يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

8.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60009

⸱

ديسمبر 31, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

في هذه المقالة

ملخص

نحن وصف طريقه لتوصيف ناقلات الغشاء التي يحركها البروتون في الاستعدادات غشاء الحويصلة التي تنتجها التعبير المغاير في كولاي تحلل من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية.

الملخص

وقد تم تطوير العديد من الطرق لتوصيف وظيفيا ناقلات غشاء الرواية. بوليامينيس في كل مكان في جميع الكائنات الحية ، ولكن لم يتم التعرف علي مبادلات بوليامين في النباتات. هنا ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف الحمالين بوليامين باستخدام الحويصلات الغشاء المتولدة من تحلل من الخلايا القولونية اساشيكوجيا التعبير عن انتيبورتر النبات. أولا ، ونحن عبرت بشكل غير متجانس AtBAT1 في سلاله e. القولونية ناقصه في بوليامين والناقلون الصرف ارجينين. وأنتجت الحويصلات باستخدام الصحافة الفرنسية ، وتنقيتها من قبل نبذ حلول واستخدامها في فحص غشاء الترشيح من الركائز المسمية لإظهار خصوصية الركيزة للناقل. وأظهرت هذه المقايسات ان AtBAT1 هو نقل بوساطة البروتون من ارجينين, حمض γ الامينيه (GABA), بوتريسين و spermidine. سلاله متحولة التي تم تطويرها لفحص AtBAT1 قد تكون مفيده للتحليل الوظيفي لأسر أخرى من المبادلات النباتية والحيوانية بوليامين. ونحن نفترض أيضا ان هذا النهج يمكن استخدامها لتوصيف العديد من أنواع أخرى من مضادات الحمالين ، طالما يمكن التعبير عن هذه البروتينات في غشاء الخلية البكتيرية. E. القولونية هو نظام جيد لتوصيف ناقلات الرواية ، لان هناك طرق متعددة التي يمكن استخدامها لطفرة الناقلات الاصليه.

المقدمة

البروتينات المتورطة في الاتجار بالأيض تشكل مستوي أساسيا من التنظيم الفسيولوجي ، ولكن الغالبية العظمي من ناقلات الغشاء النباتي لم تتميز بعد وظيفيا. وقد نفذت عده استراتيجيات لتوصيف بروتينات النقل الجديدة. وقد استخدمت التعابير غير المتجانسة في الكائنات الحية النموذجية مثل الخلايا القولونية والنواة الحقيقية مثل الخميرة والبويضات xenopus وخلايا الثدييات وخلايا الحشرات والخلايا النباتية لتحديد نشاط النقل1. ويفضل الخلايا ذات النواة الحقيقية للتعبير عن البروتينات النواة ، لان التركيب الخلوي الأساسي ، ومسارات تحويل الإشارات ، والنسخ والترجمة أليات متوافقة مع الظروف الاصليه.

كانت الخميرة كائنا نموذجيا هاما لتوصيف بروتينات النقل الجديدة في النباتات. أول البروتين النقل النباتي الذي تم التعبير عنه بنجاح في الخميرة (ساكاروميسز pombe) كان الناقل هيكسوز HUP1 من شلوريلا2. ومنذ ذلك الحين ، والعديد من البروتينات نقل النبات تتميز وظيفيا باستخدام نظام التعبير الخميرة. وتشمل هذه المعدات ناقلات السكر النباتية (SUC1 و SUC23و VfSUT1 و VfSTP14) وناقلات اوكاين (الAUX1 والدبوس5). مساوئ استخدام الخميرة للتعبير عن البروتينات النباتية يمكن ان تشمل ضعف النشاط من البروتينات المترجمة plastid لان الخميرة تفتقر إلى هذا organelle ، ثمة6، وتشكيل المجاميع المضللة وتفعيل الاستجابات الإجهاد في الخميرة بسبب الإفراط في التعبير عن البروتينات غشاء7،8،9.

التعبير المغاير للبروتينات النقل في البويضات Xenopus وقد استخدمت علي نطاق واسع لتوصيف إلكتروفيزيولوجي للناقلات10. وكانت أول البروتينات النقل النباتية التي تتميز باستخدام التعبير المغاير في البويضات Xenopus Arabidopsis قناه البوتاسيوم KAT110 وناقل Arabidopsis هيكز STP111. ومنذ ذلك الحين ، وقد استخدمت البويضات Xenopus لتوصيف العديد من البروتينات النقل النباتية مثل البلازما الناقلات غشاء12، فاكولار السكروز الناقل SUT413 و فاكولار مالات الناقل ALMT914. ومن القيود الهامه علي البويضات Xenopus لاختبارات النقل ان تركيز الأيض داخل الخلايا لا يمكن التلاعب1. وعلاوة علي ذلك ، مطلوب المعرفة المهنية لاعداد البويضات Xenopus وتنوع دفعات البويضة من الصعب السيطرة عليها.

