يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية

5.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60065

⸱

سبتمبر 29, 2019

 ,  , 
1Department of Pediatric Rheumatology and Immunology, University Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقه تنقيه لبروتين الكالسيوم الخالي من العلامات المؤتلف S100A12 والقلة المستحثة بالأيونات لاختبارات تحفيز البويضات البشرية.

الملخص

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف طريقه لتنقيه الإنسان الكالسيوم ملزمه البروتين S100A12 ولها الأيونات الناجمة عن الايونيه من الثقافة القولونية لتحفيز الخلايا المناعية. ويستند هذا البروتوكول علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تشمل البروتين قبل تنقيه علي عمود اللوني التبادل انيون وخطوه تلميع اللاحقة علي عمود التفاعل مسعور. وتنتج هذه الاستراتيجية S100A12 بروتين عالي النقاء والغلة بتكاليف يمكن التحكم فيها. لاختبارات وظيفية علي الخلايا المناعية بقايا في نهاية المطاف التلوث اندوتوكسين يتطلب الرصد الدقيق والمزيد من الخطوات التنظيف للحصول علي البروتين الخالي من اندوتوكسين. ويمكن استبعاد غالبيه تلوث السمية المعوية من خلال الفصل اللوني لتبادل انيون. لاستنفاد تلوث المتبقية ، يصف هذا البروتوكول خطوه أزاله مع مرشحات الطرد المركزي. اعتمادا علي القوه الأيون المتاحة S100A12 يمكن ان يرتب في homomultimers مختلفه. وللتحقيق في العلاقة بين الهيكل والوظيفة ، يصف هذا البروتوكول أيضا المعالجة الايونيه للبروتين S100A12 التي تليها الوصلات الكيميائية لتحقيق الاستقرار S100A12 قله المواليد وانفصالها اللاحق بالحجم-الاستبعاد اللوني. وأخيرا ، فاننا نقوم بوصف الفحص القائم علي الخلايا الذي يؤكد النشاط البيولوجي للبروتين المنقي ويؤكد التحضير الخالي من LPS.

المقدمة

S100A12 هو بروتين ملزم الكالسيوم الذي يتم إنتاجه في الغالب من قبل المحببات البشرية. يتم الإفراط في البروتين خلال (الجهازية) التهاب ومستويات المصل ، وخاصه في (السيارات) الامراض التهابيه مثل التهاب المفاصل الجهازية الاحداث مجهول الشكل (sJIA) ، حمي البحر الأبيض المتوسط العائلية (FMF) أو مرض كاواساكي (KD) يمكن ان تبلغ عن نشاط المرض والاستجابة للعلاج. اعتمادا علي مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs) مثل المستقبلات مثل الحصيلة (TLRs) ، يمكن تنشيط الجهاز المناعي الفطري من الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) مثل الليبوكوليساشاريدس (LPS) أو تلف الأنماط الجزيئية المرتبطة (DAMPs; ويطلق عليه أيضا اسم "الاردقائق". DAMPs هي جزيئات الذاتية مثل البروتينات الخلوية ، والدهون أو الأحماض النووية1. ووصفت بشكل جيد وظائف رطبه لأعضاء عائله البروتين كالغرولين ، S100A8/A9 و S100A122، والتي يتم أيضا الإبلاغ عنها للعمل كمعدن ثنائي التكافؤ الأيونات المضادة للميكروبات الببتيدات3،4، 5,6. [دبندينغ ون] ال يتوفر أيون قوه S100A12 علبه, مثل أخرى أعضاء من ال S100 أسره, يرتب داخل [هوميمرمررس] مختلفه وحتى مؤخرا التاثير من [S100A12-اوليغمرايشن] علي [بر]-تفاعل, بشكل خاص TLR4, كان مجهوله.

