مقالة منهجية

فحص قائم علي بروتين الفلورية الخضراء المعززة لدراسة نمو العصب في الخلايا العصبية الاوليه

6.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60031

⸱

أكتوبر 19, 2019

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, 2Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, Shenzhen

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

في هذا التقرير ، ونحن وصف بروتوكول بسيط لدراسة النمو العصبي في الخلايا العصبية القشرية الفئران الجنينية عن طريق المشاركة في الانتقال مع EGFP والبروتين من الفائدة.

الملخص

العصب العصبي هو حدث أساسي في تشكيل الدوائر العصبية اثناء تطوير الجهاز العصبي. تحدث الاضرار العصبية الشديدة والخلل الوظيفي المتشابك في مختلف الامراض العصبية والانحطاط المرتبط بالسن. ان التحقيق في أليات التي تنظم نمو العصب العصبي لن يؤدي فقط إلى إلقاء الضوء القيم علي العمليات التنموية للدماغ ولكن أيضا علي هذه الاضطرابات العصبية. ونظرا لكفاءة التحويل المنخفضة ، فانه من الصعب حاليا دراسة تاثير بروتين محدد علي نمو العصب العصبي في الخلايا العصبونات الاوليه. هنا ، ونحن وصف طريقه بسيطه للتحقيق في النمو العصبي من قبل المشتركة بين الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه مع EGFP والبروتين من الفائدة (POI). هذا الأسلوب يسمح بتحديد الخلايا العصبية المتحولة POI من خلال اشاره EGFP ، التالي يمكن تحديد تاثير البوي علي النمو العصبي بدقه. ويوفر هذا الفحص القائم علي EGFP نهجا ملائما للتحقيق في المسارات التي تنظم نمو العصب العصبي.

المقدمة

العصبية ، بما في ذلك كل من محاور و dendrites ، هي الإسقاطات من الخلايا العصبية المشاركة في إنشاء الشبكات العصبية. ان النمو الديناميكي للعصب أمر ضروري لتطوير الأعصاب. ومع ذلك ، تظل أليات التنظيمية الاساسيه في الأسفل غير واضحة. علي وجه الخصوص ، وغالبا ما يلاحظ تلف العصب في مختلف الامراض العصبية وبعد إصابات الدماغ1. ولذلك ، فان التحقيق في ادوار الجزيئات المفترضة في مختلف المسارات التنظيمية لنمو العصب العصبي من شانه ان يحسن فهمنا للعملية. وعلاوة علي ذلك ، فانه قد تكشف عن أهداف علاجيه جديده لمختلف الاضطرابات العصبية. خطوط الخلايا العصبية هي نماذج قيمه لدراسة العمليات العصبية بما في ذلك العصب العصبي لأنها سهله للتلاعب و transfect2,3. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن حدوث انحراف جيني في بعض خطوط الخلايا الشائعة الاستخدام ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في الاستجابات الفسيولوجية4. وعلاوة علي ذلك ، تم عرض التعبير البروتين التفاضلي بين خطوط الخلايا العصبية والخلايا العصبية الاوليه. علي سبيل المثال, PC12, خط الخلايا العصبية المستمدة من الغدة الكظرية الفئران التي تستخدم علي نطاق واسع لدراسة العصب العصبي2,3, لا تعبر عن مستقبلات nmda5. وعلاوة علي ذلك ، فقد اقترح ان انخفاض الاستجابة للخط العصبي العصبي الماوس خط عصبيه-2a إلى السموم العصبية بالمقارنة مع الخلايا العصبية الاوليه ويرجع ذلك إلى عدم التعبير عن مستقبلات غشاء معينه وقناات أيون6. لذلك ، الخلايا العصبية الاوليه هي نموذج أكثر من المرغوب فيه وتمثيليه للتحقيق في النمو العصبي. ومع ذلك ، فان استخدام الخلايا العصبية الاوليه يعوقه الكفاءة المنخفضة للتحويل7.

هنا ، ونحن وصف الطريقة التي تنطوي علي الانتقال المشترك للبروتين من الفائدة (POI) و EGFP إلى الخلايا العصبية القشرية الفئران الاوليه. وتعمل EGFP كعلامة مورفولوجية لتحديد الخلايا العصبية المتحولة بنجاح وتسمح بقياس العصب. نحن التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام المركبات/الجزيئات التي تم الإبلاغ عنها لتعدل العصب العصبي. وعلاوة علي ذلك ، تم استخدام FE65 ، وهو بروتين محول الخلايا العصبية التي ثبت لتحفيز النمو العصبي ، لتوضيح هذا النهج8،9. هذا البروتوكول ينطوي علي (1) عزل الخلايا العصبية القشرية الاوليه من الجنينية اليوم 18 (E18) أجنه الفئران ، (2) المشترك بين الخلايا العصبية مع EGFP و POI (FE65 في هذه الدراسة) و (3) التصوير وتحليل الخلايا العصبية باستخدام معالجه الصور البرمجيات ImageJ مع البرنامج المساعد نيونونج10,11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وكانت جميع الإجراءات المتبعة متفقه مع المعايير الاخلاقيه للجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية التابعة لجامعه هونغ كونغ الصينية.

