مقالة منهجية

تعديل التعريب تاو Subcellular كاداه للتحقيق في التعبير عن الجينات المرتبطة بالمرض

DOI:

10.3791/59988

⸱

ديسمبر 20, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاو هو بروتين الخلايا العصبية الموجودة علي حد سواء في السيتوبلاسما ، حيث انه يربط الأنابيب الدقيقة ، وفي النواة ، حيث يمارس وظائف غير تقليديه بما في ذلك تحوير الجينات المرتبطة بمرض الزهايمر. هنا ، ونحن وصف طريقه للتحقيق في وظيفة تاو النووية في حين استبعاد اي تدخلات قادمه من السيتوبلازمي تاو.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تاو هو بروتين ملزم ميكروتوبولي المعرب عنها في الخلايا العصبية ويرتبط وظيفتها الرئيسية المعروفة للحفاظ علي الاستقرار خلوي. ومع ذلك ، أشارت الادله الاخيره إلى ان تاو موجود أيضا في مقصورات فرعيه أخرى بما في ذلك النواة حيث انها متورطة في حماية الحمض النووي ، في النسخ rRNA ، في حركه الرجعية وفي التنظيم الهيكلي لل نويه. وقد أظهرنا مؤخرا ان تاو النووية تشارك في التعبير عن جين VGluT1 ، مما يوحي بوجود اليه الجزيئية التي يمكن ان تفسر الزيادة المرضية من الإفراج الغلوتامات في المراحل المبكرة من مرض الزهايمر. حتى وقت قريب ، كانت مشاركه تاو النووية في تحوير التعبير عن الجينات المستهدفة غير مؤكده نسبيا وغامضه بسبب القيود التقنية التي منعت استبعاد مساهمه السيتوبلازمية تاو أو تاثير الأخرى عوامل المصب غير المرتبطة بالنووية تاو. للتغلب علي هذا الشك ، قمنا بتطوير طريقه لدراسة التعبير عن الجينات المستهدفة التي يتم تضمينها علي وجه التحديد من قبل بروتين تاو النووي. استخدمنا بروتوكولا ان الأزواج استخدام إشارات التعريب وتجزئه سوبسيلولار ، مما يسمح باستبعاد التدخل من جزيئات تاو سيتوبلازمي. والاهم من ذلك ، ان البروتوكول سهل ويتالف من أساليب كلاسيكية وموثوقه يمكن تطبيقها علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى والظروف الخلوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد اكتسبت وظائف بروتين تاو في النواة اهتماما كبيرا في السنوات الاخيره ، حيث ثبت انها ترتبط ارتباطا وثيقا بالأحماض النووية1،2،3،4،5،6. وفي الواقع ، أظهرت دراسة أجريت مؤخرا علي نطاق الجينوم ان تاو تربط متواليات الحمض النووي الوراثية والجينية في الجسم الحيوي7. وقد اقترح دور في نوكليولار منظمه8و9و10و11. وعلاوة علي ذلك, وقد اقترح تاو لتكون متورطة في حماية الحمض النووي من الاكسده وفرط الضغط المفرط5,10,12,13, في حين تم ربط المتحول تاو إلى عدم استقرار الكروموسوم و صيغه الصبغيه14,15,16.

حتى الآن ، ظلت التحديات في دراسة وظائف تاو في المقصورة النووية دون حل تقريبا بسبب الصعوبات في تشريح مساهمه محدده من تاو النووية من مساهمه السيتوبلازمية تاو. وعلاوة علي ذلك ، فان الوظائف المنسوبة إلى جزيئات تاو في المقصورة النووية ، حتى الآن ، ليست سوي صله نسبيه لأنها تفتقر إلى دليل قاطع علي المشاركة المباشرة لبروتينات تاو النووية. وفي الواقع ، فان مشاركه تاو في التنقل من الرجعية أو في النسخ rrna أو في حماية الحمض النووي11،12،17،18،19 يمكن ان تفسر أيضا من خلال مساهمه الخلوية تاو أو تاثير العوامل الأخرى المصب غير المرتبطة تاو النووية.

