مقالة منهجية

عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي

8.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60086

⸱

أكتوبر 20, 2019

 , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول يصف طريقه لعزل مقلة العين الماوس مع جفن, سطح العينين, الأجزاء الاماميه والخلفية في موقف سليمه نسبيا.

الملخص

سطح العين (نظام التشغيل) يتكون من ورقه الظهاريه مع ثلاثه أجزاء متصلة: الملتحمة جفني ، بولبار الملتحمة وظهاره القرنية. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). في النماذج الحيوانية التجريبية مع بعض التعديلات الوراثية أو العمليات الاصطناعية ، فمن المفيد لفحص جميع أجزاء من ورقه الظهاريه OS لتقييم التغيرات المرضية النسبية لكل جزء في نفس الوقت. ومع ذلك ، فقد كان تشريح انسجه نظام التشغيل ككل دون تشويه أو ضرر تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى نعومه ونحافة نظام التشغيل المثبت علي الجفون المنقولة جسديا ومقلة العين. بالاضافه إلى ذلك ، فان ماخذ العين العميقة التي شكلتها الجمجمة الصلبة/العظام المدارية مشغولة تماما من قبل المقلة تاركه مساحة محدوده لتشغيل الأجزاء المتقطعة. ونتيجة لذلك ، فان التشريح المباشر لمقلة العين مع انسجه نظام التشغيل المرتبطة من جانب الوجه غالبا ما يؤدي إلى تلف الانسجه ، وخاصه الملتحمة الشاحبة والبولبار. في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقه لأزاله الجمجمة والعظام المدارية بالتتابع من راس الماوس المقطوع ، تاركا الجفون وسطح العين والعدسة والشبكية تماما في قطعه واحده. تم الحفاظ علي سلامه ورقه نظام التشغيل بشكل جيد ويمكن فحصها من قبل الانسجه أو المناعة في قسم واحد.

المقدمة

يتكون سطح العين من ورقه مستمرة من ظهاره الاقليميه بما في ذلك الملتحمة جفني ، والملتحمة بولبار والقرنية1. ترتبط العديد من الهياكل الغديه مع ظهاره سطح العين وتولد معا طبقه من فيلم المسيل للدموع حماية سطح القرنية من التجفيف والغزوات البيئية2. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). كل من العوامل الوراثية والمهيجات البيئية أو تفاعلاتها تسهم في التعديلات المرضية من OS3,4. وتبعا لذلك ، استخدمت مجموعه متنوعة من النماذج الحيوانية المهندسة وراثيا والمستحثة ماديا أو كيميائيا لدراسة عمليات الامراض في نظام التشغيل البشري.

هيكل ووظيفة الماوس OS مماثله لتلك التي من البشر في نواح كثيره. كما ان مكونات الفيلم المسيل للدموع التي تفرزها الغدد البصرية متشابهة أيضا بين الفئران والبشر. وقد أجريت ثروة من الدراسات باستخدام نماذج الماوس لليات التوضيح من امراض الإنسان OS5,6,7. في كثير من المناسبات ، من الضروري تحليل التغيرات العالمية بدلا من التغييرات الجزيئية المحلية لنظام التشغيل للحصول علي معلومات شامله تحت نفس العلاج التجريبي. ولذلك ، هناك حاجه إلى اعداد عينه مع سلامه جيده لضمان كل جزء من نظام التشغيل ليتم تحليلها في وقت واحد.

الماوس نظام التشغيل المرتبطة باحكام مقلة العين التي كانت جزءا لا يتجزا من التجويف/المدار (كوب عظمي مصنوعة من عده عظام الجمجمة المختلفة) ويتصل به من خلال الانسجه الضامة رقيقه. هناك تحديات هائله لتشريح سطح العين كله دون الاضرار بالملتحمة جفني أو بصلي. وهذه التحديات تنحدر من: ' 1 ' ان نظام التشغيل لين ورقيق ومثبت علي الجفون ومقلة العين المنقولين ماديا ، التالي فهو معرض للتشويه والتلف ؛ و ' 2 ' الحيز المحدود بين العظام المدارية ومقلة العين يقيد عمليات التشريح. التحديات هي أكبر بكثير بالنسبة للماوس الكبار. في الفاره الجنينية ، والتحجر العظام المدارية ليست كامله والانسجه المحيطة هي فضفاضة نسبي8. يمكن أزاله الراس وتقسيمها ، ومن ثم تعرض مباشره لتثبيت بارافورمالدهيد (PFA) وتضمين9. وعلي النقيض من ذلك ، فان العظام المدارية الفارهة بعد الولادة والبالغة هي متحجرة تماما مع الانسجه المحيطة السميكة ، مما يجعل تغلغل المثبتات اقل كفاءه. وعلاوة علي ذلك ، العظام المدارية/الجمجمة من الصعب وهشه ، وكسر بسهوله عند التماس لهم في المركبات التضمين لينه مثل البارافين. سوف تمزق القطع المكسورة من العظام بالإجماع الانسجه القريبة مما ادي إلى المورفولوجية الانسجه السفلي.

