف 8 من لوحة 96 بئر.
  6. بعد 1 ساعة من preincubation، decant العازلة في الحوض وصمة عار بحزم على منشفة ورقية. أضف 100 لتر من KRBH خالية من الجلوكوز في البئر لغسل الخلفية المتراكمة من لوسيفيراز غوسيا. قم بإزالة اللوحة مرة أخرى وأضف التحكم والظروف المحفزة إلى اللوحة بمعدل 100 ميكرولتر لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  7. قم بتحصيل 50 ميكرولتر من الماصة باستخدام ماصة متعددة القنوات، وتغيير النصائح بين ظروف العلاج حسب الضرورة، ونقل الـ supernatant إلى طبق فحص أبيض غير شفاف نظيف 96- بئر.
    ملاحظة: يمكن استخدام لوحات بيضاء الجدران واضحة القاع إذا لزم الأمر، على الرغم من أن كمية كبيرة من إشارة لوسيفيراز سوف تضيع.
  8. بعد جمع 50 ميكرولتر من KRBH supernatant، يمكن فحص العينة على الفور. إذا لزم الأمر، وختم وتخزين عينات في 4 درجة مئوية لبضعة أيام (GLuc النشاط نصف العمر ~ 6 أيام) أو -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد11،12.

4. فرزها كاسيا لوسيفيراز

  1. لإعداد حل عمل سعر التسوية GLuc، ماصة الكمية المطلوبة من محلول مخزون CTZ (4.2 ميكرولتر/مل) في مخزن حصر GLuc المؤقت. لمنع ارتفاع درجة حرارة CTZ، ماصة CTZ بسرعة في -80 درجة مئوية الفريزر أو إبقاء الأنبوب على الجليد الجاف.
  2. باستخدام ماصة إلكترونية متعددة القنوات، قم بسرعة بإضافة 50 ميكرولتر من محلول GLuc للتسوية في البئر عبر طبق 96 جيداً الذي يحتوي على النانانات KRBH المجمعة. إذا كان هناك أي قطرات على جانبي أي آبار، تدور لفترة وجيزة لوحة في طاولة أعلى سوينغ دلو الطرد المركزي.
  3. قراءة الإضاءة في قارئ لوحة مناسبة في غضون بضع دقائق وقراءة كل بئر مع 0.1 ق وقت التكامل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقياس أداء الفحص تحت ظروف التحكم، يمكن الانتهاء من منحنى جرعة استجابة الجلوكوز بسيطة أو التحفيز باستخدام نموذج ديازوكسيد. في حالة الأولى، قبل الاحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في ظروف خالية من الجلوكوز تليها علاج ل1 ح مع زيادة تركيزات الجلوكوز ينبغي أن يؤدي إلى نشاط إفرازي قليلة جدا في وأقل من 5 mM، في حين لوحظ تفرز زيادة أعلاه 8 الغلوكوز mm (الشكل 2). التحفيز مع 35 m KCl كما بمثابة السيطرة الإيجابية لإفراز حفز. يجب أن يعطي إدراج الأدوية التي تعدل إفراز خلال فترة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم هنا طريقة لتقييم استجابات إفراز الأنسولين المحفز للجلوكوز بسرعة من خلايا MIN6 β. للحصول على أفضل الردود في القياس من المهم أن البذور الخلايا MIN6 في الكثافة المناسبة والسماح لهم أن تصبح 85-95% confluent. وهذا يحسن الاستجابات الخلية β للجلوكوز بسبب تحسن اتصالات الخلية الخلوية والتزامن، والذي يحدث على حد سواء في الجزر الأولية17،18،19،20،21 وكذلك MIN6 الخلاي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويشكر المؤلفون جميع الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر كوب على العمل والمناقشات القيمة، وديون وير على المساعدة الإدارية. مايكل كالوات مدعوم من مؤسسة أبحاث مرض السكري للأحداث SRA-2019-702-Q-R. وقد أصبح هذا العمل ممكنا من خلال المعاهد القومية للصحة R37 DK34128 ومؤسسة ويلش منحة I1243 إلى ميلاني كوب. كما تم دعم الأجزاء الأولى من هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة FK100113 لمايكل كالوات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوية>مواد زراعة الخلايا< / قوية>
rIns-GLuc خلاياخط خلية MIN6 الأبوية يعبر بثبات عن pcDNA3.1 + rInsp-Ins-eGLuc ويتم الحفاظ عليها في 250 ميكروغرام / مل G418
DMEMSigmaD64294.5 جم / لتر وسائط الجلوكوز
مصل الأبقار الجنين ، معطلالحرارة SigmaF4135
البنسلين / ستربتومايسينثيرمو فيشر ساینتفيكSV30010
بيتا ميركابتو إيثانولثيرمو فيشر العلميBP 176-100
الجلوتامينثيرمو فيشر العلميBP379-100
التربسين-EDTAسيجماT3924-500
G418الذهب التكنولوجيا الحيويةG418-10محلول مخزون 250 مجم / مل في الماء. قم بتجميد الحصص عند -20 درجة مئوية.
