يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة

10.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60002

⸱

يوليو 22, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology and Clinical Immunology, University Hospital RWTH Aachen, 2III. Department of Medicine, University Medical Center, Hamburg-Eppendorf, 3Department of Nephrology, Monash Health, 4Division of Nephrology and Hypertension, Oregon Health and Science University, 5Renal Section, Veterans Affairs Portland Health Care System, 6Fondation LeDucq Transatlantic Networks of Excellence, 7Department of Internal Medicine, Nephrology and Transplantation, Erasmus Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

يسمح الجمع بين وضع العلامات على الأجسام المضادة، والمقاصة البصرية، والفحص المجهري الضوئي المتقدم، بإجراء تحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل أو الأجهزة الكاملة. يوصف هنا هو طريقة بسيطة للجمع بين وضع العلامات المناعية من شرائح الكلى سميكة، والمقاصة البصرية مع cinnamate إيثيل، والتصوير البؤري التي تمكن التصور والقياس الكمي للهياكل الكلوية ثلاثية الأبعاد.

الملخص

تقنيات المقاصة البصرية تجعل الأنسجة شفافة عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة للتصوير الثلاثي الأبعاد اللاحقة (3-D). وقد حظيت باهتمام كبير في جميع مجالات البحوث لإمكانية تحليل الهياكل المجهرية متعددة الخلايا التي تمتد على مسافات العيان. وبالنظر إلى أن أنابيب الكلى، والأوعية الدموية، والأعصاب، وغطاء الكلى تمتد في العديد من الاتجاهات، والتي تم التقاطها جزئيا فقط من قبل التقنيات التقليدية ثنائية الأبعاد حتى الآن، وتطهير الأنسجة فتحت أيضا العديد من المجالات الجديدة لبحوث الكلى. قائمة أساليب المقاصة البصرية تنمو بسرعة، ولكن لا يزال من الصعب للمبتدئين في هذا المجال لاختيار أفضل طريقة لسؤال بحثي معين. شريطة هنا هو طريقة بسيطة تجمع بين وضع العلامات الأجسام المضادة من شرائح الكلى الماوس سميكة. (أ) التطهير البصري باستخدام الإيثيل الإيثيلي الرخيص وغير السام والجاهزة للاستخدام؛ والتصوير البؤري. يصف هذا البروتوكول كيفية بث الكلى واستخدام خطوة استرجاع مستضد لزيادة ربط الأجسام المضادة دون الحاجة إلى معدات متخصصة. يتم عرض تطبيقه في تصوير هياكل متعددة الخلايا مختلفة داخل الكلى، ويتم معالجة كيفية استكشاف الأخطاء وإصلاحها سوء اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة. كما نناقش الصعوبات المحتملة في تصوير الفلوروفورس الذاتية والحصول على عينات كبيرة جدا وكيفية التغلب عليها. يوفر هذا البروتوكول البسيط أداة سهلة الإعداد وشاملة لدراسة الأنسجة في ثلاثة أبعاد.

المقدمة

وقد أدى الاهتمام المتزايد بدراسة أعضاء كاملة أو هياكل كبيرة متعددة الخلايا إلى تطوير أساليب التطهير البصري التي تنطوي على تصوير الأنسجة الشفافة في ثلاثة أبعاد. حتى وقت قريب، كانت أفضل الطرق لتقدير عدد الخلايا، وطول، أو حجم الهياكل كلها ستيريوي أو مقطع تسلسلي شامل، والذي يقوم على أخذ العينات النظامية من الأنسجة لتحليلها في وقت لاحق في بعدين1، 2 , 3- ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تستغرق وقتاطويلا وتحتاج إلى مستوى عال من التدريب والخبرة 4. طرق المقاصة البصرية التغلب على هذه المشاكل عن طريق معادلة مؤشر الانكسار في جميع أنحاء عينة لجعل الأنسجة شفافة للتصوير 3-D5،6،7.