يتكون البروتين الأحادي الشكل (92 الأحماض الامينيه ، 10.2 كده) من اثنين من الهياكل الحلزونية اللولبية المتصلة بواسطة رابط مرن. و C-الطرفية ef-اليد يحتوي علي الكلاسيكية Ca2 +-ربط عزر في حين ان N-الطرفية ef-اليد يسلك هيكل حلقه موسعه البروتين الخاصة S100 (' الزائفة-ef-اليد ') ويكشف انخفاض Ca2 +-تقارب. Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 يمكن ان تحفز علي تغيير المطابقة الرئيسية في البروتينات ' C-المحطة ، مما يؤدي إلى التعرض لرقعه مسعورة علي كل مونومر ويشكل واجهه ديميريشن. وهكذا ، في ظل الظروف الفسيولوجية ، أصغر هيكل رباعي شكلتها S100A12 هو ديمر غير التكافؤ (ما يقرب من 21 كده) فيها مونومرات الفردية في اتجاه مضاد للمتوازي. عندما رتبت كما dimer, وذكرت S100A12 لتنحيه الزنك2 + فضلا عن غيرها من أيونات المعادن ثنائي التكافؤ, علي سبيل المثال, Cu2 + مع تقارب عاليه7. وتنسق هذه الأيونات في واجهه S100A12 ديمر بواسطة الأحماض الامينيه H15 وD25 الوحدة الفرعية واحده وH85 فضلا عن H89 الفرعية الأخرى8,9,10المضادة لمتوازي الأضلاع. في حين ان الدراسات السابقة تقترح ان الزنك2 +-تحميل S100A12 قد تحفز منظمه البروتين إلى الإنسان-الترام (44 كده) ويؤدي إلى زيادة Ca2 +-تقارب11,12, المعايرة الاخيره المعادن دراسات6 تشير Ca2 +-ملزم من قبل S100A12 لزيادة تقارب البروتين إلى الزنك2 +. مره واحده S100A12 EF-الأيدي التي احتلت بالبالكامل من قبل Ca2 +، ويعتقد ca2 + اضافيه للربط بين الدمامل ، مما اثار تشكيل hexamer (حوالي 63 كده). ومن الواضح ان البنية المعمارية للهيكل السداسي الأضلاع مختلفه عن الهيكل الرباعي. ومن المقترح ان يتم تعطيل واجهه رباعيه لتؤدي إلى واجات dimer-dimer الجديدة التي تفيد تشكيل hexamer10. يتم التعبير عن S100A12 بشكل حصري تقريبا من قبل المحببات البشرية حيث تشكل حوالي 5 ٪ من جميع البروتين السيتووليك13. في وظيفته رطبه S100A12 وصفت تاريخيا بأنه ناهض من متعددة ligand مستقبلات للمنتجات النهائية glycation المتقدمة (الغضب) ، ثم وصفت حديثا خارج الخلية المعروفة الغضب البروتين ملزمه (EN-الغضب)14. وان كنا قد أبلغت في وقت سابق S100A12 البيوكيميائية لكل من الغضب و TLR415، ونحن أظهرت مؤخرا الخلايا الاحاديه الإنسان للرد علي التحفيز S100A12 بطريقه تعتمد علي TLR416. وهذا يتطلب ترتيب S100A12 في المرجع المصدق2 +/Zn2 +-المستحثة سداسي الأضلاع هيكل كوارتيراري16.

هنا نحن وصف اجراء تنقيه لS100A12 البشرية المؤتلف والتي يسببها الأيونات لتحفيز الخلايا المناعية16,17. ويستند هذا علي استراتيجية الفصل اللوني من خطوتين ، والتي تتضمن في البداية عمود انيون-تبادل لعزل وتركيز البروتين وأزاله التلوث السائبة (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين/ليبووليساشاريدس)18. راتنجات الفصل اللوني للتبادل الأيوني بروتينات منفصلة علي أساس مختلف صافي الرسوم السطحية. للبروتينات الحمضية مثل S100A12 (نقطه ايزوالكتريك من 5.81) ، ونظام العازلة مع درجه الحموضة من 8.5 وقويه انيون-تبادل الراتنج يؤدي إلى فصل جيد. تم التملص من البروتينات المنضمة مع التدرج العازلة عاليه الملح. مع زيادة الأيونات السلبية قوه الايونيه في العازلة التهرب تتنافس مع البروتينات للرسوم علي سطح الراتنج. البروتينات بشكل فردي الوت اعتمادا علي صافي التهمه ونتيجة لذلك ، والمخازن المؤقتة الموصوفة هنا تسمح لعزل وتركيز البروتين S100A12 الإفراط في التعبير. بسبب الجماعات المشحونة سلبا في الليبووليساشاريدس ، ترتبط هذه الجزيئات أيضا إلى راتنجات التبادل انيون. ومع ذلك ، فان ارتفاع الرسوم الصافية يؤدي إلى التملص في وقت لاحق في التدرج عاليه الملح المطبق. وقد تم إدخال الخطوة الثانية من اجراء تنقيه لتلميع الأغراض. وهذا يجعل استخدام قدره ربط الكالسيوم من S100A12 ويزيل الشوائب المتبقية علي عمود التفاعل مسعور. الكالسيوم ملزمه من S100A12 يؤدي إلى تغيير المطابقة والتعرض للبقع مسعور علي سطح البروتين. علي هذا الشرط ، يتفاعل S100A12 مع سطح مسعور من الراتنج. علي الكالسيوم-chelating من قبل أدتا ، يتم عكس هذا التفاعل. في وجود الأيونات ، وخاصه الكالسيوم والزنك ، S100A12 يرتب في الأقليات homomeric. لدراسة هيكل العلاقات وظيفة من القلة المختلفة ، ونحن استقرت ديميريك ، رباعيه الS100A12 والمؤتلف هيكاميرك مع الرابط الكيميائية وفصل المجمعات علي عمود اللوني الاستبعاد الحجم. وأخيرا ، لتحليل الأداء الوظيفي والنشاط البيولوجي للبروتين المنقي والقلة المستحثة بالأيونات ، يمكن مقارنه الإصدار الخلوي من S100A12 و LPS الذي يحفز البويضة الاحاديه.