هنا ، ونحن نقدم طريقه التي يمكن ان تحل هذه المسالة عن طريق استغلال الإجراءات الكلاسيكية لعزل المقصورة النووية مع استخدام يبني تاو 0N4R الموسومة التعريب النووي (NLS) أو إشارات التصدير النووية (NES). هذا النهج يلغي القضايا المعقدة المتعلقة بالمصنوعات اليدوية المحتملة بسبب امتداد جزيئات تاو من المقصورة السيتوبلازمية. وعلاوة علي ذلك ، فان بناء تاو-NLS و Tau-NES يحفز علي إثراء أو استبعاد جزيئات تاو من المقصورة النووية ، علي التوالي ، مما يوفر ضوابط ايجابيه وسلبيه لاشراك جزيئات تاو النووية في وظيفة محدده. والبروتوكول سهل من الناحية التقنية وهو يتالف من أساليب تقليديه وموثوق بها تنطبق علي نطاق واسع لدراسة الوظيفة النووية لتاو في أنواع الخلايا الأخرى ، المتمايزة ام لا ، مثل الخلايا السرطانية التي تعيد تنشيط تعبير تاو20،21. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا علي البروتينات الأخرى الموجودة في كل من السيتوبلاسما والنواة من أجل تشريح الوظائف البيولوجية المتعلقة بالمقصورات المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة الخلية

  1. الثقافة SY5Y الخلايا (خط خليه الورم الارومي العصبي البشري ، CRL-2266) في المتوسط الكامل (النسر المعدل دولبيكو المتوسطة: خليط المغذيات F12 [DMEM/F-12] تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية ، 2 ملم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين). الحفاظ علي الخلايا في حاضنه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. تنمو الخلايا في لوحات 10 سم والانقسام عند متموج.

2. تمايز الخلايا

  1. لتفريق الخلايا SY5Y ، في اليوم التالي للطلاء ، أضافه 10 μM حمض الريتينويك (RA) لإكمال المتوسطة لمده 5 أيام.
  2. اليوم السادس استبدال المتوسطة مع التمايز المتوسطة: DMEM/F-12 تستكمل مع 50 ng/mL BDNF ، 2 مم L-الجلوتامين. لا تقم باضافه المضادات الحيوية.
  3. تنمو الخلايا في وسط التمايز لمده 3 أيام.

3. تشيريك يبني الاستنساخ

  1. توليد تاو-nls بناء عن طريق الاستنساخ عن طريق الهضم الانزيم تقييد في الإطار في 3 ' نهاية تاو تسلسل 0n4r (383aa) 3xNLS (SV40NLS): 5 '-ccaaaaaaggagaaagaggagaaagaggagaagggatagagاجياغاججاجااجااغاجيغاجيجاغاتاج
    ملاحظه: يتم استنساخ 3xNLS في 3 ' نهاية تاو في البلازما pCMV-تاو للتعبير الثدييات استغلال مواقع تقييد XhoI و BamHI في موقع متعدد الاستنساخ (الاشراف).
  2. توليد تاو-نيس بناء عن طريق الاستنساخ عن طريق الهضم الانزيم تقييد في الإطار في 3 ' نهاية تاو تسلسل 0N4R (383aa) التسلسل نيس: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTAAGAGTTTGGATCTCGTACNRTCT.GT1 '.
    ملاحظه: يتم استنساخ NES في 3 ' نهاية تاو في البلازميد pcmv-تاو للتعبير الثدييات استغلال المواقع التقييد ecori و bamhi في الاشراف علي الاشراف الذاتي.
  3. تحويل DH5alpha e. القولونية سلاله مع 100 ng من الحمض النووي من الخطوة 3.1 أو 3.2 وخلايا لوحه علي لوحات LB-أجار مع 100 ملغ/مل ampicillin. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  4. اختيار مستعمره واحده وارتفاع الخلايا إلى 5 مل من LB مع الامبيسلين. السماح للخلايا تنمو في 37 درجه مئوية في الانفعالات بين عشيه وضحيها.
  5. استخراج البلازميد مع miniprep الحمض النووي (جدول المواد) وتسلسل للتحقق من الثوابت.
  6. تحويل DH5alpha القولونية سلاله مع ثوابت التحقق من تسلسل وخلايا لوحه علي لوحات LB-أجار مع الامبيسيلين. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  7. اختيار مستعمره واحده وارتفاع الخلايا إلى 5 مل من LB مع الامبيسلين. السماح للخلايا تنمو في 37 درجه مئوية في الانفعالات ل 2 ح.
  8. وضع الخلايا من الخطوة 3.7 في 200 مل من LB مع الامبيسلين. دعوانا تنمو بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
  9. بيليه الخلايا في 3,500 x g لمده 10 دقيقه في 4 °c.
  10. استخراج البلازميد مع الحمض النووي maxiprep (جدول المواد).