التعبير المغاير في الكائن الحي النموذجي e. كولاي هو نظام مثالي من حيث توصيف البروتينات الجديدة لنقل النباتات. مع الجينوم متسلسلة تماما15، والخصائص الجزيئية والفسيولوجية لل e. القولونية معروفه جيدا. أسست أدوات جزيئيه وتقنيات جيدا16. الاضافه إلى ذلك ، مختلفه ناقلات التعبير ، سلالات غير المسببة للامراض والمسوخ متاحه17،18،19. وعلاوة علي ذلك ، e. كولاي لديها معدل نمو مرتفع ويمكن زراعتها بسهوله في ظل ظروف المختبر. يمكن التعبير عن العديد من البروتينات بسهوله وتنقيتها بكميات عاليه في e. كولاي9. عندما لا يمكن ان تكون البروتينات التهاوي مباشره في النظم الخلوية ، وأعاده تكوين البروتينات في الجسيمات الشحمية كان أيضا ناجحه ، وان كانت تحديا الابتكار لتوصيف البروتينات الغشاء المنقي. وقد تم إنجاز توصيف وظيفي للبروتينات النقل الميتوكوندريا النبات بما في ذلك الناقلات مذاب مثل ناقلات الفوسفات في فول الصويا والذرة والأرز والArabidopsis ، dicarboxylate-tricarboxylate الناقل في Arabidopsis باستخدام هذا النظام نموذج20،21. ومع ذلك ، تم العثور علي البروتينات المؤتلف من بروتين الطماطم SICAT9 لتكون غير وظيفية في تجارب أعاده التشكيل ، والأعضاء الآخرين من الاسره الناقل CAT وجدت لتكون غير وظيفية في اختبارات البويضات Xenopus 22. التالي ، هناك حاجه إلى أدوات جزيئيه اضافيه لتوصيف ناقلات الغشاء.

تم العثور علي خمسه أنظمه النقل بولياميني في e. كولاي23. وهي تشمل اثنين من الناقلين ABC التوسط في امتصاص سبيرمدين والوضع ، ومبادل النبات/اورنيثين ، ومبادل cadaverine/يسين ، ومصدر سبيرمدين والمستورد بوسكارين. وقد اتسمت في الأصل مبادل بوتريسين PotE باستخدام فحص حويصلة ، حيث تم اعداد الحويصلات الداخلية من قبل الخلايا الليسينجه مع الصحافة الفرنسية وقياس امتصاص بوتريمين الشعاعية في الحويصلات في مقابل اورنيثين24. واستخدمت اختبارات الحويصلة أيضا لتوصيف ناقل الكالسيوم ، الذي توسط في نقل الكالسيوم ردا علي التدرج البروتون25. وقد دفعتنا هذه التجارب إلى وضع استراتيجية لتوصيف مبادلات البوليامين الأخرى. انشانا لأول مره سلاله من e. القولونية ناقصه في pote والمبادلات cadb . هنا ، فاننا نظهر التوصيف الوظيفي لمصنع بوليامين انتيبورتر عن طريق التعبير غير المتجانس في سلاله e. القولونية المعدلة ، وتوليد الحويصلات الغشائية باستخدام الصحافة الفرنسية ، والمقايسات الشعاعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جيل من القولونية المزدوجة تدق خارج متحولة مع محول P1

  1. الحصول علي e. القولونية سلاله واحده المغلوب متحولة δpote و δcadb من e. القولونية الوراثية مركز الأسهم (http://cgsc.biology.yale.edu).
    ملاحظه: سلاله δpote هو كاناميسين مقاومه26 وسلاله δcadb هو المقاومة للتاسكلين27.
  2. بناء سلاله الضربة القاضية المزدوجة Pote/CadB (dko) باستخدام بروتوكول المحول P128.
    1. اعداد الليسات
      1. تمييع ثقافة بين عشيه وضحيها من δpote في LB الطازجة (1:100) تستكمل مع 10-25 Mm mgcl2، 5 مم cacl2، و 0.1-0.2 ٪ الجلوكوز.
      2. ينمو في 37 درجه مئوية ل 1-2 h.
      3. أضافه 40 μl من P1 بالعاثيه محلله إلى الثقافة ، ومواصله النمو في 37 درجه مئوية. رصد ل 1-3 h حتى الثقافة قد تفكيك
        ملاحظه: عندما يتم وضع الثقافة ، سيكون الحطام الخلوي مرئيا في الأنبوب سيكون للثقافة خسارة كبيره في التعكر.
      4. أضافه عده قطرات من كلوروفورم (50-100 μl) إلى محلله ودوامه. أجهزه الطرد المركزي في 12,000 x g لمده 2 دقيقه لأزاله الحطام الخلوي ونقل ماده طافي إلى أنبوب جديد.
    2. تنبيغ
      1. تنمو δcadb سلاله بين عشيه وضحيها في المتوسط LB.
      2. حصاد الخلايا عن طريق طرد في 4,000 x g لمده 2 دقيقه وأعاده التعليق في 1/5-1/3 حجم الثقافة المقطوعة في LB الطازجة تستكمل مع 100 Mm mgso4 و 5 مم cacl2.
      3. أضافه تعليق خليه δcadb إلى أنبوب مع بالعاثيه من الخطوة 1.2.1.4 وتخلط بسرعة.
      4. أضافه 200 μL من 1 م نا-سيترات (pH 5.5) ، ثم أضافه 1 مل من LB. احتضان في 37 درجه مئوية ل 1 ح للسماح للتعبير عن علامة مقاومه المضادات الحيوية.
      5. تدور الخلايا في 4000 x g لمده 5 دقائق.
      6. أعاده التعليق في 100 μL LB المجهزة مع 100 mM Na-سيترات (pH 5.5) ودوامه جيدا لتفريق الخلايا.
      7. حدد سلالات المؤتلف علي لوحات أجار رطل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و 10 ميكروغرام/مل من التاسكلين ومن ثم تاكيد بواسطة تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) مع الإشعال المناسب26,27.
      8. تحقق من أجزاء PCR بواسطة التسلسل.