وقد وصفت طرق مختلفه لتنقيه S100A12 حتى الآن. وعلي سبيل المثال ، نشر جاكسون وآخرون19بروتوكولا بالتنقية عن طريق عمود التبادل انيون والفصل اللوني اللاحق لحجم الاستبعاد. تلميع تنقيه علي عمود الحجم الاستبعاد يؤدي إلى نتائج جيده ، ولكن-بسبب علي سبيل المثال احجام التحميل محدوده-اقل مرونة في قابليه التحجيم. نهج مختلف ، نشرتها قبله وآخرون20، يصف تنقيه البروتين الموسومة عن طريق Ni2 + عمود التقارب كخطوه تنقيه الاولي ، تليها الانقسام الانزيمي لأزاله العلامة والمزيد من خطوات تنقيه. علي النقيض من الدراسات aforecited19،20، يتم تحديد البروتين المنتجة كما هو موضح في هذا البروتوكول للتجارب علي الخلايا المناعية. ولذلك ، فان بقايا التسمم المعوي من الثقافة البكتيرية هو تحد. علي الرغم من انه قد تم وصف النهج المختلفة لأزاله الذيفان المعوي حتى الآن ، لا توجد طريقه موحده تعمل بشكل جيد علي قدم المساواة لأي محلول بروتين معين21،22.

وباختصار ، فان بروتوكولنا يجمع بين مزايا التعبير الخالي من العلامات في نظام بكتيري مع أزاله اندوتوكسين فعاله والغلة العالية من البروتين النقي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظه: يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1 لاعداد المخازن المؤقتة وحلول الأسهم.

1. البروتين التعبير في كولاي

  1. استنساخ
    1. استنساخ العلامة الحرة الإنسان S100A12 (NCBI المرجع تسلسل: NP_ 005612.1) في ناقلات التعبير البكتيرية pET11b. للتعبير عن البروتين ، وتحويل البناء إلى e. القولونية BL21 (DE3).
  2. الثقافه
    1. اعداد ثقافة بداية عن طريق تطعيم مستعمره واحده في 5 مل من متوسط النمو (رطل مرق مع 100 ميكروغرام/مل ampicillin) في أنبوب 14 مل جولة أسفل. احتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة. نقل 2 − 4 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها إلى 400 مل من متوسط النمو في قارورة ايرلينماير 2 لتر واحتضان الثقافة في 37 درجه مئوية مع اهتزاز في 220 دوره في الدقيقة.
      ملاحظه: الكثافة الاوليه للثقافة الرئيسية يجب ان تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) = 0.1.
    2. مراقبه OD600 خلال النمو. الحث علي التعبير عن البروتين بالاضافه إلى 1 م ايزوبروبيل-دي-د-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) إلى تركيز نهائي من 1 ملم في OD600 = 0.5-0.6. احتضان في 37 درجه مئوية و 220 دوره في الدقيقة لمده 4 ساعات اضافيه.
      ملاحظه: بشكل عام ، سيتم التوصل إلى600 OD من 0.6 بعد 1.5 − 2.5 h عند 37 درجه مئوية.
    3. اعداد 50 mL المخزن المؤقت سونيكيشن عن طريق تذويب 50 mM تريس ، 50 mM كلوريد الصوديوم و 1 ملليمتر ايثيل لينديمين حمض تتراكسي (أدتا) في 40 مل من الماء منزوع الأيونات. ضبط درجه الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك إلى 8.0 وجعل ما يصل إلى 50 mL. أضافه مثبط الانزيم البروتيني (1 قرص لكل 50 mL محلول) وتتوازن العازلة إلى 4 ° c.
    4. نقل الثقافة البكتيرية إلى زجاجات الطرد المركزي مناسبه وحصاد الخلايا في 3,200 x g لمده 30 دقيقه في 4 °c. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 25 مل من المخزن المؤقت سونيكيشن الجليد الباردة. من الآن فصاعدا إبقاء الخلايا علي الجليد.
      ملاحظه: يمكن تخزين الخلايا المعاد تعليقها عند-20 درجه مئوية للأجل القصير و-80 درجه مئوية للأجل الطويل.
  3. سونيكيشن/تحلل
    1. سوكاتي الخلايا ل 6 دورات من 30 ق علي الجليد. بعد كل دوره ، وبقية الخلايا لمده 30 − 60 s لحماية الخلايا من ارتفاع درجه الحرارة.
    2. نقل تعليق الخلية إلى ما قبل المبردة 50 mL عاليه السرعة أنبوب طرد والطرد المركزي في الدوار زاوية ثابته في 15,000 x g لمده 30 دقيقه في 4 ° c. Decant مسح محلله الذي يحتوي علي البروتينات السيتووليك القابلة للذوبان في أنبوب 50 mL الطازجة وتجاهل بيليه.

