يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

حمل التهاب السحايا السحائي Serogroup C في الفئران عن طريق تسليم إينتراسيستيرنال

7.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60047

⸱

نوفمبر 5, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 2Department of Science and Technology, Sannio University, 3CEINGE – Advanced Biotechnology

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، ونحن وصف طريقه للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية من خلال طريق إينتراسيستيرنال من العدوى في الفئران الكبار. نقدم بروتوكول خطوه بخطوه للعدوى بالمكورات السحائية من اعداد الاصابه بالعدوى الإينتراسيستيرناله. ثم تسجيل البقاء علي قيد الحياة الحيوانية وتقييم الأحمال البكتيرية في الانسجه murine.

الملخص

Neisseria النيسريه (المكورات السحائية) هي كائنات مجهريه ضيقه النطاق ، معترف بها عالميا باعتبارها السبب الرئيسي للتهاب السحايا البكتيري. المكورات السحائية هو مستعمر عابر من البلعوم الأنفي البشري من حوالي 10 ٪ من المادة الصحية. في الظروف الخاصة ، فانه يكتسب قدره الغازية لاختراق الحاجز المخاطي ويغزو مجري الدم المسببة لمرض التسمم الدموي. في الحالة الاخيره ، يمكن ان ينشا تعفن الانتان حتى بدون التطور الناتج عن التهاب السحايا. وعلي العكس من ذلك ، يمكن ان تتكاثر البكتيريا بشكل سيئ في مجري الدم ، وعبور حاجز الدماغ الدموي ، والوصول إلى الجهاز العصبي المركزي ، مما يؤدي إلى التهاب السحايا الجرثومي. نماذج murine من التهاب السحايا البكتيري تمثل أداه مفيده للتحقيق في التفاعلات بين المضيف والممرض وتحليل أليات المرضية المسؤولة عن هذا المرض المميت. علي الرغم من انه تم تقييم عده أنظمه نموذجيه تجريبية علي مدي العقود الماضية ، لم يتمكن اي منها من أعاده إنتاج الاحداث المرضية المميزة لمرض المكورات السحائية. في هذا البروتوكول التجريبي ، ونحن وصف اجراء مفصل لتحريض التهاب السحايا المكورة السحائية في نموذج الماوس علي أساس التلقيح إينتراسيستيرنال من البكتيريا. وسجلت علامات غريبه من التهاب السحايا البشري في المضيف murine من خلال تقييم المعلمات السريرية (مثل درجه الحرارة ، ووزن الجسم) ، وتقييم معدل البقاء علي قيد الحياة ، والتحليل الميكروبيولوجي والفحص النسيجي للاصابه بالمخ. عند استخدام إينتراسيستيرنال (ط. cist.) المكورات السحائية ، وتسليم كامله مباشره فيماجنا سينسينا ، مما يؤدي إلى النسخ المتماثل المكورات السحائية فعاله جدا في انسجه المخ. لوحظت زيادة 1,000 اضعاف العد القابل للحياة من البكتيريا في حوالي 18 ح. وعلاوة علي ذلك ، توجد أيضا المكورات السحائية في الطحال ، والكبد من الفئران المصابة ، مما يوحي بان الكبد قد تمثل الجهاز المستهدف للنسخ المتماثل المكورات السحائية.

المقدمة

Neisseria النيسريه هو غرام السلبية β-بروتينيه تقتصر علي الإنسان المضيف ، والمعروف جيدا لكونها واحده من الأسباب الأكثر شيوعا للتهاب السحايا والانتان في السكان البشرية في جميع انحاء العالم. فانه استعمار الجهاز التنفسي العلوي (الأنف والحنجرة) من ناقلات صحية وغير متناظرة (2-30 ٪ من السكان) ، ولكن البكتيريا في بعض الأحيان يفادس الدفاعات المناعية المضيف المختلفة وينتشر من مجري الدم إلى الدماغ مما تسبب في المحلية غير المنضبط التهاب ، والمعروفة باسم السحايا المكورات السحائية. مزيج من العوامل المضيفة والبكتيرية يبدو ان المساهمة في الانتقال من المعلق إلى السلوك الغازي1.

النيسريه متخصصة حصرا في الاستعمار البشري والعدوى. لديها مجموعه ضيقه المضيف ، التالي ، قد محدوده في الدراسات التي تولد الجسم البشري بسبب عدم وجود نماذج الحيوانية المناسبة التي تتكاثر مرض المكورات السحائية الإنسان. ونتيجة لذلك ، ادي ذلك إلى ثغرات أساسيه في الفهم فيما يتعلق بالتسبب في تسمم الدم والتهاب السحايا الناجم عن المكورات السحائية. وفي العقود الاخيره ، سمح تطوير العديد من النظم المختبرية بتحديد العديد من عوامل المكورات السحائية2،3،4. علي الرغم من ان هذه الدراسات القيمة قدمت رؤى هامه لفهم دور هذه العوامل لعدوي المكورات السحائية ناجحه ، وهذه النماذج لا تسمح بتقييم عواقب التفاعلات البكتيرية مع الخلطيه والخلوية الجهاز المناعي وحتى اقل مع الانسجه كلها. في الكائنات الحيوانية نماذج العدوى هي ذات اهميه كبيره ، وكذلك لتقييم درجه الحماية التي تمنحها تركيبات اللقاح. وبوصفها من العوامل المسببة للمرض البشري ، فان المكورات السحائية تمتلك محددات مناسبه ضرورية للعدوى الناجحة مثل الهياكل السطحية (اي النوع الرابع وبروتينات التعتيم) وأنظمه امتصاص الحديد للمستقبلات البشرية وبروتينات النقل (اي ترانسفيرين و lactoferrin)5،6،7 للتقيد بشكل صحيح ، والبقاء علي قيد الحياة وغزو المضيف البشري. وأخيرا ، فان قدرات التباين الجيني للمرض للتهرب و/أو منع الاستجابة المناعية البشرية تساهم بشكل أكبر في الأنواع العالية من تروسم8،9. ولذلك ، فان عدم وجود عوامل مضيفه محدده ، تشارك في التفاعل ، يمكن ان يعرقل خطوات دوره حياه الممرض ، مما ينشئ صعوبات كبيره في تطوير نماذج حيوانيه صغيره تلخص دوره حياه المكورات السحائية.