2. التعبير عن الجينات المستهدفة (AtBAT1) في e. القولونية متحولة

  1. تضخيم تسلسل الطول الكامل للجينات المستهدفة بواسطة PCR وادراجها في متجه مدخل البوابة pENTR/D-TOPO29.
    ملاحظه: وفي هذه الحالة تم تضخيم ATBAT 1.1 باستخدام التمهيدي إلى الامام 5 ' CGGCGATCAATCCTTTGGTAGATGG والتمهيدي العكسي 5 ' غتاجاغاتجتجاجاتجي ، التشبع الاولي في 98 درجه مئوية لمده 2 دقيقه ثم 30 دورات من التشبع في 98 درجه مئوية ل 0.1 دقيقه ، الصلب في 59 درجه مئوية ل 0.3 دقيقه ، والتمديد في 72 درجه مئوية ل 0.40 دقيقه والتمديد النهائي في 72 درجه مئوية لمده 10 دقيقه. تم تنقيه المنتج PCR باستخدام مجموعه تنظيف PCR ، كميا باستخدام مطياف. تم ادراج المنتج PCR في متجه العبارة بعد الاتجاات manufactrurers.
    1. تحويل متجه الدخول إلى خلايا Top10 e. كولاي المختصة بواسطة الصدمات الحرارية وحدد لريكومبينانتس الناجحة علي وسائل الاعلام LB مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين بعد بروتوكولات الاستنساخ الجزيئي القياسية30.
    2. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعه استخراج البلازميد ، واتباع اتجاات الشركة المصنعة ، وتسلسل لتاكيد الادراج الصحيح.
  2. نقل الجينات الهدف إلى متجه الوجهة كولاي ، pbad-DEST49 بواسطة الاستنساخ العبارة LR لإنشاء متجه التعبير29.
    1. تحويل متجه التعبير إلى خلايا Top10 e. كولاي المختصة بواسطة الصدمة الحرارية لمده 30 ثانيه وحدد ريكومبينانتس ناجحه علي وسائل الاعلام LB مع 100 ميكروغرام/مل الامبيسلين30.
    2. استخراج البلازميد الحمض النووي30 وتسلسل لتاكيد الادراج الصحيح.
  3. تحويل ناقلات التعبير إلى e. القولونية ΔpotE740 (del):: Kan, ΔcadB2231:: Tn10 وحدد علي لوحات LB مع الامبيسلين, كاناميسين, و30.
  4. من أجل تحديد التركيز الأمثل من الأرابيسك للاستقراء ، والتعبير عن الجينات المستهدفة تحت سيطرة المروج arabad في وسائل الاعلام LB مع تركيزات التدرج من ارابينوز كما هو موضح29.
  5. جمع الكريات الخلية وتقييم التعبير البروتين من قبل SDS-PAGE والتصور من عصابات البروتين كما هو موضح في دليل المنتج29.
    ملاحظه: E. القولونية ΔpotE740 (del):: Kan ، ΔcadB2231:: Tn10 تم استخدامها كنموذج التحكم دون تعبير BAT1. E. القولونية مزدوجة ضرب الخلايا متحولة مع الناقل PBAD-DEST49 فارغه لم تستخدم كعنصر تحكم بسبب وجود الجينة ccdb في المتجه.