2. تنقيه البروتين

  1. انيون-تبادل اللوني
    1. غسيل الكلي
      1. اعداد انيون-تبادل اللوني (AIEX) العازلة من قبل تذويب 20 مم تريس ، 1 مم أدتا و 1 مم جلايكول الاثيلين-bis (2-امينوميثيلثر)-N ، N ، N ' ، N'-رباعي حمض (EGTA) في الماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.5 مع HCl. لغسيل الكلي اعداد 2 × 5 لتر واللوني 2x 1 L من AIEX العازلة A.
        ملاحظه: يجب ان تكون وحده التخزين الهاتفية في حوالي 100 مرات وحده تخزين العينة. يجب ان يتم تصفيه جميع المخازن المؤقتة المستخدمة للكروماتوغرافي (0.45 μm أو أصغر) والغاز (علي سبيل المثال ، عن طريق حمام الموجات فوق الصوتية أو فراغ التفريغ).
      2. قطع أنابيب الغسيل الكلوي (قطع الوزن الجزيئي [MWCO]: 3.5 كده) إلى طول مناسب مع مساحة اضافيه للهواء لضمان الطفو عينه فوق شريط تحريك الدورية.
        ملاحظه: الجلسرين يحفظ الغشاء ويجب ازالته قبل الاستخدام.
      3. للحد من اللزوجة محلول البروتين تطهيرها من الخطوة 1-3-2 ، تمييع الحل مع 25 مل من AIEX العازلة A لتسهيل التطبيق اللاحق للعمود اللوني. نعلق الإغلاق الأول علي الأنابيب ، وتحميل العينة في الغشاء ونعلق الإغلاق الثاني علي الأقل 1 سم من الطرف العلوي من الأنابيب.
      4. ضع حاويه 5 لتر مع العازلة AIEX A علي لوحه يحركها ، أضافه شريط ضجة والغشاء مليئه محلول البروتين. ضبط السرعة لتدوير العينة عن طريق تجنب التداخل مع تحريك الشريط الدوار. الديزه لمده 12 − 24 ساعة عند 4 درجه مئوية ، ثم استبدل العازل المؤقت (AIEX المخزن المؤقت A) باعداد طازج قبل التبريد واستمر لمده 4 ساعات اضافيه علي الأقل. نقل محلول البروتين ديزيد إلى أنبوب 50 mL وتصفيه من خلال وحده تصفيه 0.45 μm.
        ملاحظه: التخزين ممكن.
    2. اللوني
    3. بدء تشغيل نظام اللوني السائل (FPLC) مع الصيانة العامة ، وربط المخازن المؤقتة العمود AIEX A و AIEX B (AIEX العازلة مع 1 م NaCl) والعمود الذي يحتوي علي الراتنج التبادل انيون. راجع الجدول 1 لمعلمات الكروماتوغرافي العامة.
      ملاحظه: يجب ان معايرتها المخازن المؤقتة والاعمده ومعدات FPLC إلى نفس درجه الحرارة قبل بدء التشغيل (راجع معلمات الكروماتوغرافي في الجدول 1، الجدول 2، الجدول 3، الجدول 4، والجدول 5).
    4. تتوازن العمود مع المخزن المؤقت aiex a ، ثم تحميل العينة علي العمود و الوت البروتينات مع التدرج الخطي من 0 ٪ إلى 100 ٪ عاليه الملح العازلة (aiex B). راجع الجدول 2 للحصول علي بروتوكول أسلوب مفصل.
    5. جمع 2 مل الكسور اثناء الشطف وتحليل 10 μL من كل كسر علي كوماسي 15 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS الصفحة). تجمع الكسور التي تحتوي علي بروتين S100A12 لغسيل الكلي.
      ملاحظه: الوزن الجزيئي S100A12 هو 10,575 دا.
  2. التفاعل اللوني المسعور الذي يعتمد علي الكالسيوم (الائتلاف)
    1. غسيل الكلي
      1. الحل البروتين ضد 20 مم تريس ، 140 mM NaCl ، pH 7.5 اتباع الاجراء الموصوف في القسم 2-1-1.
    2. اللوني
      1. اعداد 1 لتر من العازل اللوني للموئل A عن طريق تذويب 20 مم تريس ، 140 mM كلوريد الصوديوم و 25 مم CaCl2 في الماء منزوع الأيونات وضبط درجه الحموضة إلى 7.5. للموئل العازلة B ، تذوب 20 مم تريس ، 140 mM NaCl و 50 mM أدتا. ضبط درجه الحموضة إلى 7.0 وتصفيه و ديغا المخازن المؤقتة. أضافه CaCl2 إلى العينة إلى تركيز نهائي من 25 ملم وتصفيه من خلال 0.45 Μm. تتوازن الائتلاف المؤقت وعينه إلى 4 درجه مئوية (درجه حرارة العمود).
      2. بدء تشغيل نظام اللوني السائل مع الصيانة العامة ، وربط المخازن المؤقتة العمود الائتلاف A و B والعمود. راجع الجدول 3 لمزيد من معلمات الكروماتوغرافي.
      3. تتوازن العمود ، وتحميل العينة وتوسيع كتله ' غسل عينه غير منضم ' حتى تصل اشاره الاشعه فوق البنفسجية إلى مستوي خط الأساس مره أخرى. ثم بدء التملص مع الكالسيوم التي تحتوي علي العازلة المخزن المؤقت (أدتا). راجع الجدول 4 للحصول علي بروتوكول أسلوب مفصل.
        ملاحظه: وقد أظهرت التجارب السابقة ان فائضا من الكالسيوم يبدو ان تكون مفيده للربط من S100A12 إلى راتنج اللوني.
      4. جمع كسور الذروة من 2 مل وتحليل 10 μL من كل كسر علي كوماسي-الملون 15 ٪ SDS-الصفحة. تجمع الكسور S100A12 النقية والديزه ضد Hepes-المحلول الملحي المخزنة (HBS ؛ 20 مم Hepes ، 140 mM NaCl ، pH 7.0) كما هو موضح في القسم 2-1-1.
        ملاحظه: معامل الانقراض من موحودي S100A12 هو 2980 M-1 سم-1.