قوارير زراعة الأنسجة T75فيشر ساينتفيك07-202-000
96 لوحة زراعة أنسجة الآبارخزانات229196
Celltreat (50 مل)كورنينج4870
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
<قوي > كواشف فحص الإفراز < / قوي >
BSA (درجة RIA)Thermo-Fisher Scientific50-146-952
D- (+) -GlucoseSigmaG8270-1KG
KClThermo-Fisher ScientificP217-500
NaClThermo-Fisher ScientificS271-3
Hepes ، درجة الحموضة 7.4Thermo-Fisher Scientific50-213-365
NaHCO3Thermo-Fisher Scientific15568414
MgCl2Thermo-Fisher ScientificM9272-500G
CaCl2SigmaC-7902
NameCompany<قوي>رقم الكتالوجتعليقات
الأدوية الاختيارية لتجارب التحفيز
ديازوكسيدSigmaD9035محلول المخزون: 50 ملي مولار في 0.1N هيدروكسيد الصوديوم. أضف كمية متساوية من 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك إلى أي مخزن مؤقت يضاف فيه الديازوكسيد.
الأدرينالين (ملح البيترات)SigmaE4375محلول المخزون: 5 ملي مولار في الماء
PMA (phorbol 12-myristate)SigmaP1585محلول المخزون: 100 & micro ؛ M في DMSO
strong>NameCompany Catalog NumberComments
Guassia assay materials
disodium phosphate (Na2HPO4)Thermo-Fisher ScientificS374-500
الجلسرينثيرمو فيشر ScientificG334
بروميد الصوديومThermo-Fisher ScientificAC44680-1000
EDTAThermo-Fisher ScientificAC44608-5000محلول المخزون: 0.5 م درجة الحموضة 8
قاعدة تريسRPIT60040-1000.0محلول المخزون: 1 م درجة الحموضة 8
حمض الأسكوربيكفيشر AAA1775922العلمياقترحت براءات الاختراع الأمريكية US7718389 أن الأسكوربات يمكن أن يزيد من استقرار coelenterazine.
Na2< / sub>SO3< / sub>براءات الاختراع الأمريكية US8367357 قد يقلل الكبريتيت المقترح من الخلفية بسبب BSA
Coelenterazine (أصلي)Nanolight / Prolume3035MGمحلول المخزون: 1 مجم / مل في MeOH المحمض (2.36 ملم)
OptiPlate-96 ، أبيض غير شفاف 96 بئر MicroplatePerkinElmer 6005290يجب أن تكون أي صفيحة بئر بيضاء غير شفافة 96 كافية. ستعمل الألواح السفلية الشفافة أيضا ، ولكن ستفقد بعض الإشارات.
nameCompany Catalog NumberComments
Equipment
Synergy H1 قارئ لوحة هجين أو ما يعادلهBioTek8041000مطلوب قارئ لوحة مزود بكشف اللمعان وإمكانيات لوحة 96 بئرا.
ماصة VOYAGER ذات 8 قنوات (50-1250 & micro; L)Integra4724الماصة الآلية متعددة القنوات مفيدة للغاية للإضافة السريعة لكواشف اللوسيفيراز وخلايا الطلاء في 96 بئر
8 قنوات 200 وميكرو ؛ L ماصةترانسفيربت S 20-200 & مايكرو; L2703710
MIN6 مستقرة كاشف <

المراجع

  1. Kalwat, M. A., et al. Insulin promoter-driven Gaussia luciferase-based insulin secretion biosensor assay for discovery of beta-cell glucose-sensing pathways. ACS Sensors. 1 (10), 1208-1212 (2016).
  2. Burns, S. M., et al. High-throughput luminescent reporter of insulin secretion for discovering regulators of pancreatic Beta-cell function. Cell Metabolism. 21 (1), 126-137 (2015).