علي مدي العقود الماضية ، تم تطوير العديد من النهج لتحسين فهمنا للدورة المعدية المكورات السحائية. وقد وضعت التهابات نموذجين الحيوانية والماوس والفئران ، اما داخل الصفاق (i.p.) أو الإنترانت (ا) ، لإنتاج مرض المكورات السحائية10،11،12،13،14 ،15،16،17. الماوس المختبر هو علي الأرجح واحده من أكثر تنوعا الحيوانية للحث علي العدوى المكورة السحائية التجريبية.

ومع ذلك ، فان الطريقة الi.p.ه للعدوى تؤدي إلى تطور الانتان الحاد علي الرغم من انه لا يحاكي الطريق الطبيعي للعدوى ، في حين ان الطريق الا للعدوى كان مفيدا لتقييم الاصابه بالتهاب المكورات السحائية ، علي الرغم من انه قد يسبب عدوي الرئة قبل الانتان10،11،12،13،14،15،16،17.

وكان نموذج الماوس i.p. مفيده لتقييم الحماية من المكورات السحائية التحدي10،11،12. وقد تم تطوير نموذج الماوس للاستعمار المكورات السحائية علي أساس المسار الا للعدوى مع الفئران الرضع ، لأنها أكثر عرضه للاصابه بالمكورات السحائية ، لأعاده إنتاج عدوي الغازية محاكاة مسار مرض المكورات السحائية في البشر 13،14،15،16،17. وعلاوة علي ذلك ، لتعزيز تكرار المكورات السحائية في المضيف murine ، تم أيضا تطبيق عدد متزايد من الاستراتيجيات التقنية بما في ذلك أداره الحديد للحيوانات لتحسين العدوى ، واستخدام البكتيريا البكتيرية عاليه ، الماوس-المرور البكتيرية سلاله وكذلك توظيف الرضع أو المناعية الحيوانية يستضيف10،13،15،18،19. التعبير عن العوامل البشرية المحددة مثل CD4620 أو ترانسفيرين21 قد زاد من قابليه الفئران لهذه البكتيريا البشرية المدارية ؛ وقد كان العمل من نموذج الجلد الإنسان طعم الغيروي العدوى مفيده أيضا لتقييم قدره التصاق المكورات السحائية إلى الإنسان بطانة22,23. وبشكل جماعي ، ادي التطور الأخير في الفئران المحورة وراثيا إلى تحسين فهم تولد التهاب السحائي وتفاعلاته المضيفة.

في السابق ، وضعنا نموذج murine من التهاب السحايا المكورات السحائية حيث تم اجراء تلقيح البكتيريا في ماجنا السينية من الفئران الكبار مع الماوس-البكتيريا التي تمر بالفار24. المعلمات السريرية ومعدل البقاء علي قيد الحياة من الفئران المصابة أظهرت إنشاء التهاب السحايا مع خصائص مماثله لتلك التي ينظر اليها في المضيف البشري ، فضلا عن التحليلات الميكروبيولوجية والنسيجية للدماغ. من هذه الفئران المصابة, وكانت البكتيريا, أيضا, تعافي من الدم, الكبد, والطحال, والأحمال البكتيرية من الاجهزه الطرفية ترتبط مع الجرعة المعدية. وعلي وجه الخصوص ، استخدم هذا النموذج لتقييم ضراوة سلاله متحولة ايزوتون معيبه في الناقل L-الغلوتامات GltT24. في الاونه الاخيره ، وذلك باستخدام نموذج الماوس لدينا من التهاب السحايا المكورات السحائية علي أساس ط. cist. الطريق مع زمره C سلاله 93/42862،24 ومتحولة ايزوتون معيبه في ترميز الجينات شامل في اطار ل UDP-N-اسيتيل 2-epimerase25، لقد حللنا دور حمض السياليك المكشوفة في إنشاء من المرض في الفئران.