وقد تم تطوير عدة طرق للتطهير البصري تندرج في فئتين رئيسيتين: الأساليب القائمة على المذيبات والأساليب القائمة على مائي. يمكن تقسيم الأساليب المائية إلى غمربسيط 8،9،هايبرأوهدينغ10،11،وهيدروجيل التضمين12،13. الطرق القائمة على المذيبات تجفيف الأنسجة، وإزالة الدهون وتطبيع مؤشر الانكسار إلى قيمة حوالي 1.55. القيود المفروضة على معظم الأساليب القائمة على المذيبات هي تبريد الفلورة الذاتية من البروتينات مراسل شائعة الاستخدام مثل GFP، سمية المذيبات، والقدرة على حل الغراء المستخدمة في بعض غرف التصوير أو العدسات الموضوعية، وانكماش الأنسجة خلال الجفاف14،15،16،17،18،19،20،21. ومع ذلك، الطرق القائمة على المذيبات بسيطة، وكفاءة الوقت، ويمكن أن تعمل في عدد من أنواع الأنسجة المختلفة.

تعتمد الطرق المائية على غمر الأنسجة في الحلول المائية التي تحتوي على مؤشرات انكسار في نطاق 1.38-1.528و11و12و22و23و24 . وقد وضعت هذه الأساليب للحفاظ على انبعاث البروتين مراسل الفلورسنت الذاتية ومنع الانكماش الناجم عن الجفاف، ولكن القيود المفروضة على معظم أساليب المقاصة المائية تشمل مدة أطول من البروتوكول، وتوسيع الأنسجة، و تعديل البروتين (أي إزالة الصبغة الجزئية للبروتينات عن طريق اليوريا فيبروتوكولات ترطيب مفرط مثل ScaleA2) 7،11،23،25. تناول ScaleS توسع الأنسجة من خلال الجمع بين اليوريا مع السوربيتول، والتي توازن عن طريق الجفاف توسع الأنسجة الناجمة عن اليوريا، والحفاظ على البنية الفوقية للأنسجة كما تم تقييمها من قبل المجهر الإلكتروني10. يؤثر انكماش الأنسجة أو توسعها على الأحجام المطلقة للهياكل أو المسافات بين الكائنات أو كثافة الخلايا لكل وحدة تخزين. وبالتالي، فإن قياس التغيرات في الحجم عند إزالة الأنسجة قد يساعد على تفسير النتائج التي تم الحصول عليها7،26.

بشكل عام، يتكون بروتوكول التنظيف البصري من خطوات متعددة، بما في ذلك المعالجة المسبقة، ونفاذية، ووسم المناعة (إذا لزم الأمر)، ومطابقة مؤشر الانكسار، والتصوير مع الفحص المجهري الضوئي المتقدم (على سبيل المثال، اثنين من الفوتون، أو البؤرة، أو ضوء ورقة الفلورة المجهرية). وقد وضعت معظم نُهُج المقاصة لتصور الأنسجة العصبية، وقد أثبتت الدراسات الناشئة تطبيقها في أجهزة أخرى5. وقد ثبت من قبل هذه الأداة الشاملة للسماح بتحليل موثوق وفعال لهياكل الكلى، بما في ذلك الكلى27،28،التسلل المناعي28،الأوعية الدموية28،وشرائح الأنابيب 29، وهو نهج مثالي لتحسين فهم وظيفة الكبيبي والأنابيب إعادة عرض في الصحة والمرض.

ملخصة هنا هو طريقة تعتمد على المذيبات التي تجمع بين تلطيخ المناعة من أنابيب الكلى. التطهير البصري مع رخيصة، غير سامة، وجاهزة للاستخدام الكيميائية إيثيل سينامات (ECi)؛ والتصوير المجهري البؤري الذي يسمح بالتصور الأنبوبي الكامل والقياس الكمي. هذه الطريقة بسيطة، تجمع بين مستضد استرجاع شرائح الكلى مع تلطيخ الأجسام المضادة التجارية، ولا تتطلب معدات متخصصة، مما يجعلها في متناول معظم المختبرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة أوريغون للصحة والعلوم، بورتلاند، أوريغون، الولايات المتحدة الأمريكية، والسلطات المحلية ذات الصلة في آخن، ألمانيا.

