يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60023

⸱

سبتمبر 7, 2019

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكول التفكك الميكانيكية لعزل الضامة بسرعة من العقدة الجذر الظهري للنماذج الظاهرية والتحليل الوظيفي.

الملخص

هناك اهتمامات متزايدة لدراسة التفاعلات الجزيئية والخلوية بين الخلايا المناعية والخلايا العصبية الحسية في العقد ية الجذر الظهري بعد إصابة العصب المحيطي. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة، تستجيب لإصابة الأنسجة من خلال داء الفيغوسية، وعرض مستضد، وإطلاق سراح السيتوكين. وقد تورطت الأدلة الناشئة مساهمة الضامة جذور الظهر في تطوير الألم العصبي وإصلاح axonal في سياق إصابة الأعصاب. الفينول بسرعة (أو "العزلالسريع من") استجابة الضامة الجذور الظهرية في سياق إصابة الأعصاب هو المطلوب لتحديد عوامل المناعة العصبية غير معروف. هنا نبين كيف أن مختبرنا يعزل الضامة بسرعة وفعالية من العقد الجذرية الظهرية باستخدام بروتوكول فك نأفة ميكانيكية خالية من الإنزيمات. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد في جميع أنحاء للحد من الإجهاد الخلوي. هذا البروتوكول هو أقل بكثير من الوقت المستهلكة بالمقارنة مع البروتوكول الأنزيمي القياسية، وقد استخدمت بشكل روتيني لتحليلنا فرز الخلايا تنشيط الفلورة.

المقدمة

هناك الآن أدلة كبيرة على أن الخلايا المناعية تسهم في الألم العصبي بعد إصابة العصب المحيطي1،2. ومن المعروف أن الخلايا الأحادية الطرفية، بما في ذلك الضامة الناضجة، تستجيب لإصابة الأنسجة والعدوى الجهازية من خلال داء البلغم، وعرض المستضد، وإطلاق السيتوكين. بالتوازي مع تنشيط microglia الناجم عن إصابة الأعصاب في القرن الظهري الشوكي ، توسع الضامة في العقد ية الجذر الظهرية (DRG) بشكل كبير بعد إصابة الأعصاب3،4. وتجدر الإشارة إلى أن هناك مصالح متزايدة لتحديد ما إذا كانت الضامة تسهم في نمو الألم العصبي بعد إصابة الأعصاب المحيطية من خلال التفاعل مع الخلايا العصبية الحسية في DRG5،6،7، 8 , 9 , 10 سنوات , 11.وعلاوة على ذلك، والدراسات الحديثة تورط أيضا مساهمة الضامة DRG في إصلاح axonal بعد إصابة الأعصاب12،13. وتشير دراسة أخرى كذلك إلى أن التجمعات السكانية الفرعية في الضامة (أي CD11b+Ly6Chi وCD11b+Ly6Cمنخفضة/- الخلايا) قد تلعب دوراً مختلفاً في فرط الحساسية الميكانيكية14. ولذلك، فإن الفينول بسرعة استجابة الضامة DRG في سياق إصابة الأعصاب قد تساعدنا على تحديد عوامل المناعة العصبية التي تسهم في الألم العصبي.

تقليديا ، فإن بروتوكول عزل الضامة في DRG ينطوي على خطوات متعددة بما في ذلك الهضم الأنزيمي15،16. وغالبا ما تستغرق هذه التقنية وقتا طويلا ويمكن أن تكون مكلفة بالنسبة للتجارب الواسعة النطاق. على الرغم من أن الهضم الخفيف مع الكولاجين النوع الثاني (4 ملغ / مل) وديسباس النوع الثاني (4.7 ملغ / مل) لمدة 20 دقيقة أوصى سابقا15، فمن المتصور أن الخلايا بعد التعرض لهذا الإنزيم عرضة لتلف الخلايا أو موت الخلايا ، والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الفرق في نوعية الإنزيمات من دفعة إلى دفعة قد يؤثر بشكل أكبر على كفاءة هذه العملية. والأهم من ذلك، الضامة المعرضة لهضم الإنزيم قد تكون محفزة بشكل غير مرغوب فيه، وبالتالي يمكن أن تكون مختلفة جدا عن الوضع في الجسم الحي. وقد تؤدي التغييرات إلى تعقيد نتائج الدراسة الوظيفية.