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه واضحة للحث علي التهاب السحايا المكورة السحائية التجريبية علي أساس i. cist. طريق العدوى في الفئران الكبار Balb/c. هذا الأسلوب مفيد بشكل خاص لتوصيف عدوي المكورات السحائية في المضيف murine ، وكذلك لتقييم ضراوة بين سلالات النوع البرية المرجعية والمسوخ المتحولة. ويضمن المسار الداخلي للعدوى الولادة الكاملة لمكورات السحايا مباشره في ماجنا ، والتي بدورها تسهل النسخ البكتيري في السائل النخاعي (الدماغي الشوكي) ويحفز التهاب السحايا مع الميزات التي تحاكي تلك حاضره في أناس2,24,25,26.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد اجري هذا البروتوكول للتقليل من المعاناة الحيوانية وتقليل عدد الفئران وفقا للتوجيه الصادر عن مجلس الجماعات الاوروبيه في 24 تشرين الثاني/نوفمبر 1986 (86/609/EEC). في المجري التجارب المذكورة في هذه الدراسة تمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الاخلاقيه لرعاية الحيوانية والاستخدام (Prot. عدد 2, 14 ديسمبر 2012) ووزارة الصحة الايطاليه (Prot. عدد 0000094/01/2013). وينبغي تنفيذ جميع الإجراءات داخل مجلس السلامة الاحيائيه 2 (BSC2) في غرفه BSL2 ، وينبغي التخلص من النفايات المحتملة المصابة في حاويات مخصصه.

1. عدوي الفئران مع النيسريه serogroup ج سلاله

تحذير: النيسريه هو من المحتمل ان يكون الممرض الضارة ويجب اتخاذ جميع الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع هذه الكائنات المجهرية. يتطلب التجريب بأكمله احتواء مستوي السلامة البيولوجية 2 (BSL2). يجب علي الباحث المشارك في الدراسات الحيوانية ارتداء معدات الوقاية الشخصية القابلة للتصرف لمده التجربة.