1. الرجعية البطن الأبهر التسريب وتثبيت الكلى الماوس

  1. إعداد الحلول في نفس اليوم أو المساء قبل وتخزينها في الثلاجة بين عشية وضحاها. حلول دافئة لدرجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  2. جعل دفعة جديدة من 3٪ بارافورمالهايد (PFA) في 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). هناك حاجة إلى حوالي 50-100 مل PFA لكل ماوس.
    1. لجعل 1 لتر من 3٪ PFA: تزن 30 غرام من PFA وإضافة 800 مل من الماء المقطر في غطاء محرك الدخان. يُحرّك المزيج ويُحرّك إلى 50-60 درجة مئوية. لا تسخن فوق 70 درجة مئوية.
      تحذير: PFA سامة. إعداد PFA في غطاء محرك السيارة الدخان.
    2. ببطء إضافة عدة قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 2N. انتظر بضع دقائق حتى يذهب PFA إلى الحل أو إضافة بضع قطرات أخرى. بعض القطع الصغيرة لن تذوب.
    3. إزالة الحل من الحرارة. إضافة 50 مل من 20X PBS. تبرد على الجليد إلى RT.
    4. ضبط درجة الحموضة إلى 7.3-7.4 مع حمض الهيدروكلوريك إضافة الماء المقطر إلى 1 لتر.
    5. إزالة أي جزيئات غير مذابة عن طريق تصفية 1X PBS و 3٪ PFA مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. إضافة 1000 وحدة من الهيبارين إلى 1 لتر من 1X PBS. نقل 1X PBS التي تحتوي على الهيبارين و 3٪ PFA في 1X PBS في المحاقن البلاستيكية 50 مل منفصلة.
    ملاحظة: إذا كانت متاحة، يمكن استخدام مضخة التي تسيطر عليها الضغط في 80-100 مم زئبق أو الضغط الهيدروستاتيكي (طريقة بالتنقيط، وارتفاع حلول التسريب: 160-200 سم فوق الحيوان) لضخ الكلى.
  4. ربط PBS، PFA وإبرة فراشة 21 G حادة إلى سدادة ثلاثية. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في النظام بأكمله.
  5. تسمية أنبوب مخروطي 15 مل والاستغناء عن 10 مل من PFA في ذلك.
  6. تخدير عميق للذكور أو الإناث C57BL/6 الماوس 12-24 أسابيع من العمر باستخدام 120 ملغ / كغ من الكيتامين وزن الجسم و 16 ملغ / كغ من وزن الجسم xylazine. يجب فحص الحيوان للغياب الكامل للاستجابة عن طريق الضغط على ردود الفعل قبل الشروع في الجراحة (على سبيل المثال، منعكس قرصة اصبع القدم).
  7. بمجرد أن يصل الحيوان إلى مستوى جراحي للتخدير، وضعه على ظهره تحت المجهر التشريحي. فتح البطن جراحيا مع شق في البطن خط الوسط باستخدام مقص التشغيل وفضح الشريان الأبهر البطني.
  8. المشبك الشريان الأبهر البطني الحق فوق المتفرعة إلى الشريان الحرقفي مع hemostat منحني. ثم المشبك الشريان الأبهر البطني الحق تحت الشرايين الكلوية مع serrefine الصغيرة. قم بعمل شق صغير (1 مم) على الشريان الأبهري البطني بين المشابك مع مقص الفاناس. أدخل إبرة الفراشة في الشق ببطء وكن حذرا ً لعدم تمزيق الشريان الأبهري البطني المفتوح.
  9. قم بإزالة الشريان الكلوي الأيمن بخياطة حريرية 5-0 وإزالة الكلى المناسبة لإجراء تحليل آخر إذا كانت هناك حاجة إلى كلية واحدة فقط للتسريب والتثبيت.
  10. إزالة serrefine الصغيرة، مقطعة الوريد المدخل مع مقص فاناس، وperfuse على الفور مع 50 مل من PBS تحتوي على الهيبارين، ثم التبديل وperfuse مع 50 مل من 3٪ PFA.
    ملاحظة: الضغط العالي من خلال الشريان الأبهري البطني مطلوب لفتح أنابيب الكلى لنشر الأجسام المضادة بشكل أفضل من خلال الأنسجة. قد لا يفتح التسريب من خلال القلب أنابيب كلوية.
  11. جمع الكلى الممزوجة بعناية وتجنب ثقب أو الضغط على الأنسجة.
  12. إزالة الكبسولة وقطع الكلى إلى شرائح الإكليل 1 ملم سميكة. استخدام مصفوفة تقطيعاللحم (جدول المواد) لتوحيد سمك شريحة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، والنظر في استخدام الاهتزاز.
  13. تزج شرائح الكلى مع PFA أعدت في أنبوب مخروطي 15 مل المسمى.
  14. الاستغناء عن 10 مل من PFA إلى آخر المسمى 15 مل أنبوب مخروطي. امسح إبرة الإيقاف والفراشة ثلاثية الاتجاه مع PBS قبل الانتقال إلى الماوس التالي.
  15. تنفيذ ما بعد التثبيت بين عشية وضحاها في RT محمية من الضوء.

2. إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة

  1. بعد التثبيت، وغسل شريحة الكلى مرتين مع1X غسل العازلة (جدول المواد) لمدة 1 ساعة على الروك الأفقي في RT.
  2. إجراء استرداد مستضد. تسخين 300 مل من 1X مستضد كشف الحل (T قادرةعلىالمواد) في كوب 500 مل إلى 92-98 درجة مئوية. قم بتضمين الشريحة في شريط تضمين نفاذي إلى المخزن المؤقت الساخن مع التحريك لمدة ساعة واحدة عند 92-98 درجة مئوية. إزالة الكأس من الحرارة وتركها لتبرد إلى RT.
    ملاحظة: يقوم بعض البائعين باختبار أجسامهم المضادة لتطبيق الكيمياء المناعية وسوف يدرجون طريقة استرجاع مستضد مقترحة في ورقة البيانات. لذلك، قد تتطلب بعض الepitopes المخزن المؤقت أكثر أساسية (على سبيل المثال، الحموضة 9).
  3. نقل شريحة في 10 مل من 1X العازلة غسل مع 0.1٪ تريتون X-100 والصخور بين عشية وضحاها في RT. غسل شرائح 2X مع 10 مل من 1X العازلة غسل الطازجة لمدة ساعة 1 في اليوم التالي.
  4. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 500 درجة مئوية منمادة منع المناوطة الطبيعية (جدول المواد). ابدأ بتركيز من 1:50-1:100. هز بلطف شريحة الكلى في الجسم المضاد الأساسي المخفف لمدة 4 د عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: منذ كل الأجسام المضادة له خصائص فريدة من نوعها، ودرجة الحرارة أثناء حضانة الأجسام المضادة والتخفيفات من الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تكون الأمثل لتحقيقات الفردية. للتحكم الثانوي للأجسام المضادة فقط، ترعى أنسجة الكلى في تخفيف دون الأجسام المضادة الأولية. بدلا من ثنائي ة الأجسام المضادة التجارية، 1X PBS مع 0.1٪ تريتون X-100 و 0.01٪ يمكن استخدام أزيد الصوديوم.
  5. غسل شريحة الكلى في 10 مل من 1X غسل العازلة بين عشية وضحاها في RT مع تغيير واحد من العازلة غسل بعد 8 ح.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال، 1:100 للأجسام المضادة الثانوية المترافقة أليكسا فلور) في 500 ميكرولتر من مخفف الأجسام المضادة الطبيعي. حضانة شرائح الكلى في الجسم المضاد الثانوي المخفف لمدة 4 أيام عند 37 درجة مئوية. من هذه الخطوة فصاعدا، وحماية شرائح الكلى من الضوء.
  7. اغسل شرائح الكلى في 10 مل من 1X مخزن الغسيل الاحتياطي بين عشية وضحاها في RT مع تغيير واحد من العازلة غسل بعد 8 ح.

