مقالة منهجية

معالجة الجنين، قشر البيض، والثقافة الفطرية لمسح المجهر الإلكتروني

DOI:

10.3791/60018

⸱

أغسطس 16, 2019

 , 
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى الرغم من أن الفحص المجهري للإلكترون (SEM) يستخدم على نطاق واسع لإجراء تحليل هيكلي فائق لمختلف العينات البيولوجية وغير البيولوجية، فإن الأساليب التي تنطوي عليها معالجة العينات البيولوجية المختلفة تنطوي على ممارسات فريدة من نوعها. جميع الممارسات التقليدية الموصوفة في المؤلفات لمعالجة العينات لا تزال تجد تطبيقات مفيدة، ولكن التغييرات الدقيقة في إعداد العينة يمكن أن تغير جودة الصورة، وكذلك، إدخال القطع الأثرية. وبالتالي، فإن استخدام تقنية إعداد عينة فريدة من نوعها محددة لنوع الأنسجة التي تم تحليلها مطلوب للحصول على صورة ذات نوعية جيدة مع دقة فائقة الهيكلية. تركز هذه الدراسة على توفير بروتوكولات إعداد العينات المثلى لتصوير الأجنة، والأصداف البيض الصلبة، والثقافات الفطرية باستخدام SEM. وقد أوصي تُوصِّل التحسينات التالية لتحقيق نتائج جيدة للعينات البيولوجية الحساسة الثلاث المختلفة التي تمت دراستها. استخدام المثبتات أكثر اعتدالا مثل 4٪ بارافورمالدهايد أو 3٪ الجلوتالالديهايد تليها الجفاف مع سلسلة الإيثانول إلزامي. الميسليوم الفطري على كتل أجار التي تم الحصول عليها من قبل الثقافات الشريحة تسفر عن سلامة أفضل فائقة الهيكلية بالمقارنة مع الثقافات التي اتخذت مباشرة من لوحات أجار. التجفيف الكيميائي للأجنة مع HMDS يوفر التجفيف دون إدخال القطع الأثرية التوتر السطحي مقارنة مع التجفيف نقطة حرجة. HMDS يمنع تكسير الناجمة عن انكماش كما عينات أقل هشاشة أثناء التجفيف. ومع ذلك، للثقافة الفطرية، التجفيف نقطة حرجة يوفر جودة صورة مقبولة بالمقارنة مع التجفيف الكيميائي. يمكن تصوير قشر البيض مع عدم وجود خطوات إعداد خاصة باستثناء الغسيل الدقيق وتجفيف الهواء قبل التركيب. وتم توحيد منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة المقبولة التي تم الحصول عليها مع كل تجربة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.عند تفسير الصور SEM من العينات البيولوجية، فإنه من التحدي الكبير للتمييز بين الهياكل الأصلية والقطع الأثرية التي يتم إنشاؤها أثناء المعالجة. يتم تشغيل SEM عموما في فراغات عالية جدا لتجنب أي تدخل من جزيئات الغاز التي تؤثر على الحزم الإلكترونية الأولية أو الثانوية أو المتناثرة من العينة10،11. كما أن المواد البيولوجية معرضة للتلف الإشعاعي بسبب خصائصها السيئة أو غير المنضوية. فمن الضروري للعينات المحملة في SEM أن تكون جافة تماما وخالية من أي ملوثات عضوية للقضاء على أي outgassing ممكن في بيئة فراغ عالية10،11. وبما أن العينات البيولوجية تتألف في معظمها من الماء، فإن هناك حاجة إلى تقنيات وقائية إضافية لضمان الاحتفاظ بالهياكل الأصلية.