3. توليد الحويصلات الغشائية الداخلية

  1. ثقافة ال [ ا.]. القولونية خلايا متحولة التعبير عن البروتين المستهدف من خلال زراعه مستعمره واحده بين عشيه وضحيها في 5 مل من وسائل الاعلام الحرة بوليامين (2 ٪ الجلسرين ، 6 غرام من K2hpo4، 3 غرام من KH2PO4، 0.5 غرام من كلوريد الصوديوم ، NH4Cl ، 50 ملغ من الثيامين ، 0.79 g الخميرة كامل الاصطناعية L-ارجينين (50 ملغ/لتر) ، حمض الاسبارتيك ل (80 ملغ/لتر) ، l-Histidine هيدروكلوريد مونوهيدرات (20 ملغ/لتر) ، l-ليوسين (100 ملغ/لتر) ، l-يسين هيدروكلوريد (50 ملغ/لتر) ، l-ميثيونين (20 ملغ/لتر) ، L-فينيلالانين (50 ملغ/لتر) ، L-Threonine (100 mg/L) ، L-تريبتوفان (50 ملغ/لتر) ، L-التيروسين (50 ملغ/لتر) ، L-فالين (140 mg/L) ، Uracil (20 ملغ/لتر)). نقل هذه الثقافة إلى 500 مل من وسائل الاعلام الحرة بولياميني تستكمل مع 0.0002 ٪ ارابينوز وتنمو حتى ثقافة الخلية تصل إلى OD600 من 0.6-0.8 (عاده ~ 5 ح).
  2. جمع بيليه الخلية بواسطة طرد في 2,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c. أعاده تعليق بيليه ويغسل ثلاث مرات مع 0.1 M البوتاسيوم العازلة المخزن المؤقت ، pH 6.6 ، التي تحتوي علي 10 مم أدتا (العازلة 1). يجب ان يكون الحجم النهائي للخلايا في المخزن المؤقت 1 بعد الدورة الثالثة 10 مل.
  3. توليد الحويصلات الغشائية الداخلية من قبل الفرنسية الصحافة العلاج (10,000 p.s.i.) من الخلايا السليمة باستخدام 35 mL خليه الضغط الفرنسية.
  4. قبل تحميل العينة في خليه الضغط الفرنسية القياسية ، تليين المكبس و O-خواتم لجعله أسهل لادراجها في الخلية.
    ملاحظه:هذه التعليمات محدده لاستخدام خليه الضغط القياسية31.
    1. المسمار بعناية إغلاق المكونات في الطرف السفلي من الخلية. تاكد من ان الخلية علي الجانب الأيمن حتى استنادا إلى حروف علي جانب الخلية. ادخل المكبس في الخلية ونقله إلى الخلية ، حتى يصل الحد الأقصى لخط التعبئة علي المكبس إلى اعلي المكبس. اقلب الوحدة وضعها علي الحامل المتوفر بين الوظائف الثلاثة.
    2. صب تعليق الخلية في الجسم من الخلية.
      ملاحظه: لقد تم استخدام فقط 10 مل ، لذلك سيكون هناك الكثير من الغرفة المتبقية في الضغط الفرنسي غرفه الخلية ، والتي لديها قدره 35 mL.
    3. جبل خليه الضغط القياسية علي وحده خليه الضغط الفرنسية.
      1. تاكد أولا من ان الطاقة معطله. علي الجانب الأيسر من اللوحة هو التبديل محدد نسبه . فقد ثلاثه مناصب: أسفل في نهاية الشوط ، منخفضه لاستخدام خليه ضغط أصغر ، وعاليه للاستخدام مع خليه الضغط الفرنسية القياسية. ان الصحافة فرنسية كان سابقا استعملت مع الخلية صغيره المكبس بستون يمكن لا يكون تماما تراجعت. تعيين هذا التبديل إلى أسفل.
    4. تشغيل الجهاز مع التبديل علي RHS في القسم الخلفي من الوحدة وتشغيل التبديل إيقاف مؤقت تشغيل الموضع. وهذا سيؤدي إلى تراجع المكبس بالبالكامل. نقل التبديل مره أخرى إلى إيقاف مؤقتثم إيقاف تشغيل الجهاز.
    5. فك مسامير الإبهام وتحريك مشبك الأمان الذي يمتد إلى عمودين من الفولاذ المقاوم للصدا إلى الجانب. وسوف تتارجح إلى اليمين. مع يد واحده عقد قاعده الإغلاق المكونات في مكانها ، واختيار خليه الضغط الفرنسية بكلتا يديه ، وتناوب عليه 180 درجه ، التالي فان المكبس هو الآن في وضع تستقيم. تعيينه علي منصة ، وتحريك المشبك السلامة مره أخرى في المكان بحيث هذا المشبك يحمل خليه الضغط الفرنسية في الموقف.
    6. لاحظ التجمع صمام تدفق علي المكونات إغلاق يحتاج إلى ان تكون في متناول الاوبيراتير والمتمركزة بحيث يمكن تشغيل صمام بحريه. فتح التجمع صمام تدفق مع عدد قليل من المنعطفات عكس عقارب الاتجاه. ضع أذرع المكبس بحيث يتم توجيهها في موضع الساعة الثانية والثامنة. تشديد مسامير الإبهام بحيث يتم عقد خليه الضغط القياسية في المكان.
    7. ادخل أنبوب مخرج العينة في قابس الإغلاق ، وقم بتوصيل قطعه قصيرة من الأنابيب المرنة بحيث يمكن جمع حطام الخلية المكسورة في أنبوب الصقر. نحن عاده استخدام 300 mL الجليد مملوءة الكاس لعقد أنبوب الصقر تستقيم ، والحفاظ علي الحطام الخلية المبردة.
    8. تاكد من تعيين مفتاح التشغيل إيقاف مؤقت إلى إيقاف مؤقت، والتجميع صمام في الموضع فتح. تشغيل الجهاز مره أخرى إلى علي ، محروق التبديل محدد نسبه إلى عاليه، وتحويل صمام زيادة الضغط علي اللوحة الاماميه إلى اليمين حول نصف بدوره.
    9. سيبدا المكبس في الارتفاع من القاعدة لأزاحه الهواء في الغرفة. توجيه الهواء الخروج من الأنابيب Tygon تعلق علي أنبوب منفذ العينة إلى أنبوب في الكاس.
    10. عندما القطرات الاولي من السائل يخرج ، وإغلاق التجمع صمام تدفق عن طريق تحويلها في اتجاه عقارب الوقت. هذا يخلق معدن إلى ختم معدني ، مع خليه الضغط ، لذلك لا تبالغ.
    11. الجبهة من الصحافة الفرنسية لديها مخطط علي اللوحة الاماميه لتوليد الضغط المناسب علي الخلايا البيولوجية داخل خليه الضغط. في هذه الحالة ، زيادة الضغط عن طريق تحويل صمام زيادة الضغط في اتجاه عقارب اليوم ، حتى يصل إلى مقياس 640 psi. وهذا سيخلق ضغط داخلي من 10,000 psi.
    12. مره واحده وقد وصلت الخلية الضغط المستهدف فتح التجمع صمام تدفق قليلا عن طريق تحويلها عكس اتجاه عقارب اليوم. ضبط فتح صمام للسماح لمعدل تدفق فقط حوالي 10 قطرات لكل دقيقه.
    13. عندما يصل خط التوقف علي جسم المكبس إلى اعلي الخلية المتدفقة. قم بتبديل مفتاح تشغيل الإيقاف المؤقت إلى إيقاف مؤقت. هذا أمر بالغ الاهميه لان وجود مكبس ادراج ابعد في الخلية سوف يضر الوحدة. فتح التجمع صمام تدفق وجمع قطرات المتبقية.
    14. تبديل محدد نسبه الدوران إلى الأسفل، ثم قم بتعيين مفتاح تشغيل الإيقاف المؤقت للتشغيل. عندما يتم سحب لوحه أسفل تماما تعيين التبديل تشغيل إلى وقفه، وإيقاف تشغيل الجهاز.
    15. أزاله خليه الضغط الفرنسية من الصحافة الفرنسية ، وتفكيك للتنظيف. تخزين جميع أجزاء الجافة مع تغطيه خفيفه من الجلسرين. أزاله واستبدال اي الحشايا أو الأختام مع علامات الارتداء.
  5. أزاله الخلايا غير المنقطعة والحطام الخلية من الصحافة الفرنسية التي طرد في 10,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c. تجاهل بيليه ، ونقل ماده طافي إلى أنابيب الطارد.
  6. الحويصلات غشاء بيليه من ماده طافي الناتجة من قبل ultracentrifugationat 150,000 g ل 1 ح في 4 ° c.
  7. غسل الحويصلات غشاء مره واحده ، دون أعاده التعليق ، في 1 مم تريس-maleate ، pH 5.2 التي تحتوي علي 0.14 M KCl ، 2 مم 2-mercaptoethanol و 10 ٪ الجلسرين وأعاده التعليق في نفس المخزن المؤقت (العازلة 2)23 باستخدام مطحنه الانسجه dounce. عاده سيتم تعليق الجزء غشاء من 500 مل من الثقافة في 5 مل من العازلة ، وتركيز 5-10 ملغ من البروتين الغشاء/مل باستخدام حمض Biochinic فحص32.
  8. تخزين 100 μl قسامات من الاستعدادات غشاء في-80 درجه مئوية في 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي.