  1. اعداد البكتيريا لدراسات العدوى المجرية
    1. اختيار مستعمره واحده من الثقافة النيسريه Neisseria الطازجة علي GC (المكورات العقديه) لوحه أجار تستكمل مع 1 ٪ (المجلد/المجلد) Polyvitox الملحق وتطعيم في 10 مل من مرق GC.
    2. تنمو البكتيريا في 37 درجه مئوية في حاضنه المداري شاكر مع سرعه 220 دوره في الدقيقة. الحفاظ علي التحقق من متعاطي الثقافة مع مقياس طيفي. تنمو الثقافة حتى المرحلة الاسيه المبكرة في كثافة بصريه OD600nm من 0.7 ، المقابلة ل ≈ 7 × 108 كفو/مل.
    3. بمجرد الحصول علي متعاطي المطلوبة ، وجعل الأسهم المجمدة عن طريق أضافه 10 ٪ الجلسرين. الاستغناء عن 1 مل من الثقافة في التخزن. تخزين قوارير في-80 درجه مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظه: علي الرغم من انه من الأفضل استخدام الثقافة البكتيرية الطازجة ، واستخدمت المخزونات المجمدة لتبسيط وتوحيد التجربة في الجسم المجري. وعاده ما تستخدم المخزونات المجمدة في غضون 6 أشهر تقريبا من الاعداد.
    4. قبل العدوى ، وذوبان البكتيريا المجمدة في درجه حرارة الغرفة.
    5. حصاد الخلايا البكتيرية عن طريق طرد لمده 15 دقيقه في 1,500 x g وأعاده التعليق في 1 مل من مرق GC الطازجة التي تحتوي علي الحديد ديكديتان (5 مغ/كغ).
      ملاحظه: يتم اعداد مرق GC مع أضافه الحديد ديكدكتان (5 مغ/كغ) من أجل صالح النسخ المتماثل من المكورات السحائية في الانسجه المضيف14,18,27.
    6. قبل استخدام, تنفيذ التهم القابلة للحياة من البكتيريا لتحديد العدد الدقيق لل CFU للعدوى. للقيام بذلك ، والتقاط 10 μL من تعليق البكتيرية والمضي قدما مع التخفيفات التسلسلية ونشر كل تمييع علي لوحات أجار GC واحتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2، ل 18-24 h.
  2. الحقن داخل السيسينال من الفئران
    ملاحظه:يتم تنفيذ الاجراء بأكمله في مجلس الوزراء تدفق الرقائقي للحفاظ علي ظروف العقيم.
    1. منزل الفئران المختبر (8 الأسبوع ، الإناث Balb/c) تحت ظروف محدده خاليه من العوامل المسببة للمرض. توفير الكريات الغذائية والمياه الاعلانيه libitum.
    2. تسويه الكائنات في البيئة الجديدة لمده أسبوع واحد قبل بدء التجربة.
    3. قبل بدء التجربة ، وزن وتقييم درجه حرارة الجسم.
      ملاحظه: وتزن الفئران الإناث بالنسبة للإناث البالغة من العمر ثمانيه أسابيع في المتوسط حوالي 19 غراما. متوسط درجه الحرارة من الفئران مختبر فسيولوجيا تتراوح من 36-38 درجه مئوية24.
    4. التوفف الحيوانية من الرقبة ، وتنظيف منطقه البطن مع الايثانول 70 ٪ وحقن i.p. الحديد ديديكستان (المذاب في 1 ٪ العازلة المالحة الفوسفات ، 250 مغ/كغ) في الربع الأيمن السفلي من البطن murine باستخدام 25 G ابره 0.5 مم x 16 مم ، حوالي 2-3 ساعة قبل الاصابه.
      ملاحظه: تم اجراء الحقن داخل الربع الأيمن السفلي من البطن المريد لتجنب تلف أعضاء البطن مثل المثانة البولية ، الأعور ، الخ. يفضل الاداره من [ايرون سورس] خارجيه, في الشكل من حديد [ددكسن], إلى الماشية قبل التلوث الضرب جرثوميه في المضيفة14,18,27.
    5. بعد 2-3 h ، اجراء التخدير الحيواني مع الكيتامين (50 مغ/كغ) و اكسيليازين (3 ملغ/كغ) وزيوت التشحيم العيون.
    6. التحقق من عمق التخدير عن طريق ضمان عدم وجود استجابه الم عند معسر اصبع القدم.
    7. وضع الماوس في استلقاء القصيه وتمتد بعناية الأطراف والعمود الفقري العنقي للحفاظ علي الاعمده الفقرية في موقف مستقيم.
    8. تخلط برفق التعليق البكتيري للحفاظ علي تعليق ثابت قبل تحميل حقنه من 30 G ابره x 8 ملم.
      ملاحظه: اعداد تعليق البكتيرية أقرب ما يمكن إلى وقت الحقن. وفي الوقت نفسه ، تخزينه في درجه حرارة الغرفة.
    9. استنادا إلى آخر ذوبان البكتيريا عيار (كفو/مل) ، والمضي قدما في حساب إجمالي كفو لاستخدامها ، فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات للاصابه (cfu الجرعة البكتيرية لكل عدد من الماشية). المضي قدما في حساب حجم الدقيق الذي سيؤخذ من القارورة للحصول علي مجموع cfu تطبيق نسبه بين الذوبان البكتيرية آخر (cfu/مل) ومجموع cfu مفيده للعدوى ن الفئران (بعد ذوبان البكتيريا عيار cfu : مل = إجمالي كفو: x). وضع المجلد النهائي فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات المصابة.
      ملاحظه: في هذه التجارب ، تم استخدام مجموعه واسعه من عيار من 104 إلى 109 لكل الحيوانية.
    10. نظفت المنطقة جراحيه مع 70% ايثانول.
    11. تحديد نقطه الحقن مع مساعده من ابره وحقن CFU الراسخة من المكورات السحائية (سلاله نوع البرية وسلاله متحولة ايزوتون) ، أو المرق GC تستكمل مع الحديد ديكستان (5 مغ/كغ) كعنصر تحكم ، في حجم إجمالي من 10 μL في ماجنا الفئران من خلال ثقب لدغ القذالي باستخدام 30 G ابره x 8 ملم.
      1. قم باجراء الحقن السيسينال عن طريق وضع الابره عند تقاطع الجمجمة ، وتحديدا في الفضاء تحت العنكبوتية الظهرية. Ventroflex الراس لجعل هذه المساحة يمكن الوصول اليها28.
      2. لفتره وجيزة ، ووضع الحيوانية في الركود الجانبي ، وعقد أذان للخروج من الطريق والمرن الرقبة باعتدال (90 إلى 100 درجه). تاكد من ان خط منتصف الرقبة والراس (من الأنف إلى القذبوت) في وضع مواز تماما إلى الطاولة.
      3. المس اجنحه الأطلس وتاكد من انها تتداخل ، والقضاء علي دوران محوري. وعاده ما يمكن لمس المسافة البادئة الطبيعية علي خط الوسط حيث الابره هي الأكثر احتمالا لدخول ثقب القذالي.
      4. تخلص من الحقنه والابره بأمان بعد حقن الفئران مع النييسريه.
    12. وضع الحيوانية في القفص وانتظر الصحوة والانتعاش الكامل للحركة.
    13. الحفاظ علي أقفاص مع الفئران المصابة تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي.
    14. رصد الفئران ، 24 ساعة بعد العدوى ، لعلامات السريرية من الغيبوبة وفقا لمقياس غيبوبة29. مقياس غيبوبة: 1 = غيبوبة ، 2 = لا يقف تستقيم بعد ان تحولت علي ظهره ، 3 = يقف تستقيم في غضون 30 ثانيه ، 4 = يقف تستقيم في غضون 5 ثانيه ، الحد الأدنى من الانشطه الاسعافيه ، 5 = العادي.
       ملاحظه: عندما كان في الحيوانية وسجلت الم ، تسكين مع ميلوكسيكام (5 مغ/كغ i.p. لمده الدراسة) كان يدار.
    15. المضي قدما للبقاء علي قيد الحياة الحيوانية أو كفو التهم المقايسة علي الماشية المصابة كما هو مفصل في الخطوة 2.
    16. أداء القتل الرحيم من الفئران مع درجه من 2 عن طريق خلع عنق الرحم وسجل كميت للتحليل الإحصائي.

