Method Article

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

DOI:

10.3791/60029

⸱

August 21st, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتحكم التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين في السلوك الخلوي، من الحركة إلى النسخ المتماثل للحمض النووي إلى تحويل الإشارة. ومع ذلك، فإن رصد التفاعلات الديناميكية بين البروتينات المتعددة في شبكة تفاعل البروتين أمر صعب من الناحية التقنية. هنا، نقدم بروتوكول اتونى الكمية متعددة المناعة (QMI)، والذي يسمح بالتقييم الكمي للتغيرات أضعاف في تفاعلات البروتين على أساس قياسات الفلورة النسبية من البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل يتعرض الepitopes السطحية (PiSCES). في QMI، يتم تسريع مجمعات البروتين من الليسات الخلوية المناعية على الميكروسفيرات، ومن ثم يتم فحصها بجسم مضاد مسمى لبروتين مختلف من أجل تحديد كمية وفرة PiSCES. يتم الجمع بين الأجسام المضادة الترسيب المناعي إلى مناطق الطيفية MagBead مختلفة، مما يسمح لمقياس التدفق للتمييز بين الترسيب المناعي الموازي المتعدد وتحديد كمية الأجسام المضادة للمسبار المرتبطة بكل منها في نفس الوقت. لا يتطلب QMI وضع علامات وراثية ويمكن القيام به باستخدام الحد الأدنى من المواد الحيوية مقارنة بأساليب الترسيب المناعي الأخرى. يمكن تكييف QMI لأي مجموعة محددة من البروتينات المتفاعلة، وقد استخدمت حتى الآن لوصف شبكات الإشارات في الخلايا T ونقاط الاشتباك العصبية الغلوتامات. وقد أدت النتائج إلى توليد فرضية جديدة مع التطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. يتضمن هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ QMI، من التحديد الأولي للوحة الأجسام المضادة حتى تشغيل الاختبارات وتحليل البيانات. التجميع الأولي لفحص QMI ينطوي على فحص الأجسام المضادة لإنشاء لوحة، وتحديد تجريبيا ً المخزن المؤقت للlysis المناسب. ويشمل إعداد الكاشف اللاحق اقتران الأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية إلى MagBeads، والأجسام المضادة التحقيق biotinylating بحيث يمكن وصفها من قبل الفلوروفور مترافق streptavidin. لتشغيل فحص، يتم خلط lysate مع MagBeads بين عشية وضحاها، ومن ثم يتم تقسيم الخرز وحضانة مع الأجسام المضادة التحقيق مختلفة، ومن ثم تسمية فلوروفور، وقراءة من قبل قياس التدفق. يتم إجراء اختبارين إحصائيين لتحديد PiSCES التي تختلف بشكل كبير بين الظروف التجريبية، ويتم تصور النتائج باستخدام خرائط الحرارة أو الرسومات التخطيطية على حافة العقدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين تشكل سلاسل الإشارات الجزيئية والهياكل motile التي هي الأساس الوظيفي لمعظم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. وغالبا ما تصور هذه العمليات على أنها مسارات الإشارات الخطية التي تحول بين الدول الثابتة على أساسمدخلات واحدة، ولكن البيانات التجريبية والنمذجة تبين بوضوح أنها تعمل كشبكات متكاملة 2،3، 4.في حالة البروتينات G, مستقبلات مختلفة غالبا ما يكون القدرة على تنشيط نفس البروتين G, ومستقبلات واحدة يمكن أيضا تنشيط أكثر من نوع واحد من البروتين G5,6. من أجل عدد صغ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم الساي