1. اعداد الشفاه المختلطة

  1. ضعي الضمادة الدائرية المعقمة بحجم 18 ملم في كل بئر من لوحه ثقافة الانسجه التي تبلغ 12 بئرا.
  2. معطف كوفيرسليب مع 5 ميكروغرام/مل محلول بولي دي يسين في ترطيب 37 درجه مئوية حاضنه لمده لا تقل عن 1 ساعة.
  3. يستنشق محلول بولي دي يسين من لوحه ثقافة الانسجه وشطف الشفتين المغلفة مره واحده مع الماء المعقم.

2. الفئران الجنينية تشريح الخلايا العصبية

  1. قم بالتضحية بالفئران الموقوتة-الحامل في سن الحمل الذي يبلغ 18 يوما (E18) اما عن طريق خلع عنق الرحم أو خنق CO2 .
    ملاحظه: يرجى التحقق من اللوائح المحلية للتضحية من الفئران الحوامل.
  2. فتح تجويف البطن من الفئران الحامل مع تشريح مقص ونقل الرحم إلى صحن بيتري 10 سم.
  3. فتح الرحم والكيس السلوى بعناية مع مقص تشريح الصغيرة وأزاله المشيمة من جنين الفئران باستخدام مقص تشريح الصغيرة. نقل الجنين كله إلى طبق بيتري 10 سم مع الفوسفات قبل المبردة المالحة مخزنه تستكمل مع الجلوكوز (تلفزيوني-الجلوكوز ، 10 مم الفوسفات الصوديوم ، 2.68 mM كلوريد البوتاسيوم ، 140 mM كلوريد الصوديوم و 3 غرام/لتر الجلوكوز) باستخدام زوج من ملقط صغير.
  4. قطع علي طول خياطه السهمي من الجمجمة وفتحه بعناية مع زوج من مقص تشريح الصغيرة. نقل الدماغ الجنينية مع ملعقة صغيره مسطحه إلى صحن بيتري 10 سم مع الجليد الباردة تلفزيوني-الجلوكوز.
  5. افصل نصفي الدماغ عن المخيخ وجذع المخ باستخدام ملقطين #5ين تحت مجهر التشريح.
    ملاحظه: يرجى الاطلاع علي المرجع12 لهيكل الدماغ الفئران.
  6. أزاله السحايا باستخدام ملاقط ال#5.
  7. عزل القشرة من نصفي الدماغ مع اثنين من ملاقط ال#5 علي التوالي.
  8. نقل القشرة معزولة إلى الجليد الباردة تلفزيوني-الجلوكوز في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.

3. ثقافة الخلايا العصبية القشرية الاوليه

ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموجودة في الخطوتين 3 و 4 داخل مجلس الوزراء للسلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.

  1. تسويه القشرة المعزولة بالجاذبية في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق ويستنشق الجلوكوز.
  2. أضافه 1 مل من 0.05 ٪ التريبسين-أدتا إلى القشرة المعزولة وتخلط بلطف عن طريق التنصت واحتضان الانسجه في 37 درجه مئوية حمام المياه لمده 10 دقيقه للسماح الهضم الانزيمي. اضغط علي الأنبوب برفق للخلط كل 2 دقيقه.
  3. أضافه 4 مل من متوسط الصيانة (علي سبيل المثال ، المتوسطة العصبية) إلى خليط الانسجه/التريبسين.
    ملاحظه: وتستكمل جميع المتوسطة الصيانة المستخدمة في هذا البروتوكول مع البنسلين-ستربتوميسين و ب-27 الملحق13.
  4. قومي بفك النسيج برفق باستخدام ماصه بمقدار 1 مل.
  5. بيليه الخلايا المنفصلة عن طريق طرد في 200 x g لمده 5 دقيقه. يستنشق سوبرناتانت.
  6. كرر الخطوات 3.5 إلى 3.7 مرتين.
  7. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من متوسط الصيانة.
  8. أضافه 10 μL من 0.4% الحل الأزرق التريان إلى 10 μL من تعليق الخلية لعد الخلايا القابلة للحياة من قبل مقياس الكريات الدموية.
  9. لوحه الخلايا العصبية في كثافة من 65000/سم2 (خليه قابله للحياة) في 1 مل من متوسط الصيانة لبئر في لوحه 12 بئر.