3. إزالة الأنسجة

  1. نقل شريحة الكلى إلى 5 مل منارتفاع درجة 100٪ الإيثانول (جدول المواد) لمدة 2 ساعة في RT مع هزاز لطيف (مع تغيير واحد إلى الإيثانول الطازج بعد 1 ساعة). هذه الخطوة هي لجفاف الأنسجة.
    ملاحظة: مطلوب الإيثانول عالية الجودة لتحقيق شفافية الأنسجة العالية في الخطوة التالية. الميثانول أو رباعي هيدروفوران هي الكواشف الجفاف البديلة مع إمكانية إزالة الدهون عالية.
  2. تزج شريحة الكلى في 2مل من ECi (جدول المواد) مع هزاز لطيف في RT (مع تغيير واحد إلى ECi الطازجة بعد 2 ساعة) بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: نقطة التجميد / ذوبان ECi هو 6-8 درجة مئوية. لذلك، لا تقم بتخزين العينات في الثلاجة. إجراء الغمر في غطاء الدخان التهوية بشكل صحيح وتجنب الاتصال المباشر مع الملابس والجلد (ECi هو غير سامة الغذاء والدواء المعتمدة من قبل إدارة مركب ولكن لديه رائحة قوية). استخدام أنابيب Eppendorf العادية أو الأوعية الزجاجية (لا سفن البوليسترين).
  3. يمكن تحقيق شفافية الأنسجة بعد غمر ECi وعندما تكون شرائح الكلى جاهزة للتصوير.

4. التصوير البؤري وتحليل الصور

ملاحظة: بالنسبة للتصوير، يمكن استخدام تقنيات الفحص المجهري الأخرى طالما أن حل مطابقة الفهرس الانكسار متوافق مع العدسة الموضوعية. يستخدم هذا البروتوكول مجهرًا مقلوبًا.

  1. إضافة 600-1000 درجة مئوية من ECi فيالطبق السفلي الزجاجي (جدول المواد).
    ملاحظة: تجنب استخدام أطباق زراعة الخلايا العادية، لأن ECi هو مذيب عضوي من شأنه أن يذوب الأطباق البلاستيكية. وبالمثل، ECi قد تهاجم أجزاء بلاستيكية / حلقات العزل على العدسات الموضوعية. راجع التقارير المناسبة للحصول على نظرة عامة على أطباق التصوير المتوافقة30 والغرف المطبوعة ثلاثية الأبعاد ذاتية الصنع28.
  2. نقل شريحة الكلى شفافة في الطبق. ضع غطاء مستدير على شريحة الكلى لتطبيق ضغط الضوء نحو أسفل الزجاج. ختم الطبق مع فيلم البارافين (جدولالمواد)لتجنب تسرب ECi.
    ملاحظة: قد تتطلب الأعضاء الكاملة أو عدة شرائح من الأنسجة السميكة بالمليمتر حدودًا (أسمنت الأسنان أو الاستومر سيليكون؛ راجع جدولالمواد) حول الأنسجة لجعل تجمع ECi للعينة.
  3. ضع الطبق على منصة التصوير المجهري.
  4. تأخذ عدة z-مداخن وأداء خياطة. تبدأ مع حجم خطوة z من 5 ميكرومتر.
    ملاحظة: خذ بعين الاعتبار استخدام مسافة العمل الطويلة (>5 مم) والفتحة الرقمية العالية (>0.9) لأهداف تصوير شرائح الأنسجة السميكة جدًا أو الأعضاء. بعد التصوير، نقل الأنسجة مرة أخرى إلى الإيثانول وتخزينها في العازلة غسل أو PBS مع 0.02٪ أزيد الصوديوم.
  5. تحليل الصورة باستخدام تقديم ثلاثي الأبعاد مع البرامج (جدولالمواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكلى هي أعضاء معقدة تتألف من 43 أنواع الخلايا المختلفة31. معظم هذه الخلايا تشكل هياكل كبيرة متعددة الخلايا مثل الكبية والأنابيب، ووظيفتها تعتمد إلى حد كبير على التفاعلات مع بعضها البعض. الكلاسيكية 2-D التقنيات النسيجية التقاط جزئيا هذه الهياكل الكبيرة، وقد تفوت التغييرات البؤرية داخل هياكل سليمة31. وهكذا، فإن التحليل ثلاثي الدّي باستخدام تقنيات التنظيف البصري يساعد على فهم كيفية عملها في الصحة والمرض.