2. بقاء الحيوانية والتهم كفو

  1. بقاء الحيوانية
    1. اعداد التطعيم البكتيرية في جرعات مختلفه (تتراوح بين 104 إلى 109 كفو لكل ماوس) لتصيب الماشية من قبل i. cist. الطريق (انظر الخطوة 1.2).
    2. تطعيم الفئران التحكم مع مرق GC ، تستكمل مع الحديد ديكدكتان (5 مغ/كغ) ، بنفس الطريقة.
    3. رصد الحيوانية للاعراض السريرية: الفراء تكدرت ، مظهر منحني ، انخفاض حرارة الجسم ، وفقدان الوزن ، والخمول ، أو موريبوند24،25،26،30، كل يوم في جميع انحاء التجربة بأكملها ل 168 h (7 أيام) علي الأقل مرتين في اليوم لمده التجربة.
    4. قياس وزن الجسم ودرجه الحرارة باستخدام التوازن الرقمي وترمومتر المستقيم ، كل يوم علي التوالي.
    5. سجل بقاء الفئران لمده أسبوع.
      ملاحظه: تسجيل الوفاة الطبيعية للعدوى بعد الحيوانية في حين ان الكائنات التي تصل إلى قيمه غيبوبة من 2 أو ان البقاء علي قيد الحياة أكثر من 168 h من الملاحظة سيتم رحيم.
    6. تخدير الفئران مع قيمه غيبوبة من 2 أو ان البقاء علي قيد الحياة علي مدي وقت الملاحظة مع الكيتامين (50 ملغ/كغ) و اكسيليازين (3 مغ/كغ) وتطبيق مرهم العيون.
    7. تحقق من ان استجابه الم غائبه عن طريق قرصه اصبع القدم.
    8. أداء القتل الرحيم من الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وسجل كميت للتحليل الإحصائي.
  2. تقييم وحدات تشكيل مستعمره (كفو) التهم في الاجهزه الطرفية
    1. استخدام جرعه بكتيرية شبه مميته (5 × 105كفو/الفئران) علي أساس نتائج بقاء الحيوانية لتطعيم الماشية من قبل i. cist. طريق (انظر القسم الفرعي 1.2).
    2. مراقبه درجه حرارة المستقيم كل يوم خلال العدوى واجراء التخدير من الحيوانية في 48 h بعد العدوى كما هو مذكور في الخطوة 2.
    3. المضي قدما في تطهير الايثانول 70 ٪ من الصدر وسحب 600-700 μL من الدم عن طريق ثقب القلب من تجويف الصدر باستخدام 25 G ابره 0.5 مم × 16 ملم.
    4. جمع الدم في أنبوب يحتوي علي 3.8 ٪ سيترات الصوديوم وتخزين في-80 درجه مئوية لحساب الخلايا البكتيرية في وقت لاحق قابله للحياة.
    5. أداء خلع عنق الرحم للتضحية الحيوانية. تاكيد الوفاة تسجيل عدم وجود نبضات القلب ، بعد التضحية بالماوس وفقا لجميع المبادئ التوجيهية المؤسسية والاخلاقيه ذات الصلة.
    6. وضع الماوس في موقف ضعيف واستخدام مقص وملقط للمضي قدما في قطع من الفراء علي طول الطائرة السهمي من الجسم. إصلاح الجلد مع الفراء علي جانبي الجسم مع دبابيس.
    7. قطع الغشاء الصفاقي باستخدام مقص حاد. استخدام مقص وملقط المتاح لإنتاج الاجهزه (علي سبيل المثال ، الطحال والكبد) ووضع كل واحد في طبق بيتري العقيمة مع 1 مل من مرق GC تستكمل مع 10 ٪ (المجلد/المجلد) الجلسرين.
    8. التخلص بأمان الجسم الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC.
    9. تجانس الأعضاء ميكانيكيا في درجه حرارة الغرفة مع المكبس من حقنه 5 مل لمده 2-3 دقيقه تقريبا حتى يتم تشكيل تعليق خليه واحده ونقله في أنبوب.
    10. وضع أنبوب مع عينه الانسجه المتجانسة علي الفور علي الجليد الجاف.
      ملاحظه: يمكن تخزين عينات في-80 درجه مئوية في أنبوب معقم 2 مل لأداء الخلايا البكتيرية قابله للحياة التقييم في النقاط اللاحقة.
    11. جعل لوحات أجار GC مع المضادات الحيوية عند الحاجة. تجفيف لوحات قبل الاستخدام قبل احتضان في 37 درجه مئوية ل 2-3 h.
    12. اعداد المخففات التسلسلية 10 اضعاف من العينات في مرق GC من كل الانسجه المتجانسة ولوحه علي لوحات أجار GC. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.

3. اعداد انسجه المخ لعدد كفو

  1. استخدام جرعه بكتيرية شبه مميته (5 × 105 كفو/الفئران) علي أساس نتائج بقاء الحيوانية لتطعيم الماشية من قبل i. cist. طريق (انظر القسم الفرعي 1.2).
  2. اجراء التخدير من الحيوانية في الوقت المحدد العدوى كما هو مذكور في الخطوة 2.
  3. أداء القتل الرحيم للحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم.
  4. نظفت المنطقة جراحيه مع 70% ايثانول.
  5. قطع راس الماوس باستخدام مقص كبير.
  6. Resect الفراء والجلد مع مساعده من مقص الجراحية الصغيرة وغرامه ملقط الصلب يميل ، والمضي قدما نحو الأعلى من الجمجمة لتكون قادره علي رؤية بوضوح الغرز وتوجيه افتتاح جمجمة.
  7. ادراج غيض من مقص صغير من خلال ماغنوم الفوران لفتح الجمجمة.
  8. تقطع نحو مركز الجمجمة وعبر الخط الأوسط من العظم الجداري إلى الجانب الآخر من الجمجمة. تقطع برفق علي طول الحافة الجانبية للخياطة الأفاريز.
  9. رفع الجمجمة بدءا من الزاوية الجدارية الخلفية وسحبها قطريا إلى الأعلى لاكتشاف الدماغ ، وذلك باستخدام ملقط يميل غرامه.
  10. تاكد من ان انسجه المخ ليست مرتبطة بأي عظم في الراس ، عندما يتم رفع الجمجمة.
  11. استخدام ملقط المتاح لأزاله اي النسيج الضام بين الجمجمة والدماغ ، لضمان ان يتم أزاله انسجه المخ جنبا إلى جنب مع الجمجمة.
  12. لا تسمح انسجه المخ تجف كثيرا. وضع الدماغ ، وذلك باستخدام ملقط المتاح ، في طبق بيتري مع 1 مل من مرق GC تستكمل مع 10 ٪ (المجلد/المجلد) الجلسرين.
  13. تجانس الدماغ ميكانيكيا مع المكبس من حقنه 5 مل (انظر الخطوة 2.2.9). نقل العينات إلى أنبوب معقم 2 مل وتخزين-80 درجه مئوية لتقييم الخلايا البكتيرية القابلة للاستمرار في وقت لاحق كما نوقش في الخطوة 2.2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بقاء الفئران المصابة النيسريه نوع البرية وسلالات متحولة ايزوتون.
و neisseria النيسريه سلالات المستخدمة في هذه النتائج التمثيلية هي زمره C مرجع سلاله 93/4286 (ET-37) ومتحولة ايزوتون 93/4286ωشامل في اطار التي تم الحصول عليها عن طريق التنشيط التنظيمي لجين شامل في اطار ، والترميز و UDP-N-اسيتيل الجلوكوزامين 2-epimerase ، ان الخرائط في التجميع كبسوله25. لتقييم درجه ضراوة من سلاله شامل في اطارالمعيبة في نموذج murine الحالي ، تم تقييم الجرع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، ونحن وصف بروتوكول تجريبي للحث علي التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران الكبار من قبل i. cist. تلقيح بكتيريا المكورات السحائية. علي حد علمنا ، لم يتم تطوير اي نموذج آخر من التهاب السحايا المكورات السحائية في الفئران المختبرات المصابة بواسطة i. cist. طريق في الماضي ، وقد تم استكشاف هذه الطريقة لتوفير نماذج من التهاب السحايا المكورة السحائية في كل من الفئران31 والأرنب32. ومن المعروف جيدا ان اعلي معدل لمرض المكورات السحائية يوجد بين الأطفال الصغار والمرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسات جزئيا بواسطة PRIN 2012 [منح عدد 2012WJSX8K]: "نماذج التفاعل المضيف microbe في التهابات المخاطية: تطوير استراتيجيات علاجيه جديده" وبواسطة PRIN 2017 [2017SFBFER]: "نهج متكامل لمعالجه التفاعل بين التكيف ، والظروف المجهدة ومقاومه مضادات الميكروبات من مسببات الامراض الصعبة ".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1,8 التفاف التنوين المبردة مع خيط خارجيStarlabE3090-6222
50 مل البولي بروبيلين أنبوب مخروطيفالكون35207030 مم × 115 مم