3. كشف وأزاله السموم الباطنة

  1. الكشف عن الذيفان المعوي
    1. لتحديد التلوث اندوتوكسين ، قياس تركيزات البروتين المخفف من الخطوة 2.2.2.4. (علي سبيل المثال ، 1:10 و 1:100 في HBS) باستخدام مقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA) ، والتي تعتمد علي الفحص الفلوريللكشف عن السموم (جدول المواد). قم باجراء هذا الفحص باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظه: استخدام حلول HBS الطازجة التي تم حلها في الماء منزوع الأيونات الفائقة لتجنب (جديد) التلوث اندوتوكسين من قبل العازلة.
  2. أزاله الذيفان المعوي وتركيز البروتين
    1. تحميل 15 مل من عينه علي وحده تصفيه الطرد المركزي 50 دهت وأجهزه الطرد المركزي في 3,200 x g و 10 °c لمده 10 دقيقه تقريبا. نقل تدفق من خلال إلى سفينة جديده (علي الجليد) وأعاده التعبئة والطرد المركزي في 50 كده تصفيه أنبوب كلما كان ذلك ضروريا. يغسل غشاء فلتر مرتين مع HBS لاسترداد أكبر قدر ممكن من البروتين بعد كل خطوه.
    2. التركيز علي S100A12 التي تحتوي علي التدفق من خلال استخدام فلتر الطرد المركزي 3 كده حتى يتم خفض حجم إلى خمسه تصل إلى واحد عشر من حجم التحميل الاولي (طرد في 3,200 x g، 10 درجه مئوية لمده 30 دقيقه تقريبا). أعاده ملء الفلتر كلما كان ذلك ضروريا ، شطف الغشاء ونقل المحلول المركز إلى أنبوب جديد بعد كل أعاده ملء. تجاهل التدفق من خلال. تصفيه مره أخرى من خلال 50 كده كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظه: خلال هذا الاجراء ، فان فقدان البروتين ملحوظ (تصل إلى 50 ٪) ، ولكن يتم استنفاد اعداد البروتين المتبقية تماما من LPS. هذا الأسلوب غله حوالي 10 − 15 ملغ بروتين من 400 mL الثقافة.
    3. ضبط محلول البروتين إلى 1 مغ/مل مع اندوتوكسين خاليه من HBS وقياس محتوي LPS كما هو موضح في الخطوة 3-1-1. في حال لم يتم بعد اختبار محلول البروتين كما LPS خاليه (< 0.1 الاتحاد الأوروبي/مل) ، والقضاء علي بقايا تلوث باستخدام راتنج أزاله اندوتوكسين.
      ملاحظه: مع تركيز البروتين من 1 مغ/مل, تلوث 0.1 الاتحاد الأوروبي/mL LPS يساوي تقريبا 0.01 pg البروتين الغرام/ميكروغرام.