4. لطخه الغربية والتوجه لفحص الناقل

  1. غسل وأعاده تعليق الحويصلات من الخطوة 3.7 في 30 مم تريس الرقم الهيدروجيني 7.8 + 0.1 mM CoCl2.
  2. إلى 100 العينات μL ، أضافه 1 μL من 2 مغ/مل كربوبيبتيداز A في 0.1 M NaCl ، 30 مم تريس ، 0.2 mM CoCl2 pH 7.8.
  3. غرس لمده 20 دقيقه في 20 درجه مئوية. وقف الهضم عن طريق أضافه 5 μL من 0.5 M Naايديتا, 0.5 M 2-mercaptoethanol pH 7.5.
  4. للغاء تنشيط الانزيم بشكل كامل ، احتضان المحلول لمده 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: الحويصلات بدون كاتبوكبيبتيداز تم استخدام العلاج كعنصر تحكم.
  5. تحليل عينات من قبل الكهربائي في وجود كبريتات الليثيوم دوديسيل. أضافه 5-10 μL من 150 ملغ/مل من كبريتات الليثيوم دوديسيل ، 450 ملغ/مل الجلسرين ، 0.1 ملغ/مل بروموفينول الأزرق ، 0.4 M تريس الأس الهيدروجيني 7.5 إلى 100 μL من العينة.
  6. أداء المناعية عن طريق وضع فلتر النيتروسليلوز مبلل مع 25 مم الصوديوم-الهيدروجين فوسفات الأس الهيدروجيني 7.5 علي هلام بولياكريلاميد. وضع هذه بين اثنين من مرشحات السليلوز مبلل وأخيرا بين اثنين من البلاستيك مبلل منصات تجوب. وضع هذا التجميع بين أقطاب الغرفة التي تحتوي علي 25 مم الصوديوم-الهيدروجين فوسفات الأس الهيدروجيني 7.5 في 2-4 درجه مئوية.
  7. السماح بالنقل الكهربي للبروتينات للمضي 3 ح في 20 V و 2-3 A.
  8. منع غشاء النيتروسليلوز بين عشيه وضحيها في 2 درجه مئوية في حاجز الحجب من 0.15 M nacl, 10 مم تريس, pH 7.5 و 0.5 ملغ/مل توين 2033.
  9. احتضان فلتر النيتروسليلوز ل 2 ح مع التخفيف 1:5000 من المضادة له (C الطرفية)-الجسم المضاد في الحاجز حجب (20 مل) ويغسل مرتين مع 50 ml من العازلة لما مجموعه 60 دقيقه.
  10. لتصور وصمه المناعية ، تذوب 6 ملغ من 4-كلورو-1-نفثول في 20 مل من الكحول المشوه وأضافه 80 مل من 15 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.5 و 50 μL من 30 ٪ H2O2. يستحم ورقه فلتر في محلول الركيزة لمده 20 دقيقه. الكاشف سوف تتفاعل مع الأجسام المضادة لتشكيل الراسب الأزرق علي غشاء النيتروسليلوز. عندما وضعت ما يكفي من اللون ، شطف الغشاء بالماء ، والسماح لتجف.