معظم تقنيات المقاصة البصرية القائمة على المذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد حظيت تقنيات التطهير البصري باهتمام واسع النطاق للتصور ثلاثي الأبعاد والقياس الكمي للتشريح المجهري في مختلف الأجهزة. هنا، تم الجمع بين طريقة المقاصة القائمة على المذيبات (ECi) مع وضع العلامات المناعية للتصوير ثلاثي الأبعاد للأنابيب الكاملة في شرائح الكلى. هذه الطريقة بسيطة وغير مكلفة وسريعة. ومع ذلك، يمكن الإجابة على أسئلة البحوث الأخرى على أفضل وجه مع بروتوكولات المقاصة الأخرى5. من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن الأساليب القائمة على المذيبات تسبب انكماش الأنسجة في درجات متغيرة، ويرجع ذلك أسا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

T. S. بدعم من المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية DFG (332853055)، آخر Kröner-Fresenius-Stiftung (2015_A197)، وكلية الطب في RWTH آخن (RWTH برنامج العائدين). V. G. P. بدعم من زمالات بحثية من دويتشه جيسيلشافت فور كلورولوجي، ومؤسسة ألكسندر فون هومبولدت، والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا. D. H. E بدعم من مؤسسة LeDucq. ويتلقى ر. ك. الدعم من المنح المقدمة من وزارة المالية (KR-4073/3-1 وSCHN1188/5-1 وSFB/TRR57 وSFB/TRR219) وولاية نورثراينويستفاليا (MIWF-NRW) والمركز المتعدد التخصصات للبحوث السريرية في جامعة RWTH Aachen (O3-11).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ م مرشحفيشر Scientific09-761-112
15 مل أنبوب مخروطيالشكل فيشر Scientific339650
21 G إبرة فراشةبراونفينوفيكس
3-way stopcockفيشر ScientificK420163-4503
3D analyis softwareBitplane AGIMARIS
3D analyis softwareCellprofilerبرنامج مجاني مفتوح المصدر
5-0 خياطة حريريةأدوات العلوم الدقيقة18020-50
50 مل محاقن بلاستيكيةفيشر ساينتفيك14-817-57
الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة المضادةل BrdURoche 11296736001
مخفف الأجسام المضادةDakoS0809
CD31-647BioLegend102516
محلول استرجاع المستضد القائم على الستراتمختبرات ناقلاتH-3300
الهيموس المنحنيفيشر Scientific13-812-14
Dako Wash BufferAgilentS3006
تشريح المجهرMoticDSK-500
تضمين أشرطةكارل روثE478.1
الإيثانولميرك100983
إيثيل سيناماتسيجما ألدريتش112372
فيلم مرن / بارافيلم MSigma-AldrichP7793
الماعز المضاد ل AQP2سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-9882
خنزير غينيا المضاد ل NKCC2N / AN / ADOI: 10.1681 / ASN.2012040404
HClCarl RothP074.1
الهيبارينساجنت للمستحضرات الصيدلانية401-02
HemostatAgnthos312-471-140
طبق تصوير أفقيLabnetS2035-E
Ibidi81218
الكيتامينMWI صحة501090
أدواتالعلوم الدقيقة18052-03
هيدروكسيد الصوديوميدمقص التشغيل فيشر العلميS318-500
Merit97-272
ParaformaldehydeThermo Fischer ScientificO4042-500
Rabbit anti-phoshoThr53-NCCPhosphoSolutionsp1311-53
مطاط الصناعي السيليكونيWorld Precision Instruments Kwik-SilKWIK-SIL
أزيدالصوديومSigma-AldrichS2002
المناديلZivic InstrumentsHSRA001-1
Triton X-100Acros OrganicsAC215682500
مقص Vannasأدوات العلوم الدقيقة15000-00
VibratomeLancerSeries 1000
XylazineMWI صحةAnaSed Inj SA (Xylazine)
تقطيع

