في هذا البروتوكول ، يتم وضع الخلايا الليمفاوية في الغرفة العليا لنظام الهجرة ، مفصولة عن الغرفة السفلية بواسطة غشاء مسامي. يضاف Chemokine إلى الغرفة السفلى، مما يحفز الهجرة النشطة على طول التدرج chemokine. بعد 48 ساعة، يتم حساب الخلايا الليمفاوية في كلتا الغرفتين لتكميم الهجرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
هنا، نقدم طريقة فعالة التي يمكن تنفيذها مع المهارات المختبرية الأساسية والمواد لتقييم الحركة الكيميائية للخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة عبر الجسم الحي السابق. تم عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية للمجموعة 2 (ILC2) وCD4+ T الخلايا المساعدة من الطحال والرئتين من الفئران التي تواجه بيضة الدجاج (OVA) التي تواجه تحديات BALB/c. وأكدنا التعبير عن CCR4 على كل من CD4+ T الخلايا وILC2، نسبيا. CCL17 و CCL22 هي الأربطة المعروفة لCCR4; لذلك، باستخدام هذه الطريقة الهجرة الجسم الحي السابق فحصنا CCL17- وCCL22 الناجمة عن الحركة من CCR4+ الخلايا الليمفاوية. ولإنشاء تدرجات كيميائية، وُضع كل من CCL17 وCCL22 في الغرفة السفلى لنظام الهجرة العابرة. ثم أضيفت الخلايا الليمفاوية المعزولة إلى الغرف العليا وعلى مدى فترة 48 ح هاجر الخلايا الليمفاوية بنشاط من خلال المسام 3 ميكرومتر نحو chemokine في الغرفة السفلى. هذا هو نظام فعال لتحديد الحركة الكيميائية للخلايا الليمفاوية، ولكن، من المفهوم، لا يحاكي التعقيدات الموجودة في البيئات الدقيقة للأعضاء في الجسم الحي. هذا هو أحد القيود على الطريقة التي يمكن التغلب عليها عن طريق إضافة التصوير في الموقع من الجهاز والخلايا الليمفاوية قيد الدراسة. وعلى النقيض من ذلك، فإن ميزة هذه الطريقة هي أنه يمكن أن يقوم بها فني مبتدئ بمعدل أكثر فعالية من حيث التكلفة من التصوير الحي. كما تصبح المركبات العلاجية متاحة لتعزيز الهجرة، كما هو الحال في تسرب الورم الخلايا المناعية السامة للخلايا، أو لمنع الهجرة، وربما في حالة أمراض المناعة الذاتية حيث علم الأمراض المناعية هو مصدر قلق، ويمكن استخدام هذه الطريقة باعتبارها أداة الفرز. بشكل عام، فإن الطريقة فعالة إذا كان chemokine من الفائدة هو توليد باستمرار الحركية الكيميائية على مستوى أعلى إحصائيا من السيطرة على وسائل الإعلام. وفي مثل هذه الحالات، يمكن تحديد درجة التثبيط/التعزيز من قبل مركب معين أيضاً.
المقدمة
وقدم هذا الأسلوب الأصلي الهجرة من قبل ستيفن بويدن في عام 1962 في مجلة الطب التجريبي1. الكثير مما نعرفه عن الأدوية الكيميائية والحركية الكيميائية لن يكون ممكناً بدون تطوير غرفة بويدن. قبل اكتشاف أول chemokine في عام 1977، تم استخدام أنظمة الهجرة خارج الجسم الحي لمعرفة المزيد عن العوامل المصل التي يمكن أن توقف الحركة الخلوية في الضامة في حين تضخيم الحركة الخلوية في العدلات1،2. وقد وضعت ثروة هائلة من المعرفة فيما يتعلق بهجرة الخلايا المناعية، وحتى الآن، تم اكتشاف 47 chemokines الآن مع 19 مستقبلات المقابلة3،4. وبالإضافة إلى....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم استعراض جميع الأساليب الموضحة هنا والموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في المركز الطبي لجامعة نبراسكا (UNMC) وجامعة يوتا.