4. الربط الكيميائي والانفصال اوليغمير

  1. الربط الكيميائي
    1. اعداد نقيه للغاية (اندوتوكسين خاليه) حلول الأسهم من 1 M cacl2 و 100 mM zncl2 في المياه منزوع الأيونات نقاء (جدول المواد). استخدم هذا المخزن المؤقت ، الذي تم اجراؤه حديثا ، للخطوة التالية.
    2. احتضان 10 مل من المنقي الخالي من السموم S100A12 (تركيز 1 مغ/مل في HBS) لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT) مع اما 25 مم CaCl2 ل ديميريك/رباعيه ، أو 25 مم cacl2 و 1 مم zncl2 ل HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligomers.
    3. اعداد crosslinker عن طريق تذويب 8 ملغ من BS3 في 500 μl من المياه الخالية من اندوتوكسين مباشره قبل الاستخدام (8 ملغ crosslinker ل 10 مل محلول البروتين الأيونات التي ارتفعت يساوي تركيز النهائي من 1.4 mM). مزيج crosslinker وعينه عن طريق التنضيد واحتضان لمده 30 دقيقه اضافيه في RT. إرواء رد الفعل عن طريق أضافه 1 M تريس-HCl ، pH 7.5 إلى تركيز نهائي من 50 mM وتصفيه من خلال 0.45 μm.
  2. الفصل اللوني للاستبعاد الحجم
    1. تتوازن العينة المتقاطعة إلى 12 − 15 درجه مئوية (درجه حرارة العمود) وبدء نظام الفصل اللوني السائل مع الصيانة العامة. الاتصال المخزن المؤقت العمود (HBS) والعمود حجم الاستبعاد. يرجى الرجوع إلى الجدول 5 للحصول علي معلومات مفصله.
    2. تتوازن العمود في HBS ، وتحميل عينه وجمع كسور الذروة (1 − 2 مل) اثناء التشغيل. تحليل هذه الكسور علي 4 − 20 ٪ التدرج SDS-صفحه وتجمع الكسور مع العصابات الرئيسية من مجمع البروتين المطلوب.
      ملاحظه: التحلل من الكواشف استر الدائرة العامة للصحة مثل BS3 في الحلول المائية النتائج في امتصاص قوي في 280 nm. غير منضم crosslinker (الوزن الجزيئي: 572 g/mol) التملص في نهاية الشوط والنتائج في ذروه قويه.
    3. التركيز علي الحلول باستخدام وحدات تصفيه الطرد المركزي مع MWCOs من 10 ده (dimer) ، 30 ده (رباعيه) أو 50 كده (hexamer). تحديد التلوث الذيفان المعوي كما هو موضح في القسم 3.1. إذا لزم الأمر ، أزاله LPS المتبقية مع راتنج أزاله اندوتوكسين بعد توصيات الشركة المصنعة (جدول المواد).