ملقط AdsonFST11006-12المقاوم
إنذار ميزانالحرارة TESTO9000530
BactoTM Proteose PeptoneBD211693
BD حقنة دقيقةBD320837U-100 الأنسولين
BD حقنة Plastipak 1 مل 25 جم 5/8 بوصةBD30001405 مم × 16 مم
BD حقنة Plastipak 5 ملBD308062 07 مم × 30 مم
التدفق الصفحي العمودي BIOHAZARD AURA Bبيو S.C.R.L.Aura B3
BioPhotometerEppendorfModel # 6131
Bottle DTecniplastDمتدرج حتى: 400 مل ، الحجم الكلي 450 مل ، 72 مم × 72 مم × 122 مم
C150 CO2< / sub> حاضنةالموثق9040-0078
جسم القفص Eurostandard Type IITecniplast1264C267 × 207 × 140 مم < سوب > 3 < / سوب > ، مساحة الأرضية 370 سم < سوب > 2 < / sup>
بتري ثقافة الخلية مع غطاء150288 علمي حراريحجم العمل: 5 مل
جهاز طرد مركزيEppendorfMicro جهاز طرد مركزي 5415R
Cuvetta شبه ميكرو L. شكلKartell S.p.A.01938-00
ثنائي فوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم ثلاثي هيدراتكارلو إربا471767
ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجين اللامائي ACS- لتحليلكارلو إربا480141g1000
شهادة قياسية للحميةMucedola s.r.l.4RF21بيليه طعام للحيوانات
ملاقط دومون إتش بي 5 الفولاذ المقاومFST من DUMONTAGT50340.10 × 0.06 مم 2< / sup> طرف
الميزان الإلكترونيGibertiniEU-C1200بحد أقصى 1200 جم ، د = 0.01 جم ، T = -1200 جم
الطرد المركزي الدقيق Eppendorf قفل آمنEppendorfT3545-1000EA
ErythromycinSigma-AldrichE-637625 جرام
مقص بون فائق النعومة14084-08الفولاذ المقاوم
(عازل صغير) ، H-Temp مع مشابك قفلTecniplast1264C400SUC
GC أجار قاعدةOXOIDCM0367
Gillies ملقط 1 × 2 أسنانFST11028-15الفولاذ المقاوم
جليسيرن RPEكارلو إربا4537521 لتر
Graefe ملقطFST11052-10عرض الطرف المسنن: 0.8 مم
الغطاء الداخليTecniplast1264C116
محلول ديكستران الحديدSigma-AldrichD8517-25ML
السلامة الميكروبيولوجية الكيتامين Intervet
العلامة التجاريةPP780751غطاء المسمار PP ، غراد
الماوس التعامل مع الملقطFST11035-20مطاط مسنن ؛ سطح الإمساك: 15 مم × 20 مم
Mucotit-F2000MERZ618462000 مل
قفازات لاتكس طبيعيةMedicaM101
New Brunswick Classic C24 حاضنة شاكرPBI الدوليةC-24 كلاسيك منضدة حاضنة شاكر
Petri PSأطباق VWR391-045390 × 14.2 مم 2< / sup>
Pipetman Classic P20جيلسونF1236002-20 مو ؛ L
Pipetman Classic P200GilsonF12360120-200 & LL
Pipetman Classim P1000جيلسونF123602200-1,000 مو ؛ ل
بولي فيتوكسأوكسويدSR0090A
كلوريد البوتاسيومجي تي بيكر للكيماويات بي0208250 جم
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيومجي تي بيكر للكيماويات بي في02401 كجم
PS ملقط يمكن التخلصVWR232-0191
مقسم قابل للإزالةTecniplast1264C812
أنابيب البولي بروبلين المستديرةFalcon3520635 مل
كلوريد الصوديومMOLEKULA41272436
SS التجنيب وفلتر البوليسترورقةTecniplast1264C
ملقط النمط القياسيFST11000-12مقص تينوتولي ستيفنز غير القابل
FST14066-11من الفولاذ المقاوم للصدأ
- ToughCutFST14130-17
قفازات نتريل قابلة للاستعمالAnsell92-500
فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية (ULT)هايرDW-86L288الحجم = 288 لتر
مقص فاغنرFST14070-12الفولاذ المقاوم
زيلازينإنترفيت
الفولاذ للصدأ خزانة صحن للصدأ أنبوب فلتر من للصدأ للصدأ خزانة BH-EN و BHG الفئة الثانية أسرع BH-EN 2004 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل & nbsp ؛ في منه القاع للصدأ مقص جراحي من الفولاذ المقاوم للصدأ N Tuff للصدأ