1. إعداد وإعداد الكواشف
-
إعداد كامل RPMI (روزويل بارك معهد النصب التذكاري) وسائل الإعلام.
- أضف 10 مل من مصل البقر الجنيني المعطلة حرارة الحرارة (FBS) إلى 90 مل من RPMI.
- إضافة 1 مل من 100X البنسلين-ستربيميتيوسين-الجلوتامين إلى 100 مل من 10٪ FBS RPMI.
-
إعداد وسائط توسيع ILC2.
- إضافة IL-2 و IL-33 (20 نانوغرام /مل لكل سيتوكين) إلى 10 مل من RPMI كاملة.
- إذا كانت السيتوكينات الأسهم هي 10 مي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعبير CCR4 على خلايا CD4+ T وILC2.
لنجاح تجربة الهجرة الخارجية في الجسم الحي، لا بد من تحديد ما إذا كانت الخلايا الليمفاوية تستجيب لCCL17 و CCL22 من خلال CCR4. لذلك، حددنا التعبير CCR4 على كل من CD4+ T الخلايا وILC2 عن طريق قياس التدفق. في حين أنه من المعروف جيدا أن OVA محددة CD4+ الخلايا T المساعد التعبير عن CCR4، ومن المعروف أقل من التعبير عن CCR4 على ILC2. ويبين الشكل 1 النتائج التمثيلية للتعبير CCR4، نسبياً، على خلايا CD4.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، نقدم طريقة راسخة لتقييم الهجرة الناجمة عن chemokine من الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة في الجسم الحي السابق. هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول، أولها التحقق من التعبير عن مستقبلات chemokine الصحيح على الخلايا المناعية في التجربة. في أيدينا، اخترنا CCR4 بسبب الجسم من الأدب الذي يسلط الضوء على أهمية CCR4 على الخلايا T المساعد Th2 في التهاب الحساسية. وقد تبين في السابق التهاب Ovalbumin الناجمة عن أن تكون محدودة من قبل اثنين على الأقل من مضادات CCR424,25; ومع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ أي إقرارات مالية أو تضارب في المصالح للكشف عنها.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية الرئة الأمريكية (K.J.W.)، وصندوق يوجين كيني التذكاري الذي منح لT.A.W. وK.J.W.، والدعم السخي لبدء من جامعة يوتا لK.J.W.، وجائزة وزارة شؤون المحاربين القدماء إلى T.A.W. (VA I01BX0003635). T.A.W. هو حاصل على جائزة عالم مهنة البحوث (IK6 BX003781) من وزارة شؤون المحاربين القدماء. ويود صاحبا البلاغ أن ينوه بالمساعدة التحريرية التي تقدمها السيدة ليزا تشودوميلكا. ويشكر المؤلفون نواة قياس التدفق في اللجنة على دعمهم في جمع بيانات قياس التدفق السيتومتري ة التي تم إنشاؤها لهذه المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.4٪ تريبان بلو | سيجما ألدريتش | 15250061 | |
| 1 مل حقنة | BD Bioscience | 329424 | U-100 محاقن مايكرو فاين 28 جم 1/2 بوصة 1 سم مكعب |
| 100x بنسلين ستربتومايسين ، L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | تمييع إلى 1x في وسائط RPMI |
| 15 مل أنابيب مخروطية | أوليمبوس بلاستيك | 28-101 | أنابيب بولي بروبلين |
| 3 مو ؛ إدراج m transwell | Genesee Scientific | 25-288 | 24 بئر تحتوي على 12 إدراج عابر |
| بئر 3x | تثبيت BD Pharmigen | 338036 | قم بإعداد محلول 1x وفقا لبروتوكول الشركات المصنعة |
| 5 مل أنابيب البوليسترين تقنيات | الخلايا الجذعية | 38007 | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | أوليمبوس بلاستيك | 28-106 | أنابيب |