ويستند القرار الذي تم الحصول عليه إلى تحسين أساليب الإعداد الخاصة بأنواع العينات والمعلمات الآلية المستخدمة. وبالتالي، فمن الضروري تجنب استخدام خطوات المعالجة المعممة لجميع أنواع الأنسجة. وستحتاج بعض العينات البيولوجية إلى معالجة أقل صرامة للحفاظ على هيكلها، في حين قد يلزم مزيد من الوقت والرعاية لأنواع دقيقة من العينات لتجنب إدخال قطع التجفيف، مثل الانكماش والانهيار. إعداد العينة هو خطوة حاسمة في التصوير SEM; نتائج الدراسات المورفومترية تتأثر بشكل ملحوظ بإجراءات إعداد العينات12،13. خطوات التحضير الشائعة للعديد من العينات البيولوجية هي التثبيت والجفاف والطلاء مع معدن مثل الذهب أو البلاتين أو البلاديوم لتحويل أسطحها لتكون موصلة لتحليل SEM. وتختلف طبيعة الخطوات المستخدمة ومزيجها حسب نوع الأنسجة والأهداف المحددة للدراسة. زيادة تهمة، والحساسية للفراغ والضرر شعاع الإلكترون تشكل مشاكل عند معالجة عينات البيولوجية الحساسة لينة، مما يتطلب خطوات معالجة إضافية للحفاظ على الهيكل الأصلي للكائن. استخدام الأساليب التقليدية مثل تحديد تتروكسيد أوزميوم، والجفاف يسبب انكماش وانهيار الأنسجة الحساسة14،15،16،17. والهدف من الدراسة هو وضع منهجيات أنيقة مستمدة من الجمع بين الأفكار من الدراسات السابقة مع التعديلات لإعداد وصورة الأنسجة الحساسة الناعمة (على سبيل المثال، أجنة الزواحف، قشر البيض من السلاحف المطلية، والثقافات الفطرية).

اختيار طريقة تحديد مناسبة هي الخطوة الأولى الأكثر أهمية للتحليل المجهري للعينات البيولوجية. إصلاح الأنسجة مباشرة بعد عزل من كائن حي أمر ضروري لمنع التغيير في مورفولوجيا بسبب التحلل. يجب على المثبت الفعال إنهاء العمليات الخلوية عن طريق permeating الخلايا بسرعة والحفاظ على تأثير لا رجعة فيه لتحقيق الاستقرار في هيكل العينة لتحمل كل من خطوات المعالجة اللاحقة والفحص تحت SEM17 , 18.على الرغم من أن العديد من أساليب التثبيت الكيميائي والفيزيائي معروفة، والتثبيت الكيميائي هو أكثر شيوعا للعينات البيولوجية لتجنب أي تغييرات الخلوية بسبب الانهاليس التلقائي، وتعفن، وآثار التجفيف. هناك العديد من التركيبات الكيميائية المثبتة التي نوقشت في الأدب17،19،20،21،22،23،المثبتات التي تعمل عن طريق denaturing و تخثر الجزيئات البيولوجية، وتلك التي تصلح من خلال الجزيئات الكبيرة عبر التشابك بشكل مشترك. وتستخدم المشروبات الكحولية كالمثبتات denaturing التي تحافظ على البنية الفائقة سيئة جدا وتستخدم في الغالب للميكروسكوب الخفيفة ولا ينصح لتحليل مجهري الإلكترون. المثبتات عبر ربط مثل الفورمالديهايد، الجلوتارهايد، وأوستروكسيد الأوميوم خلق الترابط بين الجزيئية وداخل الجزيئية بين الجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة، وتوفير الحفاظ ممتازة من الهياكل الفائقة11 ،24،25،26. العينات البيولوجية حساسة لدرجة الحرارة. ينصح درجة الحرارة في بداية التثبيت أن تكون 4 درجة مئوية للحد من الحركة الجانبية للبروتينات الغشاء، لإبطاء انتشار الجزيئات بين الخلايا، وإبطاء معدل التثبيت11. الوقت اللازم لإصلاح الأنسجة يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والسرعة التي ينتشر المثبت ويتفاعل مع مكونات العينة. تثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde أو 3٪ الجلوتالالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية هو الأسلوب المفضل لتحليل SEM من العينات المستخدمة في هذه الدراسة لخصائصها اختراقية متسلسلة، والتي تسمح عينات حساسة أصغر ليتم معالجتها17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 27-وزيدت خطوة ما بعد التثبيت مع تتزاز الأوميوم ليس فقط بسبب طبيعته السامة ولكن أيضاً تبين أنه لا يطبق أي ميزة إضافية لتحسين جودة الصورة للعينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة.