5. اختبار وظيفي علي الخلايا الاحاديه

  1. اعداد الخلايا الاحاديه
    1. عزل الخلايا الاحاديه من معاطف بافي البشرية بواسطة طرد التدرج الكثافة والإثراء اللاحق للخلايا الاحاديه باستخدام مجموعه فصل الخرزة المغناطيسية (جدول المواد).
      ملاحظه: هذا البروتوكول سوف يؤدي إلى ما يقرب من 5 − 7 × 107 الخلايا الاحاديه (معطف بافي واحد) مع نقاء 83 − 95 ٪. بما ان الرقم, غير ان أيضا الاستجابة الخلايا يعتمد بقوة علي المتبرع, البروتوكول يمكن كنت ان يكون رفعت فوق ([دبندينغ ون] ال يتطلب خليه حساب).
    2. لطرد الكثافة ، تتوازن حل الفصل (الكثافة = 1.077 g/mL) إلى RT ونقل 20 مل في أنابيب الطرد المركزي 50 mL (2 أنابيب لكل معطف بافي). تمييع الدم من معطف بافي الإنسان مع محلول الملح هانك مخزنه (HBSS) إلى الحجم الإجمالي من 60 mL وطبقه 30 مل من هذا الخليط بعناية علي راس متوسط الفصل. جهاز الطرد المركزي في 550 x g ل 35 دقيقه في RT. تعطيل الفرامل الطاردة للطرد المركزي.
    3. وبعد طرد ، توجد خلايا الدم المحيطيه الاحاديه النواة مباشره علي قمة وسيط الفصل. نقل هذه الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ml جديده ، وجعل ما يصل إلى 50 ml مع hbss ، وأجهزه الطرد المركزي في 170 x g ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في حجم صغير من hbss عن طريق التنضيد.
    4. ملء أنبوب يصل إلى 50 mL والطرد المركزي في 290 x g ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي مره أخرى ، أعاده تعليق الخلايا في hbss (50 mL) والطرد المركزي في 170 x g لمده 10 دقيقه. عد الخلايا وأعاده تعليقها في المخزن المؤقت لفصل الخلايا (جدول المواد < /c9 >) إلى تركيز 5 × 107 خلايا/مل.
      ملاحظه: وبدلا من HBSS ، يمكن استخدام المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (تلفزيوني) لغسل الخلايا.
    5. بالنسبة لعزل الخلايا الاحاديه من Pbmmcmcmcmcmcmcmcmcmmcmcmmcmmc. عدد الخلايا الاحاديه وأعاده التعليق في المتوسطة أحاديه الخلية (RPMI 1640 ، 15 ٪ الحرارة المنشط الجنين الساق [FCS] ، 4 ملم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين/ستربتوميسين) إلى تركيز 2 × 106 خلايا/مل.
    6. إلى ثقافة الخلايا الوحيدة ، والاطباق الثقافة معطف (علي سبيل المثال ، 100 مم) مع مسعور ، فيلم الغاز نفاذيه ، ومناسبه لخلايا التعليق (جدول المواد). تعقيم لوحات باستخدام ضوء الاشعه فوق البنفسجية لمده 30 دقيقه تقريبا. نقل الخلايا إلى هذه اللوحات الثقافية والسماح لهم الراحة علي مدي الليل في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
      ملاحظه: استخدام 15 − 25 مل من تعليق الخلية لكل طبق المغلفة.
  2. تحفيز الخلايا الاحاديه
    1. التحفيز مع S100A12 (النوع الوحشي)
      ملاحظه: لتمييز الS100A12 غير المعالجة (المنتج النهائي من القسم 2-2-2) عن البروتين المتداخل ، يتم الاشاره إلى S100A12 في ما يلي باسم "النوع البري".
      1. نقل الخلايا استراح في أنبوب الطرد المركزي 50 mL والطرد المركزي في 350 x ز ل 10 دقيقه. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة التحفيز (rpmi 1640 ، 5 ٪ الحرارة المعطلة FCS ، 4 مم L-الجلوتامين ، 100 U/mL البنسلين/ ستربتومايسين) بتركيز 2 × 106 خلايا/مل.
      2. للتحفيز ، استخدم 24 لوحات تعليق جيدا وأضافه 250 μL من تعليق الخلية في بئر (0.5 x 106 خلايا/بئر). أضافه 50 ميكروغرام/مل بوليميكسين ب إلى الآبار المقصودة ، تليها اما LPS في تركيزات مختلفه (25 ، 50 ، 100 و 200 pg/mL) أو wildtype S100A12 (10 ، 20 ، 40 ، 60 ميكروغرام/مل). وعلاوة علي ذلك ، تطبيق البروتين اما غير المعالجة أو الحرارة المشوهة (99 درجه مئوية ، 10 دقيقه) في تركيزات مختلفه للخلايا.
        ملاحظه: المعالجة الحرارية قصيرة الS100A12 البروتين ولكن لديها اقل من اي تاثير علي LPS.
      3. احتضان لوحات ل 4 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. حصاد الخلايا عن طريق نقل تعليق الخلية من كل بئر لأنابيب التفاعل 1.5 mL. أجهزه الطرد المركزي في 500 x g لمده 10 دقيقه نقل supernatants إلى أنابيب جديده وقياس tnfα الإفراج في التخفيفات المختلفة (علي سبيل المثال ، 1:2 ، 1:5 ، 1:10) مع مجموعه الإنسان TNFΑ ELISA بعد توصيات الشركة المصنعة.
    2. التحفيز مع S100A12 اوليغمرات
      1. اعداد والبذور من الخلايا الاحاديه في 24 لوحات تعليق جيدا كما هو موضح أعلاه. تحفيز الخلايا عن طريق أضافه S100A12 اوليغمرات من الخطوة 4-2. في تركيزات المولي مختلفه (125 nM ، 250 nM ، 500 nM ، 1000 nM).
        ملاحظه: من أجل المقارنة بين قدرات القلة المختلفة لتحفيز الخلايا الاحاديه ، تم تطبيق قله البويضات للخلايا في تركيزات موليه قابله للمقارنة.
      2. احتضان ل 4 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، حصاد الخلايا وقياس الإفراج عن TNFα في supernatants كما هو موضح أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وبعد التنقية المسبقة علي عمود AIEX (الشكل 1ا-ج) وما تلاها من الائتلاف الذي يعتمد علي الكالسيوم (الشكل 2ا ، ب) ، تم الحصول علي بروتين نقي للغاية (الشكل 2c). الاضافه إلى ذلك ، كشفت قياسات السمية المعوية أزاله LPS ناجحه. تم قياس المحتوي LPS بعد AIEX في التخفيف 1:10 فوق حد الكشف عن الفحص ، اي فوق 500 الاتحاد الأوروبي/mL. بعد الترشيح الأول من خلال وحده تصفيه 50 ده ، تم تخفيض محتوي LPS إلى 1 الاتحاد الأور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، ونحن وصف خاليه من العلامات البكتيرية التعبير عن S100A12 الإنسان وتنقيتها ، فضلا عن الانفصال في مختلف الأيونات الناجمة عن الايونيه لتحفيز الخلايا المناعية. بالمقارنة مع المؤلفات المنشورة علي S100A12 تنقيه البروتين8،23،24، واستخدام عاليه cacl2 (25 ملم) في اللوني التفاعل مسعور هو لمعرفتنا فريدة من نوعها. العديد من البروتوكولات تطبيق تركيزات من 1 إلى 5 ملم لا تنتج البروتين النقي ، ومع ذلك لاحظنا عده مر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وكانت هذه الدراسة مدعومة بمنح من برنامج البحوث الطبية المبتكرة داخل كليه الطب بجامعه مونستر (KE121201 إلى سي كي) ومؤسسه البحوث المانيه (DFG ، Fo354/3-1 إلى D.F).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