| البولي بروبلين8 غرف مغناطيس فصل سهل | STEM Cell Technologies | 18103 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies Corporation | A1049201 | |
| مصفاة خلية متقدمة ، 40 & م | جينيسي العلمية | 25-375 | شبكة نايلون ، 40 مو ؛ مصافي |
| م هيدروكسيد الألومنيوم ، كاشف الصف | سيجما ألدريتش | 239186-25G | 20 مجم / مل |
| مضاد للفأر CCR4 ؛ Biolegend المترافق | APC 131211 | 0.5 & mu ؛ ز / اختبار | |
| مضاد للفأر CD11b | BD Pharmigen | 557396 | 0.5 & mu ؛ ز / اختبار |
| مكافحة الماوس CD11c ؛ PE eFluor 610 | Thermo-Fischer Scientific | 61-0114-82 | 0.25 & mu ؛ ز / اختبار |
| مكافحة الماوس CD16 / 32 ، كتلة Fc | BD Pharmigen | 553141 | 0.5 & mu ؛ ز / اختبار |
| مكافحة الماوس CD19 ؛ APC-eFluor 780 مترافق | Thermo-Fischer Scientific | 47-0193-82 | 0.5 & mu ؛ ز / اختبار |
| مكافحة الماوس CD3 ؛ PE Cy 7-مترافق | BD Pharmigen | 552774 | 0.25 & mu ؛ ز / اختبار |
| مكافحة الماوس CD45 ؛ PE مترافق | BD Pharmigen | 56087 | 0.5 & mu ؛ ز / اختبار |
| ICOS المضادة للفأر (CD278) BD | Pharmigen | 564070 | 0.5 & mu ؛ ز/اختبار |
| مضاد للفأر NK1.1 (CD161); | Pharmigen | FITC 553164 | 0.25 & mu ؛ ز / اختبار |
| المضادة للماوس ST2 (IL-33R) ؛ PerCP Cy5.5 | Biolegend | المترافق 145311 | 0.5 & mu ؛ g / test |
| عداد الخلايا الآلي | BIORAD | 1450102 | |
| المفكك الآلي | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| ألبومين مصل البقر ، مسحوق مجفف بالتجميد | Sigma-Aldrich | A2153-10G | 0.5٪ في عداد الخلايا RPMI الخالي من المصل |
| Clides | BIORAD | 1450015 | |
| بيض الدجاج Ovalbumin ، الدرجة الخامسة | Sigma-Aldrich | A5503-10G | 500 & جم / مل |
| كولاجيناز ، النوع 1 ، | ورثينجتون للكيمياء الحيوية | المفلترة CLSS-1 ، شراء على شكل قوارير 5 × 50 مجم (LS004216) | 25 وحدة / مل في |
| حبات تعويض | RPMI Affymetrix | 01-1111-41 | 1 قطرة لكل أنبوب كونتول |
| أنابيب التفكك | MACS Miltenyi Biotec | 130-096-335 | |
| FACS Buffer | BD Pharmigen | 554657 | 1x PBS + 2٪ FBS ، ث / أزيد الصوديوم ؛ مخزنة في 4 درجات ؛ C |
| الحرارة المعطلة FBS | Genesee Scientific | 25-525H | 10٪ في RPMI الكامل & ILC2 ماوس وسائط |
| التوسع CCL17 | GenScript | Z02954-20 | 50 نانوغرام / مل |
| ماوس CCL22 | GenScript | Z02856-20 | 50 نانوغرام / مل |
| ماوس CD4+< / sup> طقم تخصيب الخلايا التائية | تقنيات الخلايا الجذعية | 19852 | |
| ماوس IL-2 | GenScript | Z02764-20 | 20 نانوغرام / مل |
| طقم تخصيب الماوس ILC2 | تقنيات الخلايا الجذعية | 19842 | |
| الخلايا الجذعية | المؤتلفة للفأر | 78044 | 20 نانوغرام / مل |
| RPMI | Life Technologies Corporation | 22400071 | |
| عزل الفصل | STEM Cell Technologies Technologies | 20144 | 1x PBS + 2٪ FBS ؛ مخزنة عند 4 درجات ؛ ج |
| البخاخات للحيوانات الصغيرة والغرفة | البيانات الدولية | ||
| للمحلول الملحي المعقم | باكستر | 2F7124 ؛ NDC 0338-0048-04 | 0.9٪ كلوريد الصوديوم |
المراجع
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Moser, B. Editorial: History of Chemoattractant Research. Frontiers in Imm....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