كثير نشر دراسات غالبا يبدي متحيزة عين سطح, اي يمكن كنت كاف ل هم خاصه بحث أغراض10,11. وقد وجدت دراسة إجماليه للآداب دراسات قليله فقط تبين السطح الكامل للعين السليمة دون وصف مفصل لبروتوكولات التشريح12،13. في هذا البروتوكول ، قمنا بتفصيل طريقه تشريح للحصول علي سطح العين المتكامل بعد الولادة ، والتي تم فيها أزاله العظام المدارية والجمجمة بشكل منظم ، تاركه سطح العين البكر مع مقلة العينين والجفون ، وتقليل الاضرار المادية. درسنا كذلك الانسجه نظام التشغيل وأداء مناعي باستخدام أقسام الانسجه التي أعدت مع هذا البروتوكول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة علي جميع الإجراءات التي تنطوي علي استخدام الفئران من قبل لجنه العناية بالماشية واستخدامها ، مركز تشونغشان للعيون ، وانضم إلى بيان ARVO لاستخدام الحيوانية في بحوث العيون والبصر.

1. تشريح مقلة العين مع سطح العينين سليمه والجفون

  1. تشريح الراس.
    1. موت ببطء اليوم التالي للولادة 10 (P10) و P28 الفئران (انظر جدول المواد لسلالات الماوس) عن طريق خلع عنق الرحم ، وقطع راس الرقبة من قبل زوج من مقص حاد.
    2. الراس bisect مع زوج من مقص مستقيم علي طول خط الوسط السهمي بداية في العظم الجدارية rostrally إلى الأنف (الشكل 1ا ، ب).
      ملاحظه: عظم الجمجمة يصلب مع الشيخوخة الماوس ، وتوخي الحذر للحفاظ علي مقص قطع علي طول خط الوسط قدر الإمكان.
    3. ضع كل نصف الراس المقطوع في طبق بيتري نظيف ، واقطع الفك واللسان أولا باستخدام مقص حاد. حرر العصب البصري عن طريق تقطيعه من الدماغ قبل الموقع التصالب البصرية ، وأزاله جميع انسجه المخ بما في ذلك لمبة حاسة الشم تعلق علي جدار الجمجمة.
    4. الآن الانسجه المتبقية يجب ان يكون كل العظام الجمجمة/المدارية المرتبطة مقلة العين (الشكل 1ج ، د). غسل الجزء المتبقي مع برامج تلفزيونيه لتنظيف الدم والحطام الشعر.
    5. الانسجه بادئه مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA ، في المحلول الملحي الفوسفات مخزنه [بالفيديو] ، pH 7.4) في أنبوب مخروطي 50 mL في درجه حرارة الغرفة (RT) مع التناوب. الوقت التقريبي للتثبيت علي النحو التالي: ~ 10 دقيقه ل P0 إلى P7; ~ 20 دقيقه ل P8 إلى P28; و ~ 30 دقيقه ل P29 وكبار السن.
      ملاحظه: يوفر التثبيت المسبق صلابة الانسجه مما يجعل التشريح الناتج أسهل. بالاضافه إلى ذلك ، يتجنب التثبيت المسبق ترك الانسجه الطازجة غير ثابته لفتره طويلة قبل اكتمال التشريح.
      تحذير: PFA خطره ويجب التعامل معها بعناية.
  2. أزاله الجمجمة/العظام المدارية.
    1. بعد التثبيت ، بسرعة غسل الراس تشريحها في الاذاعه التلفزيونية ثلاث مرات لمزيد من القضاء علي الشعر المكسور والمثبتات من أجل المضي قدما في تشريح مزيد من.
      تحذير: يمكن ان يكون التعرض للتثبيتات اثناء التشريح ضارا بالصحة.
    2. ضع النسيج في طبق بيتري 10 سم ، وقطع الجمجمة إلى ثلاثه أجزاء علي طول الطائرات المشار اليها في الشكل 1D ، E. يتم إخفاء مقلة العين في المقبس في الجزء الأوسط من الجمجمة تحت ethmoid ، والعظام الاماميه والفك العلوي (الشكل 1د ، ه).
    3. استخدم زوجين من الملقط المستقيم رقم 4 لتقشير العظم الغربالي للكشف عن العظام الاماميه والفك العلوي بشكل كامل (الشكل 1و).
    4. تقسيم سطح الجمجمة جغرافيا (بما في ذلك الفك العلوي والعظام الاماميه) إلى 4 مناطق (الشكل 1و). ادخل طرف الملقط المنحني أفقيا في كل منطقه لأزاله العظم الفكي والامامي بالتتابع (الشكل 1و).
      ملاحظه: لا يمكن أزاله العظام الفك العلوي في وقت واحد. تشريح بصبر لهم قطعه من قطعه. العظم الجبهي متصل مباشره بمقلة العين من خلال الانسجه الضامة اللينة. توخي الحذر عند ازالته من مقلة العين لمنع تمدد مقلة العين والاضرار الملتحمة.
    5. بعد أزاله العظم الفكي الجزئي وجميع العظام الاماميه ، ستتعرض العظام الدمعية الاساسيه وعظم الجوغال (الشكل 1G). أزاله العظام اثنين والعضلات تحت الجلد المرتبطة والدهون المحيطة مقلة العين ، وتقليم مقلة العين مع الجفون المرفقة والجلد في كتله صغيره الشكل مربع للحد من حجم الانسجه وتسهيل توجيه الانسجه عند تضمين (الشكل 1 ح).
    6. وضع مقلة العين والانسجه المرتبطة بها مره أخرى إلى 4% PFA والاستمرار في إصلاح بين عشيه وضحيها في 4 ° c. النسيج ثابته يستطيع كنت حافظت ل علي الأقل واحده شهر في 4 [ك] في [ببس] مع أضافه من 0.02% [نان]3. بدلا من ذلك ، انتقل إلى التحليل النسيجي علي الفور.
      ملاحظه: إذا كان النسيج يحتاج إلى تخزين لفترات أطول ، فانه يمكن تخزينها بسهوله في 70 ٪ الايثانول.