5. فحص النقل

  1. احتضان 100 μl القسامات من الحويصلات غشاء في 12 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  2. بدء النقل عن طريق أضافه بوليولامين شعاعي إلى حويصلات غشاء في تركيز نهائي من 50 μM (ما لم يذكر خلاف ذلك). جعل 3H-الركيزة (spermidine أو putine) الحلول في العازلة المقايسة تتكون من 10 ملم تريس-HCl ، 10 ملم فوسفات البوتاسيوم ، pH 8.0 و 0.14 M kcl23 (العازلة 3) مع التعديلات اعتمادا علي الفحص.
  3. اجراء اختبارات النقل لمده دقيقه واحده في 12 درجه مئوية في 1.5 mL أنابيب الطارد المجهري.
  4. بعد 1 دقيقه ، نقل مخاليط التفاعل إلى مشعب الترشيح وتصفيه من خلال فلتر غشاء النيتروسليلوز 0.45 μm.
    1. أضافه 3 مل من المخزن المؤقت فحص الجليد الباردة التي تحتوي علي تركيز اعلي 10 اضعاف من بوليامينيس المسمي تليها 3 مل من العازلة المقايسة دون بنيه للحد من ربط غير محدد.
    2. نقل الفلاتر المغسولة إلى قوارير التلالؤ القابلة للتصرف بسعة 20 مل والتي تحتوي علي 10 مل من سائل التلالؤ وتحديد النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلالؤ السائل. يقيس العداد تلالؤ النشاط إشعاعي في العينة ويبلغ هو بما ان [ديسديسكايشن] لكل دقيقه ([dpm]).
  5. احسب الامتصاص الصافي للبوليامين كالفرق بين الامتصاص عند 1 دقيقه بواسطة الحويصلات المحتضنة عند 12 درجه مئوية والامتصاص عند 0 دقيقه بواسطة الحويصلات المحتضنة علي الجليد.
    ملاحظه: يتم احتساب كتله الركيزة المستوردة إلى الحويصلات علي النحو التالي. إذا كان حجم العينة في أنبوب الطارد المجهري هو 0.2 μL وتركيز البداية من الركيزة هو 100 μM ، ثم الكتلة الاجماليه من الركيزة في أنبوب ميكروفوجي هو 20 × 10-12 م. بسبب نشاط محدده جدا من ركائز المسمي تجاريا (في كثير من الأحيان 2.22 x 109 Dpm/مم) يمكن تجاهل كتله النظائر المضافة في الحساب. حتى إذا كان المبلغ الإجمالي من النظائر التي تمت اضافتها إلى أنبوب اللقاح المجهري كان 100 x 106 dpm وكانت الحويصلات امتصاص صافي 1,000 dpm ، ثم الكتلة الاجماليه من الركيزة التي تناولتها الحويصلات كان 1 ٪ من العدد الإجمالي لشامات من الركيزة أو 2 × 10-13 م.
    1. تحديد Km للركازه عن طريق قياس امتصاص 10 ، 25 ، 50 ، 250 و 500 μM الركيزة الشعاعية إلى حويصلات التعبير عن البروتين المستهدف. احسب الحركية باستخدام طريقه الانحدار غير الخطية باستخدام نموذج ميكايليس مينتو لحزمه البرامج الاحصائيه34.
  6. للتجارب المنافسة ، أضافه 100 μM ، 500 μM ، 1 ملم ، 1.5 mM أو 2 مم الركيزة تنافسيه غير الموسومة المحرز في العازلة الفحص إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL التي تحتوي علي 100 μL من الحويصلات في 12 درجه مئوية.
    1. أضافه بوليمين شعاعي (50 μM) إلى أنبوب الطرد المركزي في وقت واحد.
    2. قياس النشاط الإشعاعي المحاصرين داخل الحويصلات كما ذكر أعلاه عن طريق تكرار الخطوات 5 من خلال 5.4.2.
    3. تحديد واضح km (km ، التطبيق) لركائز تنافسيه من خلال قياس امتصاص 10 ، 25 ، 50 ، 250 و 500 μM بوليامينيس radiolabkor في وجود 100 μM أو اعلي الركيزة غير الموسومة واستخدام طريقه الانحدار غير الخطية لرسم المنحني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتلخص الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. لفتره وجيزة ، e. كولاي الخلايا الناقصة في جميع المبادلات بوليامين والتعبير عن AtBAT1 هي مثقف ، طرد ، وغسلها مع العازلة واخضع لتحلل الخلية باستخدام الصحافة الفرنسية. تحلل يميل إلى إنتاج الحويصلات التي هي في الغالب داخل الخارج وفخ العازلة خارج الخلايا. يتم أزاله الحطام الخلوي بواسطة طرد ، ويتم استخدام خطوه ثانيه لجمع غشاء طيني. يتم أعاده تعليق الغشاء بيليه في تريس-Maleate العازلة pH 5.2 وتخز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف انتيبورتر عن طريق التعبير أولا عن البروتين في كولاي ومن ثم توليد الحويصلات الغشائية ، بحيث يمكن ان يكون البروتين المعرب عنها بشكل غير متجانس في نظام خاليه من الخلايا. الاضافه إلى المعدات الموجودة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، تتطلب هذه الاستراتيجية استخدام الصحافة الفرنسية ، والوصول إلى المرافق لاجراء اختبارات النظائر المشعة.

