نحن نقدم طريقة قوية وفعالة من حيث التكلفة ومرنة لقياس التغيرات في عدد الكبد وploidy النووية داخل عينات الأنسجة الثابتة / cryopreserved التي لا تتطلب قياس خلايا التدفق. نهجنا يوفر توقيع عينة قوية على نطاق واسع من علم خلايا الكبد مثالية لتتبع تطور إصابات الكبد والمرض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة عالية الإنتاجية في الموقع لتقدير البليدي النووي الكبدي في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
عندما يصاب الكبد، تنخفض أعداد خلايا الكبد، في حين أن حجم الخلية وحجمها النووي وزيادة البوليد. التوسع في الخلايا غير parenchymal مثل cholangiocytes، الخلايا العضلية، السلف والخلايا الالتهابية تشير أيضا إلى تلف الكبد المزمن، وإعادة عرض الأنسجة وتطور المرض. في هذا البروتوكول، نصف نهج بسيط عالي الإنتاجية لحساب التغيرات في التركيب الخلوي للكبد المرتبطة بالإصابة والأمراض المزمنة والسرطان. نعرض كيف يمكن استخدام المعلومات المستخرجة من أقسام الأنسجة ثنائية الأبعاد (2D) لقياس ومعايرة البوسيتي النووي الكبدي داخل عينة وتمكين المستخدم من تحديد موقع مجموعات فرعية محددة داخل الكبد في الموقع. تتطلب طريقتنا الوصول إلى مواد الكبد الثابتة /المجمدة، وكواشف الكيمياء المناعية الأساسية وأي منصة تصوير قياسية عالية المحتوى. وهو بمثابة بديل قوي لتقنيات قياس الخلايا القياسية للتدفق ، والتي تتطلب تعطيل الأنسجة التي تم جمعها حديثًا ، وفقدان المعلومات المكانية والتحيز المحتمل للتصنيف.
المقدمة
يمكن أن تخضع خلايا الكبد في الكبد الثديي للخلايا المتوقفة لإنتاج خلايا ثنائية النووي ، وتكرار الحمض النووي لإنتاج نواة متعددة البلوية تحتوي على ما يصل إلى محتوى الحمض النووي 16N. زيادة إجمالية الخلوية والنووية في البوليد خلال تطور ما بعد الولادة، والشيخوخة واستجابة للضغوط الخلوية المتنوعة1. عملية تعدد البلح ديناميكية وعكسها2، على الرغم من أن وظيفتها البيولوجية الدقيقة لا تزال غير واضحة3. ويرتبط زيادة ploidy مع انخفاض القدرة التكاثرية4،والتنوع الوراثي2،والتكيف مع الإصابة المزمنة5 وحماية السرطان6. التعديل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد سبق أن وافقت لجنة الأخلاقيات التابعة للمؤسسة على جميع التجارب على الحيوانات. تم إيواء الفئران في منشأة خالية من مسببات الأمراض في مركز الاستثمار Príncipe فيليبي (فالنسيا، إسبانيا)، مسجلة كمربي الحيوانات التجريبية، والمستخدم، ومركز العرض (reg. لا. ES 46 250 0001 002) بموجب اللوائح الأوروبية والإسبانية الحالية لرعاية الحيوان (RD 53/2013).