2. التحليل النسيجي

  1. البارافين القسم والدم والخلايا الدموية و يوزين (H & E) تلطيخ
    1. اتبع البروتوكول القياسي الموصوف في مكان آخر9 لاجراء تضمين البارافين والتقسيم.
  2. مناعي (IHC)
    1. ديواكس أقسام البارافين مع اكسيلين وأعاده ترطيب الأقسام من خلال سلسله الكحول (100 ٪ ، 95 ٪ ، 80 ٪) في الماء المقطر (dH2س).
    2. اجراء استرداد مستضد عن طريق المعالجة بالموجات الدقيقة من الشرائح الانسجه في 0.01 M العازلة حامض الستريك (3 غرام من سترات الصوديوم ، 0.4 غرام من حمض الستريك في 1 لتر المقطر المزدوج H2س) في جره الشريحة الزجاجية مع انخفاض الطاقة (120 W). وينبغي ان يتم تسليم الطاقة بشكل متقطع لمجموع 5-10 دقيقه مع كل فاصل زمني يدوم حوالي 2 دقيقه.
      ملاحظه: الميكروويف عاليه الطاقة أو التدفئة متسقة تؤدي إلى انفصال أقسام الانسجه من الشريحة.
    3. اقتطاف الشرائح من جره زجاجيه ، ويمسح بعناية قباله السائل المتبقية المحيطة كل قسم باستخدام انسجه الوجه ووضعها علي رف الشريحة في مربع الانسجه. رسم مربع حول كل قسم مع قلم النسيجية للماء. مكان 100 μL من حجب العازلة (0.1 ٪ تريتون X-100 و 10 ٪ حمار المصل في 1x تلفزيوني) علي كل مربع ، واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
    4. أزاله بعناية حل الحجب مع فراغ ، أضافه الأجسام المضادة الاساسيه (انظر جدول المواد) مع التخفيف المطلوب في حظر العازلة ، والاستمرار في احتضان الشرائح في 4 درجه مئوية لمده 24 ساعة أو أكثر.
      ملاحظه: يختلف تركيز كل الأجسام المضادة الاساسيه المستخدمة في IHC ، ويحتاج إلى اختبارها في التجارب التجريبية.
    5. يغسل الشرائح الانسجه مع PBST (0.1 ٪ تريتون في الاذاعه التلفزيونية) ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما. كرر الخطوة 4.2.2 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد) مع 4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi) استبدال المخزن المؤقت الحظر. الاستمرار في احتضان لمده 4 ساعات علي الأقل أو أكثر في درجه حرارة الغرفة (RT).
    6. أزاله الأجسام المضادة الثانوية ، وغسل أقسام الانسجه مع محلول PBST ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما ، ثم يغسل مع برامج تلفزيونيه نظيفه لمده 5 دقائق أخرى.
    7. امسح الأجزاء المتبقية من الانسجه المحيطة بالمقاطع التلفزيونية ، وجبل الشفتين علي الأقسام ذات التركيب المتوسط. أداء المجهر الفلورسنت للحصول علي الصور (انظر جدول المواد).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم توضيح عظام الجمجمة الرئيسية التي تم النظر اليها من وجات نظر مختلفه في الشكل 1ا-ه، مع ألوان التي تدل علي عظام مختلفه. استخدمنا أربعه أسابيع الحيوانية القديمة لإظهار عمليات تشريح. بعد التشريح الخطوات 1.1.1-1-1-3 والتثبيت المسبق قصيرة (الخطوة 1-1-4) ، وتظهر مقلة العين مع عظام الوجه المرتبطة بها في الشكل 1ه. مزيد من تقليم لأزاله الامامي (الأنف والفك العلوي) والخلفي (علي سبيل المثال ، الجدارية) ، ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أحد التذكيرات الهامه لاعداد مقلة العين السليمة هو ان جميع العظام المدارية يجب ازالتها تماما ، وخاصه العظام الجوقة والدمعية ، والتي هي صغيره وتقع بالقرب من الجزء السفلي من تجويف العينين. اي عظام اليسار قد تعقد الانسجه التي تلت ذلك. في حاله عدم أزاله قطعه صغيره من العظم بالبالكامل من التشريح عن طريق الصدفة ، قد يتم انتقاؤها من كتله البارافين المضمنة باستخدام زوج من الشاربات. يجب ان تملا الحفرة التي خلفتها بالبارافين المذاب بعد هذه العملية.