4-الخلية الناقلة

  1. البذور 400,000 الخلايا من الخطوة 1.1 في لوحات 6-حسنا أو 20,000 الخلايا في 8-بئر الشرائح الغرفة. لوحه أربع عينات: خلايا التحكم ليتم نقلها مع ناقل فارغ, الخلايا التي يتم نقلها مع تاو غير الموسومة, الخلايا التي يتم نقلها مع تاو-NLS والخلايا التي يتم نقلها مع تاو-نيس.
  2. اليوم بعد البذر transfect 400 ng من الحمض النووي لكل بئر باستخدام الدهون موجب (جدول المواد) في لوحات6-حسنا أو 200 ng من الحمض النووي لكل بئر لشرائح 8-بئر الغرفة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. احتضان الحمض النووي والدهون موجب بشكل منفصل في 250 μl (للوحات 6-حسنا) أو 25 μl (لشرائح 8-بئر الغرفة) من المتوسط مصل مخفضه لمده 5 دقائق في RT. ثم الجمع بينهما لتوليد مجمع الحمض النووي والدهون واحتضان لمده 20 دقيقه.
    2. استبدلت الثقافة وسط مع 2 [مل] (ل [6-وست] لوحات) أو 250 μL (ل [8-ول] غرفه منزلقات) من طازجه ثقافة كامله متوسطه. أضافه مجمع الحمض النووي الدهني إلى الخلايا واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
  3. بدلا من ذلك ، transfect الحمض النووي مع الكاشف موجب بوليثيلينمين (PEI).
    1. اخلط 2 ميكروغرام من الحمض النووي و 6 μL من PEI مع 200 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة (لكل بئر في لوحات 6-حسنا) ، أو 1 ميكروغرام من الحمض النووي و 3 μL من PEI مع 100 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة (لكل بئر في الشرائح 8-بئر الغرفة) والدوامة واحتضان لمده 10 دقيقه في RT.
    2. أضافه المزيج إلى الخلايا وأضافه 1.8 mL من الثقافة الكاملة المتوسطة في بئر في 6 لوحات جيدا أو 150 μL من الثقافة الكاملة المتوسطة في بئر في 8-بئر الشرائح الغرفة للوصول إلى حجم الطلاء.
  4. تغيير متوسط اليوم بعد التحويل وأضافه وسائط التمايز كما هو موضح في الخطوة 2.2.

5. المناعي

  1. أزاله الثقافة المتوسطة وشطف الخلايا مع 1x تلفزيوني. إصلاح الخلايا مع 100 ٪ الميثانول الجليد الباردة لمده 3 دقائق دون اهتزاز. أزاله حل إصلاح ويغسل لفتره وجيزة مع 1x تلفزيوني.
  2. بيركابايز مع 0.1 ٪ غير الايونيه السطحي في 1x تلفزيوني لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة (RT). لفتره وجيزة ، وغسل مع 1x تلفزيوني ، 3 مرات.
  3. احتضان الخلايا مع حجب العازلة (0.1 ٪ توين 20 و 1 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية) لمده 30 دقيقه في RT علي شاكر المدارية.
  4. احتضان مع الأجسام المضادة الاساسيه المناسبة (علي سبيل المثال ، الأجسام المضادة لTau13 الماوس الاحاديه) المخفف 1:500 في حجب العازلة بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية علي شاكر المدارية. أزاله حل الأجسام المضادة ويغسل ، لفتره وجيزة ، مع 1x تلفزيوني.
  5. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى فلوكوفيري (علي سبيل المثال ، الأجسام المضادة لمكافحه الماوس الماعز مترافق إلى اليكسا فلور 633) المخفف 1:500 في حجب العازلة ل 1 ح في RT. أزاله حل الأجسام المضادة ويغسل لفتره وجيزة مع 1x تلفزيوني 3 مرات.
  6. إلى النوى وصمه عار ، احتضان مع DAPI المخفف 1:20000 في حجب العازلة لمده 10 دقيقه في RT. غسل مع 1x تلفزيوني 3 مرات. جبل الشفتين علي شريحة باستخدام اللورن المتوسطة المتصاعدة.

