يقدم هنا إجراء خطوة بخطوة للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران عن طريق مباشرة داخل الرغامى السكاريد ولإجراء تحليل FACS عينات الدم، والسائل القصبات الهوائية، وأنسجة الرئة. الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقابلية للتكرار الجيد، ومعايرة شدة المرض هي مزايا هذا النهج.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إحداث إصابات الرئة الحادة في الفئران عن طريق التبيل المباشر للكيس الشحمي داخل الرغامى
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
إدارة مجرى الهواء من السكاريد (LPS) هو وسيلة شائعة لدراسة التهاب رئوي وإصابة الرئة الحادة (ALI) في النماذج الحيوانية الصغيرة. وقد وصفت نُهج مختلفة، مثل استنشاق الهباء الجوي وغرس الأنف أو داخل الرغامى. يصف البروتوكول المقدم إجراءً مفصلاً خطوة بخطوة لحث ALI في الفئران عن طريق تهيئة LPS داخل الرغامى مباشرة وإجراء تحليل FACS لعينات الدم، وسوائل غسل القصبات (BAL)، وأنسجة الرئة. بعد التخدير داخل الحَرَب، يتم تعريض القصبة الهوائية وتدار الـ LPS بواسطة قسطرة وريديّة 22 G. يتم التسبب في رد فعل التهابي قوي وقابل للتكرار مع غزو الكريات البيض ، وupregulation من السيتوكينات proinflammatory ، وتعطيل حاجز الحويفين الشعري في غضون ساعات إلى أيام ، اعتمادا على جرعة LPS المستخدمة. يتم وصف جمع عينات الدم، والسائل BAL، وحصاد الرئة، فضلا عن معالجة لتحليل FACS، بالتفصيل في البروتوكول. على الرغم من أن استخدام LPS المعقمة ليست مناسبة لدراسة التدخلات الدوائية في الأمراض المعدية، فإن النهج الموصوف يقدم الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، والقدرة على استنساخ جيدة للرد على الأسئلة المناعية الميكانيكية. وعلاوة على ذلك، فإن المعايرة بالتحليل الكيميائي للجرعة، فضلا عن استخدام الاستعدادات البديلة لـ LPS أو سلالات الماوس تسمح بتحوير الآثار السريرية، والتي يمكن أن تظهر درجات مختلفة من شدة ALI أو في وقت مبكر مقابل بداية متأخرة من أعراض المرض.
المقدمة
النماذج الحيوانية التجريبية لا غنى عنها في البحوث المناعية الأساسية. وقد استخدمت إدارة البكتيريا الكاملة أو المكونات الميكروبية في كثير من الأحيان في النماذج الحيوانية الصغيرة للحث على التهاب محلي أو نظامي1. Lipopolysaccharide (LPS، أو التوكسين البكتيري) هو مكون جدار الخلية ومستضد السطح من البكتيريا السالبة للجرام (على سبيل المثال، البكتيريا المعوية، الزائفة spp.، أو الفيلق spp.). يتكون الجزيء المستقرة بالحرارة والكبيرة (الوزن الجزيئي 1-4 × 106 kDa) من مويتي الدهون (الدهون A)، ومنطقة أساسية (oligosaccharide)، وO السكريات (أو مستضد). الدهون A، مع سلاسل الأحماض الدهنية المسعورة، يرسو الجزيء في غشاء بكتيري وتوسط (على تدهور البكتيريا) ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد وافقت اللجنة المحلية لرعاية الحيوانات على هذا البروتوكول (LANUV، ريكلينغهاوزن، ألمانيا؛ البروتوكول رقم 84-02.04.2015) وتم تنفيذه وفقاً للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة لاستخدام الحيوانات الحية (نشرالمعاهد الوطنية للصحة) )١٠( رقم ٨٥-٢٣، المنقح ١٩٩٦.
1. علي التعريفي
- استخدام الكبار C57BL/6 الفئران في سن 10-12 أسابيع. تُقام الحيوانات في أقفاص ذات تهوية فردية مع إمكانية الوصول المجاني إلى المياه وحساء القوارض القياسي. ومع ذلك، فمن الممكن لأداء هذا النهج على الحيوانات الأصغر سنا ومع سلالات الفئران الأخرى.