هنا نقوم بوصف بروتوكول خال من الإنزيم لعزل الضامة DRG بسرعة في 4 درجة مئوية باستخدام التفكك الميكانيكي. يتم الاحتفاظ العينات على الجليد للحد من الإجهاد الخلوي. ونتيجة لذلك، يوفر نهجنا ميزة للحفاظ على اتساق العزلة، ويفترض أن الخلايا المعزولة هي أكثر صحة وأقل تحفيزا. كما نقدم الأدلة للتحقق من جودة الخلايا المعزولة مع تحليل فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو وأجريت وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. جمع DRG القطنية من الفئران التجريبية

  1. قبل بدء التجربة، قم بإعداد حل العمل لوسط تدرج الكثافة (على سبيل المثال، Percoll) عن طريق خلط 9 وحدات تخزين من الوسط مع 1 وحدة تخزين من Ca++/Mg++-free HBSS. أبقيه على الثلج
  2. التخدير الماوس مع 2.5٪ Avertin. تأكد من أن الحيوان هو التخدير الكامل من قبل عدم الاستجابة لقرصة مخلب الخلفية.
    ملاحظة:تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.
  3. Perfuse الماوس transcardially مع 10 مل من قبل المبردة 1X PBS.
    1. وضع الماوس في موقف supine مع أربعة الكفوف المضمون مع الشريط داخل غطاء محرك الدخان الكيميائية. رفع الجلد تحت القفص الصدري من قبل ملقط، وجعل شق صغير مع مقص الجراحية لفضح الكبد والحجاب الحاجز.
    2. الاستمرار في استخدام مقص لقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري، وفتح التجويف الجنبي لفضح القلب النابض.
    3. بسرعة قطع الزائدة الأذينية الحق مع مقص قزحية العين. بمجرد ملاحظة النزيف، أدخل إبرة 30 G في الطرف الخلفي من البطين الأيسر، وحقن ببطء 10 مل من PBS 1X المبردة مسبقا لperfuse الحيوان.
  4. إجراء استئصال الصفيحات الظهرية15 على الماوس وضعت في موقف عرضة.
    ملاحظة: إذا تم التخطيط لثقافة الخلية، رش الماوس مع الإيثانول 70٪ قبل شق واستخدام الأدوات الجراحية قبل تعقيمها للتشريح.
    1. استخدم مشرط بحجم 11 لإجراء شقوق جانبية طولية عميقة تبدأ من منطقة الصدر وصولاً إلى المنطقة العجزية. إزالة الجلد عن طريق مقص لفضح طبقة العضلات الظهرية.
    2. استخدم فريدمان بيرسون رونجور لتقشير الأنسجة الضامة والعضلات حتى يتم الكشف عن عمليات العمود الفقري اللوبوسكرال والعمليات العرضية الثنائية.
    3. استخدم مقص ربيع نويس لفتح العمود الفقري الظهري بعناية، ثم قم بالتبديل إلى فريدمان بيرسون رونغور لإزالة العظام الفقرية لفضح الحبل الشوكي مع الأعصاب الشوكية السليمة المرفقة.
  5. تشريح بعناية ipsilateral والمضادة القطنية DRG (L4 /L5 DRG في دراستنا) ووضعها في 1 مل من الجليد الباردة Ca++/ Mg++خالية 1X HBSS في المجانسة الأنسجة Dounce. الآن الأنسجة جاهزة للخطوة 2.
    ملاحظة: تقليم العصب الشوكي تعلق على DRG إذا كان ذلك ممكنا.