6. لطخه الغربية

  1. لجمع بيليه الخلية من الخطوة 4.4 ، وأزاله المتوسطة ، وغسل الخلايا مع تلفزيوني. احتضان مع 500 μL من 0.1 ٪ التربسين لمده 4 دقائق في 37 درجه مئوية. أضافه وحده تخزين متساوية المتوسطة الكاملة وأعاده تعليق الخلايا.
  2. جمع الخلايا في أنبوب والطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق. في نهاية طرد أزاله بعناية supernatant. أضافه 1 مل من تلفزيوني ، جهاز الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق وأزاله بعناية supernatant. تخزين كريات الخلايا علي الجليد للاستخدام الفوري أو تجميد في-80 درجه مئوية للتخزين علي المدى الطويل.
  3. لمستخلصات البروتين الكلي ، احتضان بيليه الخلية لمده 30 دقيقه علي الجليد في تحلل العازلة (20 مم تريس-HCl pH 8 ، 20 مم كلوريد الصوديوم ، 10 ٪ الجلسرين ، 1 ٪ اوكتيلفينوكسي بولي (ايثيل نياوكسي) الايثانول ، متفرعه (جدول المواد) ، 10 مم أدتا) تكمله مع الانزيم البروتيني ومثبطات الفوسفاتيز. وفقا لوفره من بيليه ، استخدم 50 μL إلى 100 μL من المخزن المؤقت تحلل.
    1. الطرد المركزي استخراج في 16,000 x g لمده 15 دقيقه جمع ماده طافي وتحديد تركيز البروتين من قبل اي فحص القياس الكمي القياسية. اعداد عينات البروتين لل SDS-PAGE عن طريق خلط 20 ميكروغرام من البروتينات مع 5 μL من 4x العازلة Laemmli في حجم إجمالي من 20 μL ويغلي عند 100 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
      ملاحظه: يمكن تخزين العينة عند-20 درجه مئوية.
  4. بالنسبة لعمليات التجزئة الفرعية ، أعاده تعليق الخلايا من الخطوة 6.2 في وسط كامل ، وجمع 1 × 106 خلايا لكل عينه. جهاز الطرد المركزي في 500 x g ل 10 دقيقه للحصول علي كريات الخلية للخطوات التالية.
    1. لعزل المقصورات شبه الخلوية ، فرااكتينات وفقا لمواصفات عده. لعزل كل كسر ، احتضان الخلية بيليه من الخطوة 6.4 مع العازلة المقابلة ، الطرد المركزي ، وجمع ماده طافي وأضافه المخزن المؤقت التالي إلى بيليه كما هو موضح في 6.4.1.1-6.4.1.5. أضافه في النظام العازلة استخراج سيتوبلازمي ، غشاء العازلة استخراج ، العازلة النووية استخراج ، المخزن المؤقت استخراج النووية تستكمل مع 5 مم cacl2 و 3 U/μl ميكروكوككال النيوداز و خلوي استخراج العازلة.
      ملاحظه: يجب ان تستكمل جميع المخازن المؤقتة مع مثبطات الانزيم البروتيني. حجم وحدات تخزين المخزن المؤقت وفقا لحجم الخلية بيليه.
      1. لعزل الكسر السيتووليك ، الكريات الخلية حضن في 100 μl من الجليد الباردة العازلة استخراج سيتوبلازمي تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني في 4 درجه مئوية مع خلط لطيف لمده 10 دقيقه. الطرد المركزي في 500 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ونقل ماده طافي لأنابيب ما قبل المبردة.
      2. أضافه 100 μL من المخزن المؤقت استخراج غشاء الجليد الباردة تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.1 ، واحتضان في 4 درجه مئوية مع خلط لطيف لمده 10 دقيقه. أجهزه الطرد المركزي في 3,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق وجمع supernatant.
      3. لكسر النووية القابلة للذوبان ، أضافه 50 μL من العازلة استخراج النووية تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.2 ، ودوامه. احتضان في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه ، جهاز الطرد المركزي في 5,000 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، وجمع supernatant.