المراجع

  1. Oh, S. W., et al. A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).
  2. Zhai, X. Y., et al. 3-D reconstruction of the mouse nephron. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (1), 77-88 (2006).
  3. Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
  4. Puelles, V. G., Bertram, J. F., Moeller, M. J. Quantifying podocyte depletion: theoretical and practical considerations. Cell and Tissue Research. 369 (1), 229-236 (2017).
  5. Puelles, V. G., Moeller, M. J., Bertram, J. F. We can see clearly now: optical clearing and kidney morphometrics. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (3), 179-186 (2017).
  6. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  7. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  8. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  9. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).
  10. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  11. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  12. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  13. Lee, E., Sun, W. ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  14. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (2), 452-459 (2017).
  15. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: 3-D visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  16. Erturk, A., et al. 3-D imaging of solvent-cleared organs using 3-DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  17. Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PloS One. 7 (3), e33916(2012).
  18. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  19. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  20. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS ONE. 10 (5), e0124650(2015).
  21. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
  22. Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microscopy Research and Technique. 70 (1), 1-9 (2007).
  23. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  25. Hua, L., Zhou, R., Thirumalai, D., Berne, B. J. Urea denaturation by stronger dispersion interactions with proteins than water implies a 2-stage unfolding. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (44), 16928-16933 (2008).
  26. Wan, P., et al. Evaluation of seven optical clearing methods in mouse brain. Neurophotonics. 5 (3), 035007(2018).
  27. Puelles, V. G., et al. Validation of a 3-D Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (10), 3093-3104 (2016).
  28. Puelles, V. G. Novel 3-D analysis using optical tissue clearing documents the evolution of murine rapidly progressive glomerulonephritis. Kidney International (in press). , (2019).
  29. Saritas, T., et al. Optical Clearing in the Kidney Reveals Potassium-Mediated Tubule Remodeling. Cell Reports. 25 (10), 2668-2675 (2018).
  30. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146 (3), (2019).
  31. Clark, J. Z., et al. Representation and relative abundance of cell-type selective markers in whole-kidney RNA-Seq data. Kidney International. 95 (4), 787-796 (2019).
  32. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5 (1), eaau8355(2019).
  33. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164 (4), 792-804 (2016).
  34. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  35. Gleave, J. A., Lerch, J. P., Henkelman, R. M., Nieman, B. J. A method for 3-D immunostaining and optical imaging of the mouse brain demonstrated in neural progenitor cells. PLoS ONE. 8 (8), e72039(2013).
  36. Saritas, T., et al. Disruption of CUL3-mediated ubiquitination causes proximal tubule injury and kidney fibrosis. Scientific Reports. 9 (1), 4596(2019).
  37. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1297-1304 (2011).
  38. Holliger, P., Hudson, P. J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains. Nature Biotechnology. 23 (9), 1126-1136 (2005).
  39. Bunka, D. H., Stockley, P. G. Aptamers come of age - at last. Nature Reviews: Microbiology. 4 (8), 588-596 (2006).
  40. Kim, S. Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  41. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for 3-D visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).
  42. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of 3-D brain tissue. Scientific Reports. 7 (1), 9895(2017).
  43. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  44. Matryba, P., Bozycki, L., Pawlowska, M., Kaczmarek, L., Stefaniuk, M. Optimized perfusion-based CUBIC protocol for the efficient whole-body clearing and imaging of rat organs. Journal of Biophotonics. 11 (5), e201700248(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير البؤرياستعادة المستضدسينامات الإيثيلوسم الأجسام المضادةالتصوير ثلاثي الأبعادشفافية الأنسجةالبروتينات الفلوريةالتثبيت بالفورمالدهيد
التطهير البصري والتصوير من أنسجة الكلى المسماة بالمناعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.