pET11b ناقلاتNovagen    < / strong>
BL21 (DE3) المختص الإشريكية القولونية < / em>نيو إنجلاند بيولابسC2527< قوي>  ؛
        < / قوي>
100x الأحماض الأمينية غير الأساسية MerckK 0293
25٪ HClCarl RothX897.1
4 & ناقص ؛ 20٪ جل بروتين Mini-PROTEAN TGXBioRad4561093
ملح الصوديوم أمبيسلينكارل روثHP62.1
BS3 (مكرر (سلفوسوكسينيميديل) سوبيرات) - 50 مجمThermoFisher Scientific21580
كالسيوم كلوريد ثنائي هيدراتكارل روث5239.1
Coomassie Briliant Blue R250 Destaining SolutionBioRad1610438
Coomassie Briliant Blue R250 محلول تلطيخBioRad1610436
EasySep طقم تخصيب الخلايا الأحادية البشريةStemcell19059طقم عزل الخلايا السالبة المغناطيسية
EDTA ثنائي هيدرات ملح ثنائي الصوديومكارل روث8043.1
EGTACarl Roth3054.3
EndoLISAHyglos609033الكشف عن السموم الداخلية فحص
فائق النقاء خال من السمومالداخلية سيجما-ألدريتشTMS-011-Aماء عالي النقاء لتحضير المخازن الخالية من السموم
الداخلية EndoTrap redHyglos321063راتنج إزالة السموم
الداخلية FBS (معطل حراريا)Gibco10270
HBSS ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومThermoFisher Scientific14175053
Hepesكارل روث9105
هيبس (خصية ذيفان داخلي عالية الجودة)Sigma-AldrichH4034
hTNF-alpha - مجموعة OptEia ELISABD555212
IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)Carl RothCN08.1
L-Glutamine (200 mM)MerckK 0282
LB-MediumCarl RothX968.1
عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية < م > O55: B5MerckL6529
Pancoll ،PAN BiotechP04-60500(الطرد المركزي المتدرج الكثافة)
البنسلين / الستربتومايسين (10.000 وحدة / مل) ميركA 2212
فينيل سيفاروز عالي الأداءGE Healthcare17-1082-01راتنج ل كروماتوغرافيا التفاعل الكارهة للماء
Polymyxin BInvivogentlrl-pmb
أقراص مثبطات البروتيازRoche11873580001
Q Sepharose Fast FlowGE Healthcare17-0510-01راتنج لكروماتوغرافيا تبادل الأنيون
RoboSep العازلةStemcell20104المخزن المؤقت لفصل الخلايا (القسم 5.1.4)
RPMI 1640 متوسطميركF 1215
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)كارل روث3957.2
هيدروكسيد الصوديومكارل روثP031.1
تريس بيسكارل روث4855.3
كلوريد الزنككارل روثT887
<قوي > مختبر < قوي>قوي
0,45 & الميكرو; مرشح المحقنةm MerckSLHA033SS
14 مل أنابيب مستديرةBD352059
2 لتر قارورة ErlenmyerCarl RothLY98.1
24 ألواح تعليق بئرGreiner662102
5 لتر دورق قياسCarl RothCKN3.1
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةCorning430829
50 مل أنابيب الطرد المركزي عالية السرعةEppendorf3،01،22،178
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي MWCO 3 كيلو دالتونميركUFC900324
Amicon Ultra-15 وحدة تصفية الطرد المركزي MWCO 50 kDaMerckUFC905024
طبق ثقافة (100 مم)Sarstedt83.3902
أنابيب غسيل الكلىطيف132738
مغناطيس EasySep "The Big Easy"Stemcell18001
أنابيب تجميع الكسور 5 ملGreiner115101
فيلم Lumox ، 25 & micro ؛ م ، 305 مم × 40 مSarstedt94،60،77،316فيلم لألواح ثقافة الخلايا
الأحادية Spectra / Por غشاء غسيل الكلى (3.5 كيلو دالتون) وحدةتصفية 132724
الطيفMerckSCGPT01RE
<قوي > المعدات < / قوي >
37 درجة ؛ حاضنة C (مع الاهتزاز) نيوبرونزويك ScientificInnova 42
& Auml ؛ جهاز تنقية KTA UPC 10GE HealthcareFPLC System
FractionCollector GE HealthcareFrac-920
طرد مركزي (مع الدوار A-4-81)Eppendorf5810R
دوار بزاوية ثابتةEppendorfF-34-6-38
Mini Protean Tetra CellBioRad1658000EDU
NanoPhotometerImplenP330
SonicatorBrandelinUW2070
قارئ مضانTecanلانهائي M200PRO
مقياس الأس الهيدروجينيKnick765
ماء محلول فصل إغلاق جهاز

المراجع

  1. Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
  2. Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
  3. Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
  4. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
  5. Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
  6. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  7. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  8. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
  9. Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
  10. Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11(2009).
  11. Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
  12. Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
  13. Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
  14. Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
  15. Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
  16. Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
  17. Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
  18. GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
  19. Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
  20. Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
  21. Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
  22. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
  23. Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
  24. Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
  25. Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
  26. Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
  27. Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
  28. Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنقية S100A12كروماتوغرافيا التبادل الأنيونيكروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماءكروماتوغرافيا الاستبعاد الحجميالربط التشابكي الكيميائيإزالة السموم الداخليةعزل الخلايا الوحيدةإطلاق عامل نخر الورم ألفا
تنقيه الS100A12 البشرية والأيونات الناجمة عنها لتحفيز الخلايا المناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.