وينبغي توخي الحذر الإضافي عند التعامل مع العدسة. القطع ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

ويشكر المؤلفان البروفيسور رونغ جو علي القراءة الناقدة للمخطوطة ، وجميع أعضاء المختبر للحصول علي المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمه من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 31571077 ؛ بيجين ، الصين) ، مشروع مدينه قوانغتشو للابتكار في مجال العلوم والتكنولوجيات (201707020009 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، "100 خطه الناس" من جامعه صن يات سين (8300-18821104 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، والتمويل البحثي من مختبر الدولة مفتاح طب العيون في مركز تشونغشان للعيون (303060202400339 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 وأقات. محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Transgen BiotechFG701-01
50 مل أنبوب طرد مركزيCorning430829
شرائح مجهر لاصق مختلفة
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogen / Life TechnologiesA12379التركيز المقترح 1: 500 - 1,000
Alexa Fluor 568 PhalloidinInvitrogen / Life TechnologiesA12380التركيز المقترح 1: 500 - 1,000
الجسم المضاد ل K12Abcamab124975التركيز المقترح 1: 1,000
الجسم المضاد ل K14Abcamab7800التركيز المقترح 1: 800
حامض الستريكغطاء مختلف
أدواتالدقة العالمية14127
تشريح المجهر.OlmpusSZ61
الكحول الإيثيليمجهر الفلورسنت المختلف
ZeissAxioImager.Z2
Fluoromount-G وسائل الإعلام المتصاعدةSouthernBiotech0100-01
مايكرو تشريح مقص مستقيم شفرةعالمية أدوات دقيقة503242
أفران الميكروويفGalanzسلالات الماوس P70D20TL-D4
C57 / BL6 و Sv129 مختلطة
الملقط المستقيم رقم 4أدوات الدقة العالمية501978-6
مصل الماعزالعادي مختلف
بارافورمالدهايد (PFA) مختلفإعداد حل 4٪ في 1 & ممرات ؛ PBS والفلتر مع 0.45 & mu ؛ م مرشح غشاء
الأنسجة طبق ثقافة الأنسجةمختلف
سترات ثلاثي الصوديوممختلفة تريتون
X-100سيجما ألدريتشSLBW6818
شريحة ملقط منحني مختلف

المراجع

  1. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
  2. Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
  3. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
  4. Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
  5. Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
  6. Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
  7. Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
  8. Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
  9. Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
  10. Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
  11. Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
  13. McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
  14. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PBS

مقالات ذات صلة