- مخزن LPS (الإشريكية القولونية O111: B4) في الأليقوات في تركيزات 5 ملغ / مل في -20 درجة مئوية. وبالنسبة للغرس داخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم التحقق من صحة النهج الموصوف للحث على ALI في الفئران عن طريق تقييم التعبير السيتوكين، وتسلل المحببات العدلية، وتعطيل حاجز الحويفيو الشعري 24 ساعة و 72 ساعة بعد غرس LPS. وكانت الحيوانات التي يتم حقنها من قبل PBS بمثابة عنصر تحكم. وقد تسببت إدارة LPS داخل الرغامى في استجابة قوية للالتهابات الرئوية. وقد تم تنظيم التعبير عن TNF-α في أنسجة الرئة بشكل ملحوظ، حيث وصل إلى زيادة مستمرة وأكثر من 50 ضعف مقارنة بالحيوانات المسيطرة [TNF-α/18s)؛ و24 ح: 53.7 (SD = 11.6)؛ 72 h: 55.0 (SD = 20.6)؛ p < 0.05)] (الشكل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الحد الأدنى من التوغل، والتعامل البسيط، وتكرار جيد هي السمات الرئيسية للنهج المقدم للحث على ALI في نموذج القوارض الصغيرة. استخدام LPS بدلا من البكتيريا كلها في النماذج الحيوانية له مزايا. وهو مركب مستقر ونقي ويمكن تخزينها في شكل الليوفيليز حتى الاستخدام. وهو منبه قوي للاستجابات المناعية الفطرية عبر مسار TLR4، ويمكن بسهولة قياس نشاطه البيولوجي، مما يسهل معايرة شدة المرض مع إمكانية استنساخ جيدة. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن استخدام LPS بمثابة نموذج آمن للحث على التهاب الشعب الهوائية الحاد في المتطوعين الأصحاء الإنسان، وبالتا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ويود المؤلفان أن يشكرا جان كلينر وسوزان شولتز على تقديم الدعم التقني. ويقر المؤلفون بالدعم الممتاز الذي يقدمه المرفق الأساسي للقياس الدفقي في كلية الطب بجامعة بون. ولم يتلق المؤلفون أي تمويل من أي منظمة خارجية. وقد سبق أن عرض جزء من البيانات الواردة في قسم النتائج والمبينة في الشكل 3 في منشور سابقرقم 8.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 مل محاقن | BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 300013 | |
| 10 مل محاقن | BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 309110 | |
| Anti-CD115 (c-fms) APC | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 17-1152-80 | |
| Anti-CD11b (M1 / 70) - FITC | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 11-0112-81 | |
| Anti-CD45 (30-F11) - eF450 | Thermo Fisher ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | 48-0451-82 | |
| Anti-F4 / 80 (BM-8) - PE Cy7 | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 25-4801-82 | |
| Anti-Gr1 (RB6-8C5) BD | Biosciences ، Franklin Lakes ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 552093 | |
| Anti-Ly6C (HK1.4) PerCP-Cy5.5 | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 45-5932-82 | |
| Anti-Ly6G (1A8) APC / Cy7 | Bio Legend ، سان دييغو ، كاليفورنيا | 127623 | |
| بوبرينورفين هيدروكلوريد | إنديفيور المملكة المتحدة المحدودة ، بيركشاير ، المملكة المتحدة | ||
| C57BL / 6 فئران ، أنثى ، 10-12 أسبوعا | من نهر تشارلز ريفر ، ويلمونغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية | ||
| حبات CaliBRITE APC (6 & micro ؛ م) | BD Biosciences ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 340487 | |
| Canula 23 مقياس 1 بوصة | BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 300800 | |
| Canula 26 مقياس 1/2 بوصة | BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 303800 | |
| مصفاة خلية 70 وميكرو ؛ م | BD Biosciences ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 352350 | |
| كولاجيناز النوع الأول | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | 1148089 | |
| ديوكسيربونوكلياز II | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | D8764 ؛ | |
| ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (PBS) ، معقم | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | D8662 | |
| Dulbecco ' s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم ، معقم | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | D8537 | |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | أنابيب E7889 | |
| FACS ، 5 مل | Sarstedt ، N & uuml ؛ mbrecht ، ألمانيا | 551579 | |
| مصل عجل الجنين (FCS) | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | F2442 | |
| Fine | Tools ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 11049-10 | |
| Isoflurane | Baxter ، Unterschlei & szlig ؛ هايم ، ألمانيا | ||
| كيتامين هيدروكلوريد | Serumwerk Bernburg ، برنبورغ ، ألمانيا | ||
| عديدات السكاريد الدهنية (LPS) من الإشريكية القولونية O111: B4 | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | L2630 | |
| LIVE / DEAD Fixable Dead Cell Green Kit | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | L23101 | |
| الفئران المنقاة المضادة للفأر CD16 / CD32 (Mouse BD Fc Block & trade ؛) ، استنساخ 2.4G2 | BD ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية | 553141 | |
| عازلة تحلل خلايا الدم الحمراء | Thermo Fisher ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية | 00-4333-57 | |
| RPMI-1640 ، مع L-glutamine وبيكربونات الصوديوم | Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | R8758 | |
| أدوات العلوم الدقيقة | للمقص ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 14060-09 | |
| أزيد الصوديوم (NaN3) | سيجما ألدريتش ، سانت. لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية | S2002 | |
| مقص زنبركي | أدوات العلوم الدقيقة ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 15018-10 | |
| ملقط الأنسجة | أدوات العلوم الدقيقة ، هايدلبرغ ، ألمانيا | 11021-12 | |
| أنابيب | إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا | 30125150 | |
| القسطرة الوريدية ، 22 مقياس | B.Braun ، Melsungen ، ألمانيا | 4268091B | |
| Xylazine هيدروكلوريد | Serumwerk Bernburg ، برنبورغ ، ألمانيا |
المراجع
- Fink, M. P. Animal models of sepsis. Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).
- Lu, Y. -C., Yeh, W. -C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
- Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