المراجع

  1. van Deuren, M., Brandtzaeg, P., van der Meer, J. W. Update on meningococcal disease with emphasis on pathogenesis and clinical management. Clinical Microbiology Reviews. 13, 144-166 (2000).
  2. Colicchio, R., et al. Fitness Cost of Rifampin Resistance in Neisseria meningitidis: In vitro Study of Mechanisms Associated with rpoB H553Y Mutation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (12), 7637-7649 (2015).
  3. Talà, A., et al. Serogroup-specific interaction of Neisseria meningitidis capsular polysaccharide with host cell microtubules and effects on tubulin polymerization. Infection and Immunity. 82, 265-274 (2014).
  4. Pagliarulo, C., et al. Regulation and differential expression of gdhA encoding NADP-specific glutamate dehydrogenase in Neisseria meningitidis clinical isolates. Molecular Microbiology. 51, 1757-1772 (2004).
  5. Plant, L., Jonsson, A. B. Contacting the host: insights and implications of pathogenic Neisseria cell interactions. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 608-613 (2003).
  6. Schryvers, A. B., Stojiljkovic, I. Iron acquisition systems in the pathogenic Neisseria. Molecular Microbiology. 32, 1117-1123 (1999).
  7. Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J., Watt, S. M. Carcinoembryonic antigens (CD66) on epithelial cells and neutrophils are receptors for Opa proteins of pathogenic neisseriae. Molecular Microbiology. 22, 941-950 (1996).
  8. de Vries, F. P., van Der Ende, A., van Putten, J. P., Dankert, J. Invasion of primary nasopharyngeal epithelial cells by Neisseria meningitidis is controlled by phase variation of multiple surface antigens. Infection and Immunity. 64, 2998-3006 (1996).
  9. Tinsley, C. R., Heckels, J. E. Variation in the expression of pili and outer membrane protein by Neisseria meningitidis during the course of the meningococcal infection. Journal of General Microbiology. 132, 2483-2490 (1986).
  10. Gorringe, A. R., et al. Experimental disease models for the assessment of meningococcal vaccines. Vaccine. 23, 2214-2217 (2005).
  11. Newcombe, J., et al. Infection with an avirulent phoP mutant of Neisseria meningitidis confers broad cross-reactive immunity. Infection and Immunity. 72, 338-344 (2004).
  12. Oftung, F., Lovik, M., Andersen, S. R., Froholm, L. O., Bjune, G. A mouse model utilising human transferrin to study protection against Neisseria meningitidis serogroup B induced by outer membrane vesicle vaccination. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 26, 75-82 (1999).
  13. Salit, I. E., Tomalty, L. Experimental meningococcal infection in neonatal mice: differences in virulence between strains isolated from human cases and carriers. Canadian Journal of Microbiology. 30, 1042-1045 (1984).
  14. Salit, I. E., Tomalty, L. A neonatal mouse model of meningococcal disease. Clinical and Investigative Medicine. 9, 119-123 (1986).
  15. Mackinnon, F. G., Gorringe, A. R., Funnell, S. G., Robinson, A. Intranasal infection of infant mice with Neisseria meningitidis. Microbial Pathogenesis. 12, 415-420 (1992).
  16. Mackinnon, F. G., et al. Demonstration of lipooligosaccharide immunotype and cap- sule as virulence factors for Neisseria meningitidis using an infant mouse intranasal infection model. Microbial Pathogenesis. 15, 359-366 (1993).
  17. Yi, K., Stephens, D. S., Stojiljkovic, I. Development and evaluation of an improved mouse model of meningococcal colonization. Infection and Immunity. 71 (4), 1849-1855 (2003).
  18. Holbein, B. E., Jericho, K. W. F., Likes, G. C. Neisseria meningitidis infection in mice: influence of iron, variations in virulence among strains, and pathology. Infection and Immunity. 24, 545-551 (1979).
  19. Saukkonen, K. Experimental meningococcal meningitis in the infant rat. Microbial Pathogenesis. 4, 203-211 (1988).
  20. Johansson, L., et al. CD46 in meningococcal disease. Science. 301, 373-375 (2003).
  21. Zarantonelli, M. L., et al. Transgenic mice expressing human transferrin as a model for meningococcal infection. Infection and Immunity. 75, 5609-5614 (2007).
  22. Join-Lambert, O., et al. Meningococcal interaction to microvasculature triggers the tissular lesions of purpura fulminans. Journal of Infection Disease. 208, 1590-1597 (2013).
  23. Melican, K., Michea Veloso, P., Martin, T., Bruneval, P., Duménil, G. Adhesion of Neisseria meningitidis to dermal vessels leads to local vascular damage and purpura in a humanized mouse model. PLoS Pathogen. 9, 1003139(2013).
  24. Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77, 3578-3587 (2009).
  25. Colicchio, R., et al. Virulence traits of serogroup C meningococcus and isogenic cssA mutant, defective in surface-exposed sialic acid, in a murine model of meningitis. Infection and Immunity. , 00688-00718 (2019).
  26. Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726(2014).
  27. Schryvers, A. B., Gonzalez, G. C. Comparison of the abilities of different protein sources of iron to enhance Neisseria meningitidis infection in mice. Infection and Immunity. 57, 2425-2429 (1989).
  28. Beverly, K. S. Chapter 105 - Cerebrospinal Fluid Sampling Small Animal. Critical Care Medicine. , 448-452 (2009).
  29. Liechti, F. D., Grandgirard, D., Leppert, D., Leib, S. L. Matrix metalloproteinase inhibition lowers mortality and brain injury in experimental pneumococcal meningitis. Infection and Immunity. 82, 1710-1718 (2014).
  30. Pagliuca, C., et al. Novel Approach for Evaluation of Bacteroides fragilis Protective Role against Bartonella henselae Liver Damage in Immunocompromised Murine Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1750(2016).
  31. Trampuz, A., Steinhuber, A., Wittwer, M., Leib, S. L. Rapid diagnosis of experimental meningitis by bacterial heat production in cerebrospi- nal fluid. BMC Infectious Diseases. 7, 116(2007).
  32. Tuomanen, E. I., Saukkonen, K., Sande, S., Cioffe, C., Wright, S. D. Reduction of inflammation, tissue damage, and mortality in bacterial meningitis in rabbits treated with monoclonal antibodies against adhesion-promoting receptors of leukocytes. Journal of Experimental Medicine. 170, 959-969 (1989).
  33. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. I. The role of humoral antibodies. Journal of Experimental Medicine. 129, 1307-1326 (1969).
  34. Goldschneider, I., Gotschlich, E. C., Artenstein, M. S. Human immunity to the meningococcus. II. Development of natural immunity. Journal of Experimental Medicine. 129, 1327-1348 (1969).
  35. World Health Organization. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae: WHO manual, 2nd Edition. World Health Organization. , Geneva: WHO. (2011).
  36. Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiolology. 4, 36(2004).
  37. Zhang, S., et al. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. Journal of Visualized Experiments. (1), e137(2018).
  38. Pagliuca, C., et al. Evidence of Bacteroides fragilis protection from Bartonella henselae-induced damage. PLoS One. 7, 49653(2012).
  39. Larson, J. A., Howie, H. L., So, M. Neisseria meningitidis accelerates ferritin degradation in host epithelial cells to yield an essential iron source. Molecular Microbiology. 53, 807-820 (2004).
  40. Festing, M. F. W. Phenotypic variability of inbred and outbred mice. Nature. 263, 230-232 (1976).
  41. Festing, M. F. W. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiology of Aging. 20, 237-244 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج الفأرالتلقيح داخل الصهريجالنيسيرية السحائيةالتهاب السحايا البكتيريالصهريج الكبيرالتفاعل بين المضيف والممرضعدوى أنسجة الدماغتحليل معدل البقاءالفحص النسيجي
حمل التهاب السحايا السحائي Serogroup C في الفئران عن طريق تسليم إينتراسيستيرنال
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.