مقالة منهجية

توصيف الناقلات غشاء بواسطة تعبير مغاير في كولاي وإنتاج الحويصلات الغشائية

DOI:

10.3791/60009

⸱

ديسمبر 31, 2019

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Bowling Green State University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن وصف طريقه لتوصيف ناقلات الغشاء التي يحركها البروتون في الاستعدادات غشاء الحويصلة التي تنتجها التعبير المغاير في كولاي تحلل من الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير العديد من الطرق لتوصيف وظيفيا ناقلات غشاء الرواية. بوليامينيس في كل مكان في جميع الكائنات الحية ، ولكن لم يتم التعرف علي مبادلات بوليامين في النباتات. هنا ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف الحمالين بوليامين باستخدام الحويصلات الغشاء المتولدة من تحلل من الخلايا القولونية اساشيكوجيا التعبير عن انتيبورتر النبات. أولا ، ونحن عبرت بشكل غير متجانس AtBAT1 في سلاله e. القولونية ناقصه في بوليامين والناقلون الصرف ارجينين. وأنتجت الحويصلات باستخدام الصحافة الفرنسية ، وتنقيتها من قبل نبذ حلول واستخدامها في فحص غشاء الترشيح من الركائز المسمية لإظهار خصوصية الركيزة للناقل. وأظهرت هذه المقايسات ان AtBAT1 هو نقل بوساطة البروتون من ارجينين, حمض γ الامينيه (GABA), بوتريسين و spermidine. سلاله متحولة التي تم تطويرها لفحص AtBAT1 قد تكون مفيده للتحليل الوظيفي لأسر أخرى من المبادلات النباتية والحيوانية بوليامين. ونحن نفترض أيضا ان هذا النهج يمكن استخدامها لتوصيف العديد من أنواع أخرى من مضادات الحمالين ، طالما يمكن التعبير عن هذه البروتينات في غشاء الخلية البكتيرية. E. القولونية هو نظام جيد لتوصيف ناقلات الرواية ، لان هناك طرق متعددة التي يمكن استخدامها لطفرة الناقلات الاصليه.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات المتورطة في الاتجار بالأيض تشكل مستوي أساسيا من التنظيم الفسيولوجي ، ولكن الغالبية العظمي من ناقلات الغشاء النباتي لم تتميز بعد وظيفيا. وقد نفذت عده استراتيجيات لتوصيف بروتينات النقل الجديدة. وقد استخدمت التعابير غير المتجانسة في الكائنات الحية النموذجية مثل الخلايا القولونية والنواة الحقيقية مثل الخميرة والبويضات xenopus وخلايا الثدييات وخلايا الحشرات والخلايا النباتية لتحديد نشاط النقل1. ويفضل الخلايا ذات النواة الحقيقية للتعبير عن البروتينات النواة ، لان التركيب الخلوي الأساسي ، ومسارات تحويل الإشارات ، والنسخ والترجمة أليات متوافقة مع الظروف الاصليه.

كانت الخميرة كائنا نموذجيا هاما لت....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جيل من القولونية المزدوجة تدق خارج متحولة مع محول P1

  1. الحصول علي e. القولونية سلاله واحده المغلوب متحولة δpote و δcadb من e. القولونية الوراثية مركز الأسهم (http://cgsc.biology.yale.edu).
    ملاحظه: سلاله δpote هو كاناميسين مقاومه26 وسلاله δcadb هو المقاومة للتاسكلين27.
  2. بناء سلاله الضربة القاضية المزدوجة Pote/CadB (dko) باستخدام بروتوكول المحول P128.
    1. اعداد الليسات
      1. تمييع ثقافة بين عشيه وضحيها من δpote في LB....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتلخص الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. لفتره وجيزة ، e. كولاي الخلايا الناقصة في جميع المبادلات بوليامين والتعبير عن AtBAT1 هي مثقف ، طرد ، وغسلها مع العازلة واخضع لتحلل الخلية باستخدام الصحافة الفرنسية. تحلل يميل إلى إنتاج الحويصلات التي هي في الغالب داخل الخارج وفخ العازلة خارج الخلايا. يتم أزاله الحطام الخلوي بواسطة طرد ، ويتم استخدام خطوه ثانيه لجمع غشاء طيني. يتم أعاده تعليق الغشاء بيليه في تريس-Maleate العازلة pH 5.2 وتخز.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، ونحن الخطوط العريضة طريقه لتوصيف انتيبورتر عن طريق التعبير أولا عن البروتين في كولاي ومن ثم توليد الحويصلات الغشائية ، بحيث يمكن ان يكون البروتين المعرب عنها بشكل غير متجانس في نظام خاليه من الخلايا. الاضافه إلى المعدات الموجودة في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية ، تتطلب هذه الاستراتيجية استخدام الصحافة الفرنسية ، والوصول إلى المرافق لاجراء اختبارات النظائر المشعة.