      4. لكسر النووية غير قابله للذوبان ، أضافه 50 μL من العازلة استخراج النووية تستكمل مع مثبطات البروتياز ، CaCl2 و micrococcal النيوداز إلى بيليه من الخطوة 6.4.1.3 ، ودوامه. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق ، ومن ثم دوامه مره أخرى. جهاز الطرد المركزي في 16,000 x g في RT لمده 5 دقائق وجمع supernatant.
      5. لكسر خلوي ، أضافه 50 μl من العازلة استخراج خلوي تستكمل مع مثبطات الانزيم البروتيني لبيليه من الخطوة 6.4.1.4 ، ودوامه. احتضان 10 دقيقه في RT. الطرد المركزي أنبوب في 16,000 x g لمده 5 دقائق ، وجمع ماده طافي وتجاهل بيليه.
        ملاحظه: حجم وحدات تخزين المخزن المؤقت وفقا لحجم الخلية ، كما هو موضح في بروتوكول مجموعه الاداات. الرجوع إلى بروتوكول عده للحصول علي مزيد من التفاصيل حول الحضانة و طرد الوقت ودرجه الحرارة22،23،24،25،26،27،28،29. بدلا من ذلك ، استخدم اي من الطرق القياسية30 التي ، باستخدام المنظفات وزيادة القوه الايونيه وسرعه طرد ، يفصل السيتووليك ، الغشاء المنضم ، السيتوكيلميتال والكسور النووية. الفصل بين الكسر النووي القابل للذوبان والكسر النووي الذي لا يمكن ذوبانه عن طريق استغلال مخازن الاستخراج النووي القياسية. يمكن تخزين العينة عند-20 درجه مئوية.
    2. ل SDS-الصفحة ، أضافه 7 μL من 4x العازلة Laemmli إلى 20 μL من الكسور الخلوية التي تم الحصول عليها من الخطوات 6.4.1.1 − 6.4.1.5 ، يغلي عند 100 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  5. تحميل عينات علي هلام اكريلاميد وأداء الكهربائي في الجهد المستمر من 120 V. نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز في 250 mA لمده 90 دقيقه.
  6. تحقق السليم الكهربائية هلام البروتين والناجحة التنقيط من خلال احتضان الغشاء لمده 5 دقائق في الحل بونسو تلطيخ. شطف الغشاء في الماء المقطر حتى الخلفية نظيفه. أزاله وصمه عار من خلال مواصله الغسيل مع تريس المالحة مخزنه مع توين 20 (TWEEN) لمده 10 دقيقه علي شاكر.
  7. احتضان الغشاء مع حل الحجب (5 ٪ الحليب في TBST) لمده 1 ساعة في RT علي شاكر. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  8. تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الاساسيه في محلول الحجب (1 ٪ حليب في TBST) بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  9. تهجين الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الشكل في المحلول المانع لمده 1 ساعة في RT. اغسل 3 مرات مع TBST لمده 5 دقائق.
  10. الكشف عن الشريط البروتين باستخدام التلالؤ الكيميائي. قياس كثافة الشرائط الغربية لطخه من قبل ImageJ. تطبيع التعبير البروتين علي المنتج من الجينات التدبير المنزلي: هيستون H2B لكسر النووية القابلة للذوبان وغير قابله للذوبان ، جابده لكسر سيتوبلاسولي والمقتطفات الاجماليه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تصوير الاستراتيجية المستخدمة لتشريح تاثير النووية تاو في التعبير الجيني تجنب مساهمه بروتينات تاو السيتوبلازمي في الشكل 1. لفتره وجيزة ، يتم تجميع البروتينات تاو الموسومة NLS أو NES في أو مستبعده من المقصورة النووية ، علي التوالي. والأثر الوظيفي لهذا العدم التوازن هو تغيير التعبير الجيني مقيسا كنتاج لجين VGluT1.