ومن المتطلبات الاساسيه لهذا الأسلوب هو ان البروتين غير المتجانس يستهدف بشكل صحيح إلى غشاء البلازما من <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وجاء الدعم لهذا المشروع من كليه الدراسات العليا BGSU ، ومكتب BGSU من البرامج والبحوث التي ترعاها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3< / sup>H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3< / sup>H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14< / sup>C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP الجسم المضادThermoFisherR931-25يكتشف علامة البولي هيستيدين C-terminal (6xHis) ، ويتطلب مجموعة carboxyl
المجانية للكشف عن
أرابينوزSigma-AldrichA3256
BCA مجموعة فحص البروتينThermoFisher23227Pierce BCA asay عده.
بروموفينول الأزرقBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
طرد مركزيSorvallSS-34 دوار بزاوية ثابتة و GA-6 دوار بزاوية
مطحنة أنسجة DounceLabGenome7777-7Corning 7777-7 الخالط بيركس مع صنبور الصب.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275كوكتيل التلألؤ
EDTASigma-Aldrich
مشعب الترشيحHoeferFH225V
خلية الضغط الفرنسيةGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
GraphPad Prismhttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm< / a>
بيكمانLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
مرشحات غشاء النيتروسليلوزMerck Milliporehawp025000.45 & micro ؛
طقم تنظيف M PCRGenscriptQuickClean II
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةThermoFisherP290-500
بوتريسينفلوكا32810
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةJTBaker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
سلالات: E. coli & Delta ؛ potE740 (ديل) :: كان ، & دلتا ؛ cadB2231::Tn10هذه المخطوطةمتاحة عند الطلب.السلالة ناقصة في مبادلات البولي أمين PotE< / em> و CadB< / em>.
منتجات أبحاثTris-baseT60040-1000
أجهزة الطرد المركزي الفائقةSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT أنابيب الطرد المركزي الدوار ذات الزاوية
ThermoFisher45237أنابيب الطرد المركزي ل S150-AT
ناقلات الدوار: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway Gateway التعبير المتجه ل E. القولوني< / em>
جهاز ثابتة برنامج Glycerol بيروكسيد الهيدروجين KROGER كلوريد البوتاسيوم JT Baker 3040-01 عداد التلألؤ السائل الثابتة