ومن المتطلبات الاساسيه لهذا الأسلوب هو ان البروتين غير المتجانس يستهدف بشكل صحيح إلى غشاء البلازما من <.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجاء الدعم لهذا المشروع من كليه الدراسات العليا BGSU ، ومكتب BGSU من البرامج والبحوث التي ترعاها.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM6250
3< / sup>H-putrescinePerkinElmerNET185001MC
3< / sup>H-spermidinePerkinElmerNET522001MC
4-chloro-1-naphtholSigma-AldrichC8890
14< / sup>C arginineMoravek Inc.MC137
ArginineSigma-AldrichA-5006
Anti-His (C-term)-HRP الجسم المضادThermoFisherR931-25يكتشف علامة البولي هيستيدين C-terminal (6xHis) ، ويتطلب مجموعة carboxyl
المجانية للكشف عن
أرابينوزSigma-AldrichA3256
BCA مجموعة فحص البروتينThermoFisher23227Pierce BCA asay عده.
بروموفينول الأزرقBio-Rad161-0404
Carboxypeptidase BSigma-AldrichC9584-1mg
طرد مركزيSorvallSS-34 دوار بزاوية ثابتة و GA-6 دوار بزاوية
مطحنة أنسجة DounceLabGenome7777-7Corning 7777-7 الخالط بيركس مع صنبور الصب.
Ecoscint-HNational DiagnosticsLS275كوكتيل التلألؤ
EDTASigma-Aldrich
مشعب الترشيحHoeferFH225V
خلية الضغط الفرنسيةGlen MillsFA-080A120
GABASigma-AldrichA2129
GlutamateSigma-AldrichG6904
GraphPad Prismhttp://www.graphpad.com/prism/Prism.htm< / a>
بيكمانLS-6500
MaleateSigma-AldrichM0375
NanodropThermoFisher
مرشحات غشاء النيتروسليلوزMerck Milliporehawp025000.45 & micro ؛
طقم تنظيف M PCRGenscriptQuickClean II
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةThermoFisherP290-500
بوتريسينفلوكا32810
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةJTBaker4008
SpermidineSigma-aldrichS2501
سلالات: E. coli & Delta ؛ potE740 (ديل) :: كان ، & دلتا ؛ cadB2231::Tn10هذه المخطوطةمتاحة عند الطلب.السلالة ناقصة في مبادلات البولي أمين PotE< / em> و CadB< / em>.
منتجات أبحاثTris-baseT60040-1000
أجهزة الطرد المركزي الفائقةSorvall MTX 15046960Thermo Fisher S150-AT أنابيب الطرد المركزي الدوار ذات الزاوية
ThermoFisher45237أنابيب الطرد المركزي ل S150-AT
ناقلات الدوار: pBAD-DEST49ThermoFisherGateway Gateway التعبير المتجه ل E. القولوني< / em>
جهاز ثابتة برنامج Glycerol بيروكسيد الهيدروجين KROGER كلوريد البوتاسيوم JT Baker 3040-01 عداد التلألؤ السائل الثابتة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haferkamp, I., Linka, N. Functional expression and characterisation of membrane transport proteins. Plant Biology (Stuttgart). 14 (5), 675-690 (2012).
  2. Sauer, N., Caspari, T., Klebl, F., Tanner, W.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة