Method Article

التمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة في ميتوتشوندريون الذرة باستخدام استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR

DOI:

10.3791/60019

⸱

July 29th, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources, South China Agricultural University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding, College of Agriculture, South China Agricultural University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم استراتيجية دائرية تستند إلى RT-PCR من خلال الجمع بين التعميم RT-PCR، الكمية RT-PCR، RNA 5 'العلاج متعدد الفوسفات، ووصمة عار الشمالية. ويتضمن هذا البروتوكول خطوة تطبيع للتقليل إلى أدنى حد من تأثير ثلاثي الفوسفات غير المستقر 5'، وهو مناسب للتمييز ورسم خرائط للنصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوتشوندريون الذرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الميتوكوندريا النباتية، تحتوي بعض النصوص ذات الحالة الثابتة على 5'ثلاثي الفوسفات مشتق من بدء النسخ (النصوص الأولية)، في حين تحتوي النصوص الأخرى على 5'أحاديالفوسفات ولدت بعد النسخ (النصوص المجهزة). للتمييز بين هذين النوعين من النصوص، تم وضع العديد من الاستراتيجيات، ويعتمد معظمها على وجود/غياب ثلاثي الفوسفات 5.... ومع ذلك، فإن ثلاثي الفوسفات في المرحلة الابتدائية 5 'تيرميني غير مستقر، وأنه يعوق تمييز واضح من هذين النوعين من النصوص. للتمييز بشكل منهجي وخريطة النصوص الأولية والمجهزة المتراكمة بشكل كبير في ميتوشوندريون الذرة، قمنا بتطوير استراتيجية دائرية RT-PCR (cRT-PCR) القائمة على الجمع بين cRT-PCR، الحمض النووي الريبي 5 'علاج متعدد البوخباتازي، الكمية RT-PCR (RT-qPCR)، ووصمة عار الشمالية. كتحسين، وتشمل هذه الاستراتيجية خطوة تطبيع الحمض النووي الريبي للحد من تأثير غير مستقر 5 'ثلاثي الفوسفات.

في هذا البروتوكول، يتم معالجة الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب مسبقا من قبل RNA 5 'polyphosphatase، الذي يحول 5 'triphsophate إلى أحادي الفوسفات. بعد التعميم والنسخ العكسي، يتم تطبيع اثنين من cDNAs المستمدة من 5 'متعدد الفوسفاتيز المعالجة وغير المعالجة RNAs من قبل الذرة 26S rRNA ناضجة، والتي لديها نهاية معالجة 5 'وغير حساسة ل5'polyphosphatase. وبعد التطبيع، يتم التمييز بين النصوص الأولية والمجهزة عن طريق مقارنة منتجات cRT-PCR وRT-qPCR التي تم الحصول عليها من التقييمات RNAs المعالجة وغير المعالجة. يتم تحديد termini النص عن طريق الاستنساخ وتسلسل منتجات cRT-PCR، ومن ثم التحقق من قبل وصمة عار الشمالية.

باستخدام هذه الاستراتيجية، تم تحديد معظم النصوص ثابتة الدولة في ميتوشوندريون الذرة. بسبب نمط النسخ المعقد لبعض الجينات الميتوكوندريا، لم يتم تمييز بعض النصوص الثابتة و/أو تعيينها، على الرغم من أنها تم اكتشافها في لطخة شمالية. نحن لسنا متأكدين ما إذا كانت هذه الاستراتيجية مناسبة للتمييز وخريطة النصوص ثابتة الحالة في الميتوكوندريا النباتية الأخرى أو في plastids.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الميتوكوندريا النباتية، يتم تجميع العديد من RNAs ناضجة والسلائف كما isoforms متعددة، ويمكن تقسيم النصوص ثابت الدولة إلى مجموعتين على أساس الفرق في نهايات ها 5'1،2،3، 4. النصوص الأولية لها 5 'نهايات ثلاثي الفوسفات، والتي تستمد من بدء النسخ. وعلى النقيض من ذلك، فإن النصوص المجهزة تحتوي على 5'أحاديالفوسفات يتم إنشاؤها بواسطة المعالجة اللاحقة للنسخ. التمييز ورسم الخرائط من نوعين من النصوص مهمة لكشف الآليات الجزيئية الكامنة وراء النسخ والانتهاء من النضج النص.