4. خليه النقل والتثبيت

  1. في 2 أيام في المختبر (DIV2) ، transfect 0.5 ميكروغرام من البناء EGFP (pEGFP-C1) إلى الخلايا العصبية معا اما مع أو بدون من 0.5 ميكروغرام من POI باستخدام 1 μL من كاشف العدوى (علي سبيل المثال ، ليبوفيكتامين 2000). استخدم إرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظه: وقد أعدت بني التعبير الثدييات باستخدام السمية المعوية الحرة مجموعه اعداد البلازميد. العلاج مع المواد الكيميائية/جزيئات (في هذه المخطوطة الخلوية D (Cyto) وعامل نمو العصب (NGF) وقد استخدمت) يمكن القيام به في 6 ح بعد الحقن.
  2. يستنشق الوسط الثقافي 24 ساعة بعد التحويل ويغسل الخلايا المقسمة مره واحده مع 37 درجه مئوية (10 ملم فوسفات الصوديوم ، 2.68 مم كلوريد البوتاسيوم ، 140 مم كلوريد الصوديوم).
  3. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في الخدمات التلفزيونية لمده 10 دقيقه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
  4. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات مع تلفزيوني.
  5. أضافه كميه الحد الأدنى من المتوسطة تركيب الفلورية علي الشريحة الزجاجية المجهر. انقل المشبك بعناية من اللوحة المكونة من 12 بئر إلى الوسط المتصاعد مع العينة التي تواجه الشريحة الزجاجية.
    ملاحظه: ختم حافه المشبك مع طلاء الأظافر إذا تم استخدام متوسط تركيب مائي.

5. قياس النمو العصبي

  1. استخدام هدف 40x للتقاط الصور باستخدام المجهر الضوئي-الفلورسنت.
  2. التقاط الصور من ما لا يقل عن 40 الخلايا العصبية سليمه مع اشاره EGFP لكل النقل.
  3. فتح الصورة الملتقطة في ImageJ البرمجيات مع البرنامج المساعد نيونوج11 لقياس طول أطول العصب ، من جسم الخلية إلى غيض من مخروط النمو ، من كل الخلايا العصبية الذين يعانون من العمر.
  4. تحليل البيانات التي تم الحصول عليها مع البرنامج لتحديد تاثير البروتينات المستهدفة في النمو العصبي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لاختبار هذه المنهجية ، استخدمنا cyto وعامل نمو العصب ngf ، والتي تبين ان تمنع وتحفز العصبية النمو علي التوالي14،15،16. تم قياس طول العصب من الخلايا العصبية مع EGFP بعد العلاج مع Cyto أو NGF. وكانت كفاءه التحويل من EGFP إلى الخلايا العصبية 2.7 ٪ (1,068 الخلايا العصبية تحسب). كما هو مبين في الشكل 1ا، سيالي D قمعت العصبية التمديد بطريقه تعتمد علي الجرعة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما ذكر من قبل ، وتستخدم علي نطاق واسع PC12 والمستنسخات لها لدراسة تمديد نيوريت لان لديهم كفاءه ممتازة ترانسكشن2،3. في المقابل ، الخلايا العصبية الاوليه لديها معدل التحويل منخفضه ، والتي هي عقبه رئيسيه لدراسة المنظمين العصب العصبي من قبل الانتقال7. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مناسب لقياس النمو العصبي في الخلايا العصبية الاوليه. وعلي الرغم من انخفاض كفاءه التحويل الكلي ، فان أكثر من 80% من الخلايا العصبية المحولة كانت ناجحه بنجاح مع البروتينين:...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ انه ليس لديهم تضارب في المصالح مع محتويات هذه المادة.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل بأموال من مجلس المنح البحثية في هونغ كونغ ، وصندوق البحوث الصحية والطبية (هونغ كونغ) ، وخطه المنح المباشرة للمجلس ، وصندوق الهبات التابع للكلية المتحدة ، ومؤسسه تويلاتش الخيرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 5 ملاقطريجين5-COB
18 مم غطاء دائري زلاتCB00180RA علميحراري تعقيم قبل الاستخدام
مكمل B27Gibco17504044
Cytochalasin DInvitrogenPHZ1063مذاب في DMSO
D- (+) - الجلوكوزسيجما-ألدريتشG8270
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigma-AldrichD2650
مقص تشريح ، 10 سمالدقة العالمية14393
مقص تشريح ، 12.5 سمأدوات الدقة العالمية15922
مجموعة ماكسي البلازميد EndoFreeQIAGEN12362
تركيب مضان متوسطDakoS302380
Lipofectamine 2000 Transfection كاشفInvitrogen11668019
Neurobasal MediumGibco21103049
NGF 2.5S بروتين الفأر الأصليGibco13257019
ملقط Nugent Utility ، 10 مم ،أدوات الدقة العالمية504489
بارافورمالدهايدسيجما-ألدريتشP6148
pEGFP-C1Clontech# 6084-1
PCI FE65يرجى الاطلاع على المراجع 8 و 15
قرص PBSجيبكو18912014
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122
بولي دي ليسين هيدروبروميدسيجما ألدريتشP7280
ملعقةسيجما ألدريتشS4147
تريبسين EDTA (0.05٪) ، الفينول أحمرجيبكو25300062
تريبان بلو سولوشن ، 0.4٪جيبكو15250061
أدوات ذات الطرف المستقيم

المراجع

  1. Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
  2. Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
  3. Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
  4. Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
  5. Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
  6. LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
  7. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  8. Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
  9. Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
  10. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  11. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  12. Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
  13. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
  14. Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
  15. Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
  16. Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
  17. Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
  18. Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
  19. Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18(2010).
  20. Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
  21. He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6(2018).
  22. Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
  23. Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
  24. Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
  25. Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
  26. Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
  27. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
  28. Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
  29. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899(2013).
  30. Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143(2017).
  31. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  32. Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EGFP ImageJ FE65

مقالات ذات صلة