تحتوي العينات البيولوجية على سوائل تتداخل مع عملية SEM؛ وبالتالي، فإن العينات تحتاج إلى أن تجفف قبل إدراجه في غرفة عينة SEM. بمجرد ضمان الجفاف، يجب إزالة المذيب من الأنسجة دون إنشاء القطع الأثرية في العينات بسبب التوتر السطحي / التجفيف. وكانت هناك ثلاث طرق تجفيف مختلفة تستخدم عادة أثناء معالجة الأنسجة لتصوير SEM: تجفيف الهواء، وتجفيف نقطة حرجة، وتجميد عينات التجفيف28،29،30،31. عدد قليل من الدراسات تقرير جميع أساليب التجفيف الثلاثة التي تنتج نتائج متطابقة مع عينات الأنسجة الحيوانية28،29،30،31. ومن الممارسات العامة المستخدمة في العينات الصغيرة الجفاف الكيميائي عن طريق سلسلة تركيز تصاعدية من الكحول وسداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS)، ولكن يتم تجفيف عينات أكبر باستخدام أداة تجفيف نقطة حرجة (CPD)32. خلال عملية التجفيف، شكلت قوى كبيرة في تجاويف صغيرة التي يتم تمريرها من خلال العينة عن طريق واجهة السائل / الغاز؛ هذا يمكن أن يؤدي حتى إلى انهيار كامل للهياكل جوفاء33. ويمكن عندئذ أن يخطئ أي تشوه يحدث بسبب العلاج كسمة هيكلية أصلية للعينة. وبالتالي، ينبغي القضاء على الظاهرة المعممة للمعالجة، وينبغي توحيد عملية تجفيف فريدة من نوعها لكل نوع من الأنسجة خاصة عندما يتم تحليل عينات الأنسجة الحساسة.

في العديد من التجارب التي أجريت باستخدام مزيج مختلف من جميع العمليات المذكورة أعلاه، قمنا بتوحيد الأساليب التي يمكن استخدامها لتحليل SEM لثلاثة أنسجة حساسة: أجنة الزواحف، وقذائف البيض من السلاحف المرسومة، والثقافات الفطرية. يصف علماء الأحياء التنموية وعلماء المورفولوجيا التكوين الطبيعي وغير الطبيعي أثناء نمو الأجنة في الحيوانات الفقارية التمثيلية. تعتمد التحقيقات في مسارات الإشارات الجينية على الوصف المورفولوجي للهياكل الجديدة. لتجنب أي تغيير مفاجئ في بنية الأجنة الفقارية أثناء تحليل SEM، نوصي بالتجفيف الكيميائي بعد الجفاف. التجفيف الكيميائي باستخدام HMDS هو أحدث طريقة تجفيف نسبيا وتشمل المزايا السرعة النسبية، وسهولةالاستخدام، وفقدان التكلفة، والخبرة المحدودة والمعدات اللازمة 9. CPD هو تقنية التجفيف شائعة الاستخدام باستخدام تمرير ثاني أكسيد الكربون2 عبر العينات في درجة حرارة والضغط محددة. لقد حددنا أن HMDS مناسب لتجفيف الأنسجة الحساسة الناعمة ويسمح بمعالجة عينات أكبر مقارنة بتجفيف النقاط الحرجة، مما تسبب في تشوه واسع النطاق للأنسجة الجنينية. وقد استخدمت عدة طرق لإعداد عينات لتصوير SEM لدراسة الخصائص المورفولوجية للفطريات34. يتم إصلاح العينات الفطرية عادة في تتزاز أوزميوم تليها جفاف الإيثانول وتجفيف نقطة حرجة، والتي قد توفر نتائج مرضية، على الرغم من أن الآثار السامة لأكسيد الأوساميوم6و7و35 وفقدان المواد الفطرية أثناء تغيير الحلول أثناء المعالجة هي عيوب واضحة. كما تم ممارسة تقنية إعداد العينات باستخدام تجفيف الهواء دون تثبيت36 ولكن النتائج في هياكل تقلصت ومطوية، ومراقبة مثل هذه العينات يمكن بسهولة أن يساء تفسيرها مع تميز الأنواع. الهيفا الفطرية يفقد سلامتها في الاتصال مع السوائل وحتى التجفيف قد لا يتحقق لاستعادة الهيكل. ونتيجة لهذا الغرض، يستخدم تجميد التجفيف عادة لتجفيف الأنسجة الرخوة مثل الميسليوم الفطري. تجميد التجفيف يعمل بشكل جيد للمواد النظيفة ولكن وجود أي أملاح أو إفراز سوف تحجب التفاصيل السطحية التي سيتم تحديدها فقط في مرحلة مشاهدة SEM. نحن جنبا إلى جنب مع طريقة ثقافة الشريحة مع إصلاح الجلوتارهايد والتجفيف نقطة حرجة لإنتاج التفاصيل الهيكلية من الهيبهاي الفطرية سليمة والجراثيم. على الرغم من أن تجفيف CPD تسبب انكماش في الأجنة، أدى إلى هياكل مسيليال الحفاظ عليها بشكل جيد عندما يقترن تثبيت الجلوتالالديهايد. قشر البيض هو من الأهمية بمكان لجنين الحيوانات oviparous ليس فقط من خلال العمل كغطاء وقائي ولكن أيضا توفير الاستقرار الميكانيكي، نفاذية للغاز والماء، واحتياطي الكالسيوم للجنين النامية. وتصنف قشرة بيض السلاحف في المياه العذبة على أنها "جامدة" علىأساس هيكلها، ونظرا لتوافرها قد تلقت اهتماما كبيرا من علماء الأحياء 1،2،3،4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.

نحن بالتفصيل طرق بسيطة لسهولة فحص قشر البيض وأغشية قذيفة من السلاحف المطلية التي يمكن تطبيقها على أي أنواع قشر البيض جامدة. وتم تقييم منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة الناتجة عن ذلك وانخفاض القطع الأثرية المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم جمع السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض المستخدمة في هذه الدراسة خلال موسم التعشيش من مايو حتى يونيو 2015-16 من محطة رايس كريك الميدانية، أوغويغو نيويورك بإذن تم الحصول عليها من وزارة البيئة في ولاية نيويورك الحفظ (DEC).

1. طريقة التجفيف الكيميائي لمعالجة الأجنة لSEM

  1. جمع بيض السلاحف من المواقع الميدانية خلال موسم التعشيش. إعداد غرف الحضانة مقدما، مصنوعة من صناديق بلاستيكية مع أغطية (L × W × H) 6.7 سم × 25.4 سم × 10.2 سم مليئة الفراش المتوسطة أعدت مع خليط رطب من الفيرميكوليت والخث الطحلب (1:1 نسبة). جعل 4-6 ثقوب من حوالي 0.25 سم على طول جانبي الصناديق وعلى الغطاء للسماح بـ aeration.
  2. إزالة التربة بلطف من العش للكشف عن البيض. مسح سطح بيض السلاحف مع صبغة اليود المخففة (1:25,000) للسيطرة على التلوث الميكروبي أثناء الحضانة. وضع براثن منفصلة عن بعضها البعض، قد يختلف حجم مخلب من السلاحف رسمت من 5-9 البيض ووضع الحد الأقصى من 8-9 البيض لكل مربع.
    ملاحظة: التعامل بعناية مع البيض أثناء جمع، مسح، وضع العلامات ووضع داخل مربعات. موقف ومحاذاة البيض يجب أن تكون هي نفسها كما وضعت، أي حركة سوف تمنع نمو الأجنة.
  3. دفن يدويا نصف البيض في الفراش، وتغطية ووضع مربع داخل الحاضنة تعيين في 30 درجة مئوية. حضانة البيض لمدة 10-17 يوما للحصول على المراحل الجنينية 12 و 13 و 18 على التوالي المستخدمة في هذه الدراسة. إضافة الماء المقطر لبلل جزئيا الفراش المتوسطة كل يوم لتجنب الجفاف والحفاظ على مستوى الرطوبة للتنمية الطبيعية للأجنة.
    ملاحظة: الحضانة والأجنة المرحلية هي وفقا لجدول النمو الكامل نشرت في وقت سابق39.
  4. إصلاح الأجنة عن طريق جعل أول قطع على جانب واحد من قشر البيض الظهري وغشاء صفار البيض معا، عمودي إلى محور طويل باستخدام مقص مدبب. أدخل المقص في صفار البيض بعناية لتجنب قطع القرص الجنيني. الآن قطع الجانب الجانبي من البيض على طول المحور الطويل ومن ثم قطع الجانب الآخر من البيض على طول المحور القصير.
  5. قشر فتح قطعة مقتطعة مع جانب الجنين حتى باستخدام ملقط. قطع الجانب الجانبي الآخر من قشر البيض ووضع قطعة مقتطعة في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS في الحموضة من 7.4).
    ملاحظة: يتم تعبئة بيضة السلاحف مع صفار البيض لزجة للغاية والجانب الظهري من الجنين يلتزم غشاء قشر البيض. يتغير غشاء قشر البيض بالقرب من الجنين مع الحضانة من الأبيض الشفاف إلى الأبيض الطباشيري غير الشفاف. وهذا يسمح للمرء بتحديد موقع الجنين في وسط المحور الطويل وينظر إليه على أنه بقعة مكلسة داكنة من الخارج40،41.
  6. استخدام مجهر مجسم لعزل الأجنة جنبا إلى جنب مع غشاء صفار البيض عن طريق تقشير لهم من قشر البيض باستخدام ملقط. إزالة الأغشية خارج الجنين باستخدام ملقط ومقص صغير. نقل الجنين باستخدام ملعقة جنين إلى PBS الطازجة في طبق بيتري لغسل أي دم أو صفار.
  7. استخدام لوحات واضحة 12 جيدا لإصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ بارافورمالدهايد في PBS في 4 درجة مئوية أو في 2-3٪ الجلوتارهايد في PBS. ضع واحد إلى ثلاثة أجنة في كل بئر اعتمادا على حجم الأجنة. تأكد من التسلل الكامل (ستظهر العينات باللون الأبيض) للأجنة القديمة من خلال تمديد فترة التثبيت لمدة 2-3 أيام. شطف الأجنة 3X مع PBS الطازجة لمدة 5 دقائق كل شطف.
    ملاحظة: تجنب إتلاف سطح الجنين باستخدام إدراج البوليسترمع قيعان شبكة البوليستر للوحات 12 جيدا لنقل العينات من مذيب واحد إلى آخر.
  8. عينات الجفاف باستخدام سلسلة من تركيز الإيثانول في الماء المقطر: 30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 95٪، و 100٪ وعلاج العينات لمدة ساعة واحدة في كل محلول الجفاف. كرر الخطوة مع الإيثانول 100٪ مرتين لضمان الجفاف الكامل. إذا لم تستخدم على الفور، وتخزين عينات في الإيثانول 70٪ في -20 درجة مئوية لفترة أطول.
  9. الأجنة الجافة باستخدام سلسلة من سداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS) إلى 100٪ تركيز الإيثانول: 1:2، 2:1 و 100٪. ترك العينات في كل حل لمدة 20 دقيقة والحفاظ على طبق بيتري مغطاة جزئيا خلال هذه العملية.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على HMDS في غطاء محرك السيارة الدخان مع معدات الحماية الشخصية اللازمة كما HMDS هو سام للغاية.
  10. ترك الأجنة في الحل النهائي 100٪ HMDS مغطاة كليا أو جزئيا في غطاء الدخان بين عشية وضحاها مما يساعد في تبخر HMDS، وترك العينات جاهزة لتركيب وطلاء التأتأة. يُغطّى الطبق لإزالة الغبار الذي يستقر فوق العينات.
    ملاحظة: سوف تظهر الأنسجة البيضاء بعد التجفيف الكامل والعينات المجففة جزئيا سوف تبدو صفراء في اللون، وترك هذه الأنسجة في غطاء محرك السيارة الدخان لفترة أطول.
  11. اختيار حجم كعب الألومنيوم والكربون شريط لاصق لكل حجم العينة تحليلها. قم بتركيب العينات المجففة بعناية على كعب دبوس الألومنيوم القياسي (12.7 مم × 8 مم) باستخدام شريط موصل كربوني مزدوج العصا (12 مم).
  12. إدخال عينات شنت في غرفة المغطي تلعثم لمعطف العينة مع فيلم رقيقة جدا من الذهب للقضاء على تأثير تهمة. لوحة ذهبية العينات ل60-120 s في 35 mA التأتأة.
  13. جبل كعب إلى لوحات المسام المقابلة عن طريق ربط بأمان setscrews. نقل حامل العينة إلى أو خارج غرفة عينة SEM باستخدام أداة تبادل العينة. صورة العينات في وضع فراغ عالية مع الجهد شعاع تسارع من 10 كيلوفولت والانبعاثات الحالية 10 درجة مئوية.
    ملاحظة: دائما ارتداء القفازات أثناء التعامل مع العينات، وأصحاب العينات، وكعب تصاعد، وأدوات نقل لتجنب تلوث الشحوم من اليدين إلى نظام SEM.
  14. اختبار التقنيات البديلة المذكورة أدناه لمقارنة دقة العينات التي تم الحصول عليها من الإجراء أعلاه.
    1. وتشمل مرحلة ما بعد التثبيت مع 1٪ تتزاز أوزميوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد الخطوة 1.7.
    2. إزالة جزئيا أو كليا HMDS في الخطوة 1.10 للتبخر السريع من HMDS.
    3. معالجة الأجنة بعد الخطوة 1.8 باستخدام التجفيف النقطة الحرجة (CPD) باتباع الخطوات 3.3-3.4.

2. إعداد قشر البيض لSEM باستخدام طريقة تجفيف الهواء

  1. جمع واحتضان السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض لإصلاح الأجنة كما هو محدد في الخطوات 1.1-1.7.
  2. حفظ قشر البيض في الماء المقطر بعد تثبيت الجنين في الخطوة 2.1. تنظيف قشر البيض جيدا عن طريق نقع في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة على الأقل للقضاء على الصفار والتلوث الزلال.
  3. قشر البيض الجاف للهواء بعد غسلمناديل الاستاتيكيه الحساسة في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. تخزين قشر البيض المجفف في زجاجات عينة نظيفة وصفت من قبل عدد والمرحلة.
  4. جبل، معطف التأتأة وصورة العينات باتباع الخطوات المحددة في الخطوات 1.11-1.13.

3. طريقة التجفيف نقطة حرجة لإعداد الثقافات الفطرية لSEM

  1. إنشاء ثقافات الشرائح
    1. إعداد البطاطا سكر العنب أجار (المساعد الشخصي الرقمي) وسائل الإعلام للثقافات الفطرية: إضافة 39 غرام من قوة المساعد الشخصي الرقمي في 1 لتر من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. مزيج جيدا عن طريق دوامة قارورة والأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: بعد التعقيم، يجب أن يكون حل أجار الساخنة وأنها لن تترسخ قريبا. تبريده بما فيه الكفاية بحيث لا تعطيل المضادات الحيوية.
    2. مزجها من قبل دوامة وصب لوحات (ما يقرب من 10-12 مل من وسائل الإعلام لكل طبق بيتري 10 سم)، كومة بعناية والسماح ترسيخ.
    3. استخدام شفرة مشرط معقمة لقطع كتل صغيرة من أجار حوالي 1/2 إلى 3/4 بوصة. إزالة ووضع كتلة أجار على شريحة المجهر الزجاج نظيفة.
    4. ضع الشريحة في طبق بيتري نظيف لمنع التلوث والحفاظ على الرطوبة أثناء الحضانة.
    5. رفع الشريحة من الجزء السفلي من طبق بيتري باستخدام مسواك معقمة لخلق التوتر السطحي بين لوحة والشريحة لإزالة الشريحة الزجاجية دون تعطيل النمو الدقيق بعد الحضانة.
    6. استخدام حلقة معقمة أو إبرة لنقل بعض الفطريات من إينوكولوم العينة إلى كل من الجوانب الأربعة من كتلة أجار على الشريحة.
    7. ضع غطاء نظيف على سطح كتلة أجار بعد التلقيح. إضافة بضع قطرات من الماء المقطر المعقمة إلى طبق بيتري حول الشريحة لضمان الرطوبة للفطريات المتنامية.
    8. ختم لوحة جزئيا باستخدام فيلم البارافين واحتضان لوحة في 30 درجة مئوية لمدة مناسبة من الزمن (لحضانة الأنواع Fusarium لمدة 36 إلى 48 ساعة).
    9. إزالة الشريحة من طبق بيتري وفصل غطاء التمسك بإحكام من كتلة أجار باستخدام ملقط معقمة. إصلاح كتل أجار في 3٪ الجلوتالالدهايد في PBS بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. تجفيف العينات عن طريق تمرير من خلال سلسلة الإيثانول: 10٪، 25٪، 50٪، 75٪ و 90٪ مع 15 دقيقة لكل تغيير. معالجة العينات للجفاف النهائي مع تغييرين في الإيثانول 100٪ تستمر 30 دقيقة لكل منهما لضمان التشبع الكامل.
  3. التجفيف النقطة الحرجة: وضع عينات المجففة في غرفة جهاز CPD. ختم وتبريد الغرفة عن طريق فتح الصمامات للسماح السائل CO2 في وتنفيس الإيثانول بها، حتى السائل CO2 يملأ تماما الغرفة.
    1. ختم وتسخين الغرفة ببطء لتحقيق نقطة حرجة عندما يتجاوز ضغط الغرفة 1000 رطل لكل بوصة مربعة وتتجاوز درجة الحرارة 31 درجة مئوية، ومرحلة السائل والغاز منثاني أكسيد الكربون في التوازن. استنزاف ببطء CO2 من الغرفة والعينة كغاز لتجنب آثار التوتر السطحي.
  4. تنفيذ التركيب وطلاء الذهب وتصوير العينات باتباع الخطوات المحددة في الخطوات 1.11-1.13.