وللتمييز بين النصوص الأولية والنصوص المجهزة في المتن الن....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التمهيدي التصميم 2.

  1. تصميم التمهيديات الجينات محددة للنسخ العكسي (RT) باستخدام PCR التمهيدي تصميم البرمجيات (جدولالمواد)على أساس القواعد العامة للتصميم التمهيدي17.
    ملاحظة: التمهيديات RT هي محددة للغاية للنصوص المستهدفة، وأنها ترتكز عموما على الجزء 5 'من تسلسل الترميز (mRNAs ناضجة والسلائف RNAs)، أو ~ 500-600 NT المصب من نهاية 5 'المتوقعة (18S و 26S rRNAs).
  2. تصميم أزواج من التمهيديات المتباينة لتضخيم النصوص الدائرية من قبل cRT-PCR.
    ملاحظة: التمهيديات المتباينة المقترنة تحيط تقاطع 5'--3 'من النصوص الدائرية، وتختلف مواقفهم بين النصوص المستهدفة التي تم تحليلها (الشكل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدير كفاءة تعميم الحمض النووي الميتوكوندريا

في دراسة سابقة، تم استخدام كل من RNAs الكلي والميتوكوندريا لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في أرابيدوبسي (أرابيدوبيس ثاليانا)،وقدم نوعين من RNAs نتائج رسم الخرائط مماثلة12. في البداية، استخدمنا أيضا مجموع RNAs لرسم خرائط cRT-PCR من الميتوكوندريا نسخة تيرميني في الذرة. بعد العديد من التجارب، وجدنا أن النصوص الم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة سابقة، تم استخدام مجموع وRNS الميتوكوندريا من ثقافة تعليق الخلايا من Arabidopsis لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني من قبل cRT-PCR، وتم الحصول على نتائج مماثلة12. ومع ذلك، تم استخدام الحمض النووي الميتوكوندريا المخصب فقط لرسم خريطة الميتوكوندريا نسخة تيرميني في العديد من الدراسات الأخرى1،2،3،9. وجدنا أن إثراء الحمض النووي الميتوكوندريا هو خطوة هامة ل.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 31600250، Y.Z.)، ومشاريع العلم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201804020015، H.N.)، ونظام البحوث الزراعية الصينية (رقم المنحة. CARS-04-PS09, H.N.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
حمض الخليكعلاء الدين ، الصينA112880لتحضير 1x TAE buffer
Applied Biosystems 2720 Thermal CyclerThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية4359659Thermal Cycler لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
حمض الأسكوربيكسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900134لتحضير المخزن المؤقت للاستخراج
Biowest AgaroseBiowest ، إسبانيا9012-36-6لحل تفاعل البوليميراز المتسلسل المنتجات والحمض النووي الريبي
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةA1933لتحضير المخزن المؤقت للاستخراج
بروموفينول الأزرقسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةB8026لتحضير المخزن المؤقت للتحميل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز واللطخة الشمالية
DEPCسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900882تعطيل مجموعة المبتدئين الشمالية RNase
DIGRoche ، الولايات المتحدة الأمريكية12039672910لوضع العلامات على DIG-RNA واللطخة الشمالية. تحتوي هذه المجموعة على الكواشف الخاصة بوضع العلامات على نسخ الحمض النووي الريبي باستخدام بوليميراز DIG و T7 RNA ، والتهجين والكشف عن التلميء الكيميائي.
EDTASigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900106لتحضير المخزن المؤقت للاستخراج و 1x TAE buffer
EGTASigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةE3889لإعداد عازلة الغسيل
نظام توثيق جلBio-Rad ، USAGel Doc XR +لتصوير جل الاغاروز
GlycerolSigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةG5516لتحضير عازلة التحميل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز
GoldView II (5,000x)Solarbio،. الصينG8142تلطيخ الحمض النووي