2. عزل خلايا واحدة من الماوس القطني DRG

  1. تجانس أنسجة DRG مع مدقة فضفاضة في الخالطون Dounce 20-25 مرات.
  2. ضع مصفاة خلية نايلون معقمة بـ 70 م في أنبوب مخروطي معقم بـ 50 مل. الرطب مصفاة الخلية مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS، ويتم جمع تدفق من خلال في أنبوب مخروطي.
  3. جمع تعليق الأنسجة المتجانسة من المجانسة باستخدام ماصة وتمر من خلال الرطب 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب مخروطي 50 مل.
  4. شطف المجانسة مرتين مع 800 درجة مئوية من الجليد البارد 1X HBSS ثم decant في نفس أنبوب مخروطي 50 مل مع مصفاة الخلية لزيادة الغلة.
  5. أضف 1.5 مل من وسط تدرج الكثافة متساوي التوتر المثلج (المعد في الخطوة 1.1) إلى أنبوب معقمة من البوليستيرين FACS بـ 5 مل.
  6. نقل التجانس الخلية من أنبوب مخروطي 50 مل (في الخطوة 2.4) في أنبوب FACS، مزيج جيد مع وسط التدرج الكثافة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. أضف 500 ميكرولتر إضافية من HBSS 1x لإغلاق الجزء العلوي.
  7. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  8. يستنشق بعناية supernatant التي تحتوي على الملين في المتوسط دون إزعاج بيليه الخلية في الجزء السفلي من أنبوب FACS.
  9. إعادة تعليق الخلايا في PBS أو FACS العازلة التي تحتوي على 5٪ مصل البقر الجنيني (FBS) لتحليل FACS.
    ملاحظة: من المتوقع أن يكون هناك ما لا يقل عن 50,000 إلى 100,000 خلية من L4/L5 DRG ماوس واحد.
    1. إعادة تعليق خلايا DRG المعزولة ميكانيكيًا (L4/L5) في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على مصل البقر الجنيني بنسبة 5% ثم الحضانة مع الأجسام المضادة CX3CR1-APC (1:2000) في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    2. غسل الخلايا مع 5 مل من PBS مرة واحدة. الطرد المركزي الخلايا 360 × ز لمدة 8 دقائق في 4 درجة مئوية.
    3. يستنشق supernatant، ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 300 درجة مئوية من PBS لتحليل FCAS. إذا تم تخطيط فرز الخلايا، قم بإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS بدلاً من ذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من صحة الخلايا المعزولة، اخترنا أولا ً الفئران المعدلة وراثياً (MAFIA)17. هذا الخط يعبر عن البروتين FK506 المخدرات الانضج (FKBP)-فاس الانتحار الانصهار الجينات والبروتين الفلورسنت الأخضر (eGFP) تحت سيطرة المروج لمستقبلات CSF1 (CSF1R)، والتي يتم التعبير عنها على وجه التحديد في كل من الضامة وmicroglia. حقن الجهازية من ديمرزر البروتين ربط FK, AP20187 (AP), يحفز المبرمج من الخلايا التي تعبر عن transgene. التعبير عن EGFP يسمح لنا أيضا لمراقبة الضامة في DRG. لاستنفاد الضامة في الفئران المافيا، بدأ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نقدم طريقة جديدة لإثراء بفعالية الضامة المعزولة من الماوس DRG. النهج التقليدي لعزل الخلايا المناعية DRG يتطلب الهضم الأنزيمي15،18، والتي يتم استبدالها الآن مع التجانس الميكانيكية في بروتوكولنا للحد من تلف الخلايا غير المرغوب فيها وزيادة الغلة. ولذلك، فإن البروتوكول الجديد أقل استهلاكاً للوقت بكثير. والأهم من ذلك، قد يحفز هضم الإنزيم الضامة ويغيّر التوقيع الجزيئي. وعلى النقيض من ذلك، فإن نهجنا الميكانيكي يحد إلى حد كبير من الإجهاد الخلوي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة تتعلق بهذه المخطوطة.

شكر وتقدير

وقد تم دعم الدراسة من قبل: مؤسسة التثقيف والبحوث التخدير (XY)؛ قسم التخدير والرعاية المحيطة بالجراحة (XY) في جامعة كاليفورنيا في لوس أنسياف. و1R01NS100801-01 (GZ). وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل مختبر HDFCCC لتحليل الخلايا مرفق الموارد المشتركة من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (P30CA082103).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AP20187Clontech635058
&# 945;-mouse CX3CR1-APC الأجسام المضادةBiolegend149007
AvertinSigmaT48402
(70 مم نايلون)Falcon352350
الطرد المركزيEppendorf5810R
Dounce مخالط الأنسجةWheaton357538 ( 1 مل)
أنابيب FACS (5 مل)فالكون352052
فريدمان بيرسون رونجرFST16121-14
HBSS (10x ، Ca ++ / Mg ++ - مجاني)Gibco14185-052
Noyes Spring ScissorFST15012-12
PercollSigmaP4937-500ml
بروبيديوم يوديدسيجماP4864-10 مل
مصفاة الخلية

المراجع

  1. Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
  2. Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
  3. Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
  4. Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778(2017).
  5. Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
  6. Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
  7. Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
  8. Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029(2016).
  9. Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
  10. Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
  11. Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
  12. Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  13. Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
  14. Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
  15. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
  16. Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
  17. Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
  18. Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460(2017).
  19. Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  20. Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

عزل الخلايا البلعميةالتفكيك الخالي من الإنزيماتبروتوكول التفكيك الميكانيكيفرز الخلايا المنشط بالفلوريةالطرد المركزي بتدرج الكثافةصبغ الأجسام المضادة لـ CX3CR1تقييم حيوية الخلاياتجنيس أنسجة العقد الجذرية الظهريةنموذج إصابة العصب
العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.