المراجع

  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W. Functional expression of the Chlorella hexose transporter in Schizosaccharomyces pombe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (20), 7949-7952 (1990).
  3. Sauer, N., Stolz, J. SUC1 and SUC2: two sucrose transporters from Arabidopsis thaliana; expression and characterization in baker's yeast and identification of the histidine-tagged protein. The Plant Journal. 6 (1), 67-77 (1994).
  4. Weber, H., Borisjuk, L., Heim, U., Sauer, N., Wobus, U. A role for sugar transporters during seed development: molecular characterization of a hexose and a sucrose carrier in fava bean seeds. Plant Cell. 9 (6), 895-908 (1997).
  5. Huang, J. G., et al. GhDREB1 enhances abiotic stress tolerance, delays GA-mediated development and represses cytokinin signalling in transgenic Arabidopsis. Plant, Cell & Environment. 32 (8), 1132-1145 (2009).
  6. Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiology. 122 (4), 999-1001 (2000).
  7. Garcia-Mata, R., Bebok, Z., Sorscher, E. J., Sztul, E. S. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. Journal of Cell Biology. 146 (6), 1239-1254 (1999).
  8. Liu, J., Sitaram, A., Burd, C. G. Regulation of copper-dependent endocytosis and vacuolar degradation of the yeast copper transporter, Ctr1p, by the Rsp5 ubiquitin ligase. Traffic. 8 (10), 1375-1384 (2007).
  9. Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
  10. Schachtman, D. P., Schroeder, J. I., Lucas, W. J., Anderson, J. A., Gaber, R. F. Expression of an inward-rectifying potassium channel by the Arabidopsis KAT1 cDNA. Science. 258 (5088), 1654-1658 (1992).
  11. Boorer, K. J., Forde, B. G., Leigh, R. A., Miller, A. J. Functional expression of a plant plasma membrane transporter in Xenopus oocytes. FEBS Letters. 302 (2), 166-168 (1992).
  12. Miller, A. J., Zhou, J. J. Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters. Biochimica et Biophysica Acta. 1465 (1-2), 343-358 (2000).
  13. Reinders, A., Sivitz, A. B., Starker, C. G., Gantt, J. S., Ward, J. M. Functional analysis of LjSUT4, a vacuolar sucrose transporter from Lotus japonicus. Plant Molecular Biology. 68 (3), 289-299 (2008).
  14. Kovermann, P., et al. The Arabidopsis vacuolar malate channel is a member of the ALMT family. The Plant Journal. 52 (6), 1169-1180 (2007).
  15. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  16. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211-222 (2006).
  17. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. Journal of Molecular Biology. 260 (3), 289-298 (1996).
  18. Wagner, S., et al. Consequences of membrane protein overexpression in Escherichia coli. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (9), 1527-1550 (2007).
  19. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), e29191(2011).
  20. Takabatake, R., et al. Isolation and characterization of cDNAs encoding mitochondrial phosphate transporters in soybean, maize, rice, and Arabidopis. Plant Molecular Biology. 40 (3), 479-486 (1999).
  21. Picault, N., Palmieri, L., Pisano, I., Hodges, M., Palmieri, F. Identification of a novel transporter for dicarboxylates and tricarboxylates in plant mitochondria. Bacterial expression, reconstitution, functional characterization, and tissue distribution. Journal of Biological Chemistry. 277 (27), 24204-24211 (2002).
  22. Snowden, C. J., Thomas, B., Baxter, C. J., Smith, J. A., Sweetlove, L. J. A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition. The Plant Journal. 81 (5), (2015).
  23. Kashiwagi, K., Igarashi, K. Identification and assays of polyamine transport systems in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 720, 295-308 (2011).
  24. Kashiwagi, K., Miyamoto, S., Suzuki, F., Kobayashi, H., Igarashi, K. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (10), 4529-4533 (1992).
  25. Tsuchiya, T., Rosen, B. P. Calcium transport driven by a proton gradient and inverted membrane vesicles of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 251 (4), 962-967 (1976).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Molecular Systems Biology. 2, (2006).
  27. Nichols, B. P., Shafiq, O., Meiners, V. Sequence analysis of Tn10 insertion sites in a collection of Escherichia coli strains used for genetic mapping and strain construction. Journal of Bacteriology. 180 (23), 6408-6411 (1998).
  28. Sauer, B. P1vir phage transduction. , https://openwetware.org/wiki/Sauer:P1vir_phage_transduction (2011).
  29. Invitrogen. pBAD-DEST49 Gateway Destination Vector. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12283016 (2010).
  30. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory Manual. , 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  31. GlennMills. Thermo Electron French Press Operation Manual. , http://www.glenmills.com/wp-content/uploads/2011/06/GLEN-MILLS-INC.-FRENCH-PRESS-Operating-Manual-Feb-2007-Rev-11.pdf (2007).
  32. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using biochinic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  33. Wright, J. K., Overath, P. Purification of the lactose: H+ carrier of Escherichia coli and characterization of galactoside binding and transport. European Journal of Biochemistry. 138 (3), 497-508 (1984).
  34. PRISM. GaphPad Software. , https://www.graphpad.com/data-analysis-resource-center/ (2019).
  35. Kirchberger, S., et al. Molecular and biochemical analysis of the plastidic ADP-glucose transporter (ZmBT1) from Zea mays. Journal of Biological Chemistry. 282 (31), 22481-22491 (2007).
  36. Deniaud, A., et al. Expression of a chloroplast ATP/ADP transporter in E. coli membranes: behind the Mistic strategy. Biochimica et Biophysica Acta. 1808 (8), 2059-2066 (2011).
  37. Sze, H. H+-Translocating ATPases: Advances Using Membrane Vesicles. Annual Review of Plant Physiology. 36, 175-208 (1985).
  38. Bush, D. R. Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology. 44, 513-542 (1993).
  39. Futai, M. Orientation of membrane vesicle from Escherichea coli prepared by different procedures. Journal of Membrane Biology. 115, 15-28 (1974).
  40. Seckler, R., Wright, J. K. Sideness of native membrane vesicles of Escherichea coli and orientation of the reconstituted lactose: H+ carrier. European Journal of Biochemistry. 142 (2), 269-279 (1984).
  41. LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods in Enzymology. 326, 322-340 (2000).
  42. Goodman, D. B., Church, G. M., Kosuri, S. Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342 (6157), 475-479 (2013).
  43. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المكبس الفرنسيالطرد المركزي الفائقمقايسة الترشيح الغشائيخصوصية الركيزةلطخة ويسترنمقايسة النقل
توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.