Hybond-N + ، غشاء النايلونAmersham Biosciences ، الولايات المتحدةالأمريكية RPN119لمختبر الصور الشمالي
Bio-Rad ، جلالصور USA Image Lab 3.0، وقارن وفرة منتجات PCR.
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900041لتحضير مخزن الاستخراج
KOHعلاء الدين ، الصينP112284لتحضير المخزن المؤقت للاستخراج
L-cysteineSigma-aldrich ، الولايات المتحدةالأمريكية V900399لتحضير الاستخراج العازلة
MillexMillipore ، الولايات المتحدة الأمريكيةSLHP033RBللاستخراج المعقم و غسل المخازن المؤقتة عن طريق الترشيح
MiraclothCalbiochem ، الولايات المتحدة الأمريكية475855-1Rلتصفية أنسجة النواة الأرضية
MOPSSigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900306لتحضير المخزن المؤقت للتشغيل للبقعة الشمالية
NanoDropThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية2000Cلتركيز الحمض النووي الريبي ومقايسة النقاء
NaOHSigma-aldrich ، الولايات المتحدةالأمريكية V900797ل تحضير المخزن المؤقت للغسيل
pEASY-Blunt ناقل الاستنساخ البسيطTransGen Biotech ، الصينCB111استنساخ الفرقة المستردة بالهلام. يحتوي على محفز T7 عدة بت في الثانية في المنبع من موقع الإدخال.
فانتا ماكس سوبر الدقة DNA polymeraseVazyme ، الصينP505DNA polymerase لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
Polyvinylpyrrolidone 40Sigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900008لتحضير المخزن المؤقت
للاستخراج Primer Premier 6.24PREMIER Biosoft ، الولايات المتحدة الأمريكيةPrimer Premier 6.24لتصميم بادئات للنسخ العكسي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
PrimeScript II النسخ العكسيتاكارا ، اليابان2690لتصنيع أول حبلا cDNA
PureLink RNA Mini kitThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية12183025لتنقية الحمض النووي
الريبي RNA 5 'بولي فوسفاتيزEpicentre ، الولايات المتحدةالأمريكية RP8092Hلتحويل 5 'ثلاثي الفوسفات إلى مثبط أحادي الفوسفات
RNaseنيو إنجلاند بيولوجيس ، المملكة المتحدةM0314أحد مكونات الربط الذاتي للحمض النووي الريبي وتفاعلات علاج بولي فوسفاتيز 5 بوصات ، ويستخدم لتثبيط نشاط RNase.
أسيتات الصوديومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدةالأمريكية V900212لتحضير المخزن المؤقت للبقعة الشمالية
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةV900058لتحضير 20x SSC
SsoFas evaGreen supermixesBio-Rad ، الولايات المتحدة الأمريكية1725202ل RT-qPCR
T4 RNA Ligase 1New England Biolabs ، المملكة المتحدةM0437لتدوير الحمض النووي الريبي
رباعي الصوديوم بيروفوسفاتسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية221368لتحضير المخزن المؤقت للاستخراج
طقم تنقية TIANgel midiTiangen Biotech ، الصينDP209لتنقية شظايا الحمض النووي من هلام الاغاروز
تريسعلاء الدين ، الصينT110601لتحضير 1x عازلة TAE
كاشف TRIzolInvitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية15596026لاستخراج الحمض النووي الريبي للميتوكونديرال.
طقم تنقية الحمض النووي العالميTiangen Biotech ، الصينDP214لاستعادة البلاستميدات الخطية من تفاعل هضم إنزيم التقييد
Xylene cyanol FFSigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكيةX4126لإعداد عازلة التحميل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, Y., et al. Major contribution of transcription initiation to 5'-end formation of mitochondrial steady-state transcripts in maize. RNA Biology. 16 (1), 104-117 (2019).
  2. Choi, B. Y., Acero, M. M., Bonen, L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular RT PCRRNA 5 PolyphosphataseMitochondrial RNA ExtractionQuantitative RT PCRNorthern BlotMaize MitochondrionTermini MappingPrimary Processed TranscriptsRNA NormalizationDivergent Primers

Related Articles