  5. إجراء تحليل مقارن عن طريق تجفيف العينات كيميائيا من الخطوة 3.2 باستخدام HMDS باتباع الخطوات 1.9-1.13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 التحليل المجهري للإلكترون للسلحفاة المطلية (Chrysemyspicta) الأجنة. تم استخدام بيض السلاحف المطلية التي تم جمعها واحتضانها على وسط الفراش، التي شنت على كعب الألومنيوم بعد التجفيف الكيميائي لتصوير SEM (الشكل1A-E). تظهر الرؤية الجانبية للجنين في المرحلة 12 هياكل الوجه القحفي. تمتد البروز الفكية إلى ما وراء الفك السفلي وتحد من حفرة أنفية ملحوظة بشكل جيد. كما لوحظت خمسة أقواس البلعوم (الشكل1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراستنا، تم اختبار عوامل التثبيت المختلفة، وطرق الجفاف والتجفيف لإعداد ثلاث عينات بيولوجية حساسة مختلفة لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض، والثقافات الفطرية. يستخدم SEM عادة لتحليل السطح، لذلك الاختراق المثبت هو أقل فيما يتعلق، ولكن يجب أن يكون مفهوما أن الهياكل الداخلية الثابتة سيئة سوف يسبب تقلص الداخل و / و/وانهيارات الهياكل السطحية. وينبغي أيضا النظر في تمديد وقت التثبيت لعينات الأنسجة أكبر، واستبدال الحل المثبت عدة مرات اعتمادا على مدة التثبيت. بسبب التفاعل النشط بين المثبت والأنسجة ، فإن الخصائص التناضحية للخلايا تت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور دانيال بالداسار، سوني أوسووغو على المناقشات والتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من منح رايس كريك المنتسبة، أوغويغو؛ منح التحدي سوني أوسويوغو والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المنح الصغيرة إلى PGL وJG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجارفيشر S25127A علميلمزارع الشرائح
كعب دبوس الألومنيومTedpella1611112.7 مم × 8 مم
BD Difco وسائط الثقافة المجففة: سكر العنب البطاطا أجارBD 213400DF0013-17-6وسائط لعزل وزراعة الفطريات والخميرة والعفن
الكواشف الحيوية ChloramphenicolFischerBP904-100مضاد حيوي للوسائط
الخشنة الفيرميكوليتالدفيئة MegastoreSO-VER-12الفراش متوسط
واضح 12- لوحة بئرCorning07-201-589لتثبيت الأجنة
CoverslipsFischer ScientificS17525B لثقافة الشرائح
مجفف النقطة الحرجةQuorum CPDEMS850النقطة الحرجة
أطباق ثقافةFischer Scientific08 747Bطبق بتري 100 × 10 مم 12 / PK
الإيثانولفيشر العلميA406P 4عامل الجفاف
الملقط- ملاقط الدلوTedpella5804نمط 4 ، الطول 108 مم ، الوزن × سمك 0.017 × 0.17 مم
الجلوتارالديهايدفيشر ScientificG151-1مثبت
الهدف الذهبي لطلاء الرشDENTON VACUUMTAR001-0158الهدف الذهبي ، 2.375 &Prime. D X .002 & Prime ؛
HexamethyldisilazanaFischer ScientificC19479-5000عامل التجفيف الكيميائي
مناديل كيم المبللةKimtechS-8115تنظيف
شرائح المجهرThermo Scientific67-762-16لمقص الفحص المجهري لثقافة الشرائح
Tedpella1327مزدوج المدبب ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، 100 مم L (3-5 / 8 بوصة).
مقص دقيقTedpella1346نوع Vannas ، مستقيم ، 80 مم L
Moria مثقب الجنين ملعقةأدوات العلومالدقيقة 10370-17الطول 14.5 سم ، قطر الطرف 20 مم ، عمق الملعقة 5 مم
Netwell InsertsCorning0330B0915 مم إدراج مع 74 & micro ؛ م غشاء بوليستر بحجم شبكة يعمل كناقلات يدوية أثناء معالجة العينات في مذيبات مختلفة
ParaformaldehydeFischer ScientificT353 500مثبت
الخث الطحالبوول مارت- معجزة Gro551705263الفراش متوسط
علامات تبويب PELCO شريط موصل كربوني مزدوجالعصا Tedpella500012 مم OD
Sputter المغطيDENTON VACUUMDESK Vطلاء معدني رقيق
SEMJEOL USAJEOL JSM 6610LV مسح إلكتروني نطاقالمجهر الإلكتروني
تجفيف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
  18. Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405(1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HMDS

مقالات ذات صلة