  1. إعداد الأجسام المضادة المرشح
    1. لكل بروتين من الفائدة، اختر 3 إلى 5 أجسام مضادة للشاشة. عند الإمكان، استخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تعترف بالإبالعامة المختلفة. وتشمل أيضا واحد الأجسام المضادة عنصر تحكم غير محددة.
    2. لإزالة Tris، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق إضافة الجسم المضاد إلى فلتر دوران 30 كيلوDa، والدوران وصولاً إلى الحد الأدنى لحجمها، وإضافة 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وتكرار 3 مرات. لإزالة البروتينات الحاملة، قم بتنقية الأجسام المضادة وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (راجع جدول المواد للاطلاع على توصية تنقية محددة).
      ملاحظة: يتم ذلك لأن البروتينات الناقل والمخازن ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص الأجسام المضادة
الشكل 2 B يظهر نتائج شاشة للبروتين Connexin36. معظم تركيبات IP_probe تنتج أي إشارة عبر عناصر التحكم IgG. IP مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1E5 والتحقيق مع إما 1E5 أو الأجسام المضادة متعددة النسيلة 6200 تنتج تحولا نحو اليمين في توزيع حبة مقارنة مع الضوابط IgG. هنا، تم اختيار IP 1E5 ومسبار 6200poly لتجنب استخدام نفس الأجسام المضادة مثل IP والمسبار، وكلاهما للحد من احتمال وجود بروتين غير محدد يتم التعرف عليه من قبل اثنين من الأجسام الم.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب اختبار QMI استثمارات كبيرة في تطوير لوحة الأجسام المضادة والمعدات والكواشف، ولكن بمجرد إنشاء الفحص، يمكن للمرء جمع بيانات عالية الأبعاد لمراقبة شبكات التفاعل البروتينية لأنها تستجيب للرقابة التجريبية المحفزات. من الناحية الفنية، QMI يتطلب الأنابيب الدقيقة وتتبع مواقع العينة والأجسام المضادة جيدا. وضع العلامات بعناية لوحات الاختبار مفيد، كما هو جعل قالب مفصل من مواقع جيدا على الورق، والتي يتم حفظها بعد ذلك لتحليل البيانات. لا يمكن المبالغة في أهمية الحفاظ على الخرز وlysate الباردة في جميع الأوقات، بما في ذلك في تدفق.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في الاعتراف بـ Tessa Davis لمساهماتها الهامة في تطوير تحليل QMI، والأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات سميث وشروم للتوجيه التقني والمدخلات الفكرية. تم تمويل هذا العمل من خلال منح NIMH R01 MH113545 و R00 MH 102244.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 بئر ألواح مسطحةBio Rad171025001
ألواح PCR 96 جيدا VWR82006-704
نظام Bioplex 200 مع HTFBio Rad171000205تعديل للحفاظ على الثلاجة جزئيا ، انظر الشكل S1 للحصول على التفاصيل
Bio-Plex Pro Wash StationBio Rad30034376
BSASigma
حبات CMLInvitrogenC37481
EDTASigmaE6758
EZ-Link Sulfo-NHS-BiotinThermo ScientificA39256
MagPlex MicrospheresLuminexMC12xxx-01xxx هي منطقة حبة
Gelon Gel IgG Spin PurificationKit Thermo Scientific45206المستخدمة لتنقية
MESSigmaM3671
فيلم Microplate ، غير معقمالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2920-0000
كوكتيل مثبط الفوسفوتاز # 2كوكتيل مثبط البروتياز SigmaP5726
SigmaP8340
ساندويتش ثلاجةنورليكSMP 36 15للتبريد المخصص من Bioplex 200
Sodium فلورايدسيجما201154
أورثوفاناديت الصوديومسيجما450243
ستريبتافيدين-PEBioLegend405204
سلفو NHSThermo ScientificA39269
تريسفيشر ScientificBP152
القاع البطيخ المكونة من 3 أرقام الأجسام المضادة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed Co ImmunoprecipitationProtein Interaction NetworkQuantitative Multiplex ImmunoprecipitationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Bead ImmunoprecipitationProtein Co AssociationsSignal Transduction SystemsAntibody Panel SelectionStreptavidin PE LabelingCytoscape Network Visualization

Related Articles