بعد وصف البروتوكول ، تم التعامل مع الخلايا SY5Y مع RA لمده 5 أيام ومن ثم مع BDNF ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نوضح طريقه لقياس تاثير بروتين تاو النووي علي التعبير الجيني. مع هذا بروتوكول المساهمة من [سيتوميك] [تاو] بقوة محدوده. الخطوات الهامه لهذا البروتوكول هي التالية: التفريق بين خلايا الورم الارومي العصبي البشري SY5Y ، والتجزئة تحت الخلوي وتوطين بروتين تاو في المقصورة النووية.

أولا ، كما هو مبين في قسم النتائج التمثيلية ، فان التفريق بين خلايا SY5Y عن طريق أضافه RA و BDNF أمر حاسم للحصول علي اعداد جيد للخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية في الثقافة. كثافة الخلايا المصنفة مهمة بشكل خاص لان الكثافة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المقدمة من "سكوولا نورمالي سوبريوري" (SNS14_B_DIPRIMIO ؛ SNS16_B_DIPRIMIO).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Alexa Fluor 633 الماعز المضاد للفأر IgGLife TechnologiesA21050IF 1: 500
مضاد للأجسام المضادة للأكتينBETHYL LABORATORIEA300-485Aمضاد للأرانب WB 1: 10،000
الأجسام المضادة ل GAPDHFitzgerald Industries International10R-G109aالمضادة للفأر WB 1: 10،000
المضاد ل H2B الأجسام المضادةAbcamab1790المضادة للأرانب WB 1: 15،000
الأجسام المضادة المضادةلسانتا كروزSC-21796المضادة للفأر WB 1: 1,000 ؛ إذا كان 1: 500
مضاد للتوبولين ألفا الأجسام المضادةالحرارية فيشر العلميPA5-16891المضاد للفأر WB 1: 5,000
الأجسام المضادة المضادة VGluT1سيجما-ألدريتشAMAb91041المضادة للفأر WB 1: 500
BCA مجموعة فحص البروتينEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404حليب جاف خالي الدسم
بوفين مصل الألبومينسيجما ألدريتشA4503-50g
أومبليت مينيروش11836170001مثبط البروتياز
معيار TGX 4-20٪ خالي من البقع ، 10 آباربيوراد5678093
DAPIثيرمو فيشر Scientific62247
DMEM / F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagleمتوسط منخفض الجلوكوزEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100 ملدرجة الحموضة = 8 ، 0.5 م
مصل الأبقار الجنينEurocloneEC50182L
الجلسرينسيجما ألدريتشG5516-500 مل
الماعز المضاد للفأر IgG-HPRسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2005WB 1: 1,000
الماعز المضاد للأرانب IgG-HPRسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-2004WB 1: 1،000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 بئر زجاج شريحةnunc 177402
L-glutamineEurocloneECB3000D100X
كاشف الليبوفيكتامين 2000 كاشفالترمو-فيشر العلمي12566014الموجبة
الميثانولسيجما-ألدريتش322415-6X1L
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM مصل منخفض متوسطGibco31985070
PEISigma-Aldrich40،872-7
Penicillin / StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210،000 وحدة / مل ، 100 مل
من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001مثبط الفوسفاتيز
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163الخطوة 3.10
حمض الريتينويكSigma-AldrichR2625-100mg
طقم تجزئة البروتين تحت الخلوي للخلايا المستنبتةThermo Fisher Scientific78840
غشاء النيتروسليلوز المدعومBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833،920
TCS SP2 مجهر متحد البؤر للمسح بالليزرLeicaN / A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlخافض للتوتر السطحي غير أيوني
Trypsin-EDTAThermo FisherScientific 154000540.50٪
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD مضاد للتلاشي تصاعد متوسطمختبرات ناقلاتH-1000
Wizard Plus < / em> SV Minipreps أنظمةتنقية الحمض النوويبروميجاA1330الخطوة 3.5
الدهون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91(2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70(2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577(2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1(2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SH SY5Y

مقالات ذات صلة