  3. Rajan, S., et al. In vitro processing and secretion of mutant insulin proteins that cause permanent neonatal diabetes. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (3), E403-E410 (2010).
  4. Watkins, S., et al. Imaging Secretory Vesicles by Fluorescent Protein Insertion in Propeptide Rather Than Mature Secreted Peptide. Traffic. 3 (7), 461-471 (2002).
  5. Welsh, J. P., Patel, K. G., Manthiram, K., Swartz, J. R. Multiply mutated Gaussia luciferases provide prolonged and intense bioluminescence. Biochemical Biophysical Research Communications. 389 (4), 563-568 (2009).
  6. Tannous, B. A., Kim, D. E., Fernandez, J. L., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo. Molecular Therarpy. 11 (3), 435-443 (2005).
  7. Compounds and methods for regulating insulin secretion. World patent. , WO2018175324A1 (2018).
  8. Kalwat, M. A., et al. Chromomycin A2 potently inhibits glucose-stimulated insulin secretion from pancreatic beta cells. Journal of General Physiology. , (2018).
  9. Luft, C., et al. Application of Gaussia luciferase in bicistronic and non-conventional secretion reporter constructs. BMC Biochemistry. 15 (1), 14(2014).
  10. Ohmiya, Y., Wu, C. Stabilizing composition and stabilizing method of coelenterazine solution for high-throughput measurement of luciferase activity. U.S. Patent. , 7,718,389 B2 (2010).
  11. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (4), 582-591 (2009).
  12. Wurdinger, T., et al. A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes. Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).
  13. Henquin, J. C. Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes. 49 (11), 1751-1760 (2000).
  14. Mourad, N. I., Nenquin, M., Henquin, J. C. Amplification of insulin secretion by acetylcholine or phorbol ester is independent of beta-cell microfilaments and distinct from metabolic amplification. Molecular & Cellular Endocrinology. 367 (1-2), 11-20 (2013).
  15. Straub, S. G., Sharp, G. W. Evolving insights regarding mechanisms for the inhibition of insulin release by norepinephrine and heterotrimeric G proteins. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 302 (12), C1687-C1698 (2012).
  16. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  17. Head, W. S., et al. Connexin-36 Gap Junctions Regulate In Vivo First- and Second-Phase Insulin Secretion Dynamics and Glucose Tolerance in the Conscious. Diabetes. 61 (7), 1700-1707 (2012).
  18. Benninger, R. K. P., Head, W. S., Zhang, M., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junctions and other mechanisms of cell-cell communication regulate basal insulin secretion in the pancreatic islet. The Journal of Physiology. 589 (22), 5453-5466 (2011).
  19. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129 (2), 359-370 (2007).
  20. Jaques, F., et al. Dual effect of cell-cell contact disruption on cytosolic calcium and insulin secretion. Endocrinology. 149 (5), 2494-2505 (2008).
  21. Calabrese, A., et al. Connexin 36 Controls Synchronization of Ca2+ Oscillations and Insulin Secretion in MIN6 Cells. Diabetes. 52 (2), 417-424 (2003).
  22. Bielefeld-Sevigny, M. AlphaLISA immunoassay platform- the "no-wash" high-throughput alternative to ELISA. Assay and Drug Development Technologies. 7 (1), 90-92 (2009).
  23. Aslanoglou, D., George, E. W., Freyberg, Z. Homogeneous Time-resolved Forster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
  24. Rafati, A., Zarrabi, A., Abediankenari, S., Aarabi, M., Gill, P. Sensitive colorimetric assay using insulin G-quadruplex aptamer arrays on DNA nanotubes coupled with magnetic nanoparticles. Royal Sociecy Open Science. 5 (3), 171835(2018).
  25. Hulleman, J. D., Brown, S. J., Rosen, H., Kelly, J. W. A high-throughput cell-based Gaussia luciferase reporter assay for identifying modulators of fibulin-3 secretion. Journal of Biomolecular Screening. 18 (6), 647-658 (2013).
  26. Frank, J. A., et al. Optical tools for understanding the complexity of beta-cell signalling and insulin release. Nature Reviews Endocrinology. 14 (12), 721-737 (2018).
  27. Zhu, S., et al. Monitoring C-Peptide Storage and Secretion in Islet beta-Cells In Vitro and In Vivo. Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قياس إفراز الأنسولين النسبي باستخدام بديل لوسيفيراز المفرز
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.