1. حصاد الأنسجة وإعداد العينة
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول كيفية تجميد الأنسجة دون التثبيت المسبق أو الحفظ بالتبريد. بالنسبة للعينات الثابتة السابقة/المحفوظة بالتبريد، تنتقل إلى القسم 2 وتحذف الخطوة 3-1. وقد أجريت جميع التحليلات باستخدام فئران أنثى بالغة تبلغ من العمر 12-16 أسبوعا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد استخدمت هذه الطريقة لقياس تأثير الإصابة البَلْفة على كبد الفأر البالغ عن طريق تغذية الحيوانات لمدة 0-21 يوماً بنظام غذائي سام بالكبد يحتوي على 0.1% 3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine (DDC)17. وقد زادت نتائج التغذية المزمنة DDC في الإصابة الكبدية البلية توسع biportal من NPCs. يجب أن يدرك المستخدم أن سلالة الفأروالاختلافات التي تعتمد على العمر قد تكون موجودة في البوليد النووي وأن جميع التحاليل قد أجريت باستخدام فئران C57BL/6 البالغة التي تتراوح أعمارهم بين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتم وصف نهج عالي المحتوى وعالي الإنتاجية لتحليل إعادة عرض الأنسجة وتقدير البوليد النووي الكبدي في كبد المورين. بمجرد معرفة الإجراء، يمكن للمستخدم معالجة عينات متعددة وصورتها وتحليلها في فترة 3-5 أيام، مما يؤدي إلى إنشاء مجموعات بيانات كبيرة قابلة للاختبار توفر توقيعًا مفصلًا لصحة الكبد. بالنظر إلى بساطة طريقة إعداد العينة ، جنبا إلى جنب مع أعداد كبيرة من الخلايا ومنطقة الأنسجة التي تم تحليلها (في المتوسط 14 مم2/ عينة) ، فإن النتائج قوية وقابلة للاستنساخ للغاية. أتمتة التقاط الصور وتحليلها يزيل أيضا خطأ المستخد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا العمل من قبل حكومة ماينكو الإسبانية منح BFU2014-58686-P (LAN) وSAF-2017-84708-R (DJB). تم دعم الشبكة المحلية من قبل ماينكو رامون ذ كاخال الوطنية زمالة RYC-2012-11700 وجائزة خطة GenT (Comunitat Valenciana, CDEI-05/20-C), وFMN من قبل الإقليمية ValI +D الطلاب من الجنرالات فالنسيا ACIF/2016/020. ويود البرنامج أن ينوه بالبروفيسور إيوا ك. بالوش على التمويل. نشكر الدكتورة أليسيا مارتينيز روميرو (خدمة قياس الخلايا CIPF) على المساعدة في منصة IN Cell Analyzer.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3،5-diethoxycarboxynl-1،4-dihydrocollidine diet (DDC) | TestDiet | 1810704 | Modified LabDiet Premiere Diet 5015 مع 0.1٪ DDC |
| Alexa Fluor 488 حمار مضاد للماعز IgG (H + L) | Invitrogen | A11055 | التخفيف 1: 500 |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cryostat Leica CM1850 أنظمة حيوية للأشعة فوق البنفسجية | Leica | CM1850 | |
| الفلورسنت متوسط | Dako | S3023 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | برنامج إحصائي لبيانات الرسوم البيانية |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | التركيز النهائي 5 & جم / مل |
| خلية 1000 | GE Healthcare Bio-Sciences Corp | نظام التصوير والتحليل الخلوي عالي المحتوى | |
| MATLAB | MathWorks | R2019a | برنامج تحليلات البيانات للتحليل الآلي |
| لغطاء المجهر النووي متعدد الصغب شرائح | VWR International | 630-2864 | حجم 24 × 60 مم |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Speadsheet برنامج | |
| OCT Tissue Tek | Pascual y Furió | 4583 | |
| Paraformaldehyde | Panreac AppliChem | 141451.121 | |
| قلم للتلوين | المناعي Sigma-Aldrich | Z377821-1EA | 5 مم عرض طرف |
| البوليسين المجهر شرائح | VWR International | 631-0107 | |
| أرنب متعدد النسيلة مضاد ل HNF4 & ألفا ؛ | Thermo Fisher Scientific | PA5-79380 | التخفيف 1: 250 (بديل) |
| Rabit متعدد النسيلة مضاد ل HNF4 & alpha ؛ | سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية | sc-6556 | التخفيف 1: 200 (الجسم المضاد المستخدم في الدراسة) |
| توين 20 | سيجما ألدريتش | P5927 |
المراجع
- Gentric, G., Desdouets, C. Polyploidization in liver tissue. American Journal of Pathology. 184 (2), 322-331 (2014).
- Duncan, A. W., et al. The ploidy conveyor of mature hepatocytes as a source of genetic variation. Nature. 467 (7316), 707-710 (2010).
- G....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
