Method Article

توصيف الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا المناعية ودراسة التأثير الوظيفي على بيئة الخلية

DOI:

10.3791/60118

⸱

June 2nd, 2020

 ,  ,  ,  , 
1U1192-Laboratoire Protéomique, Réponse Inflammatoire et Spectrométrie de Masse (PRISM), Univ. Lille, INSERM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسلط هذا التقرير الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل الحويصلات خارج الخلية (EV) عن الميكروجليا أو الضامة الدموية. تم تقييم المركبات الكهربائية المشتقة من Microglia كجهات تنظيمية للنمو النيوريفي في حين تمت دراسة المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم في السيطرة على غزو خلايا الدبقي C6 في الاختبارات المختبرية. والهدف هو فهم أفضل لهذه الوظائف EV كوسطاء المناعة في بيئات دقيقة محددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الحالة العصبية العصبية للجهاز العصبي المركزي (CNS) دورًا رئيسيًا في الحالات الفسيولوجية والمرضية. Microglia، والخلايا المناعية المقيمة في الدماغ، وأحيانا الضامة المشتقة من نخاع العظم التسلل (BMDMs)، وتنظيم الشخصية الالتهابية من بيئتها الدقيقة في الجهاز العصبي المركزي. ومن المسلم به الآن أن الحويصلات خارج الخلية (EV) السكان من الخلايا المناعية بمثابة وسطاء المناعة. وبالتالي، فإن جمعها وعزلها مهمان لتحديد محتوياتها ولكن أيضا تقييم آثارها البيولوجية على الخلايا المتلقية. تسلط البيانات الحالية الضوء على المتطلبات الزمنية لعزل EV من خلايا microglia أو الضامة الدموية بما في ذلك خطوات الترفيع والكروماتوغرافيا للحجم الاستبعاد (SEC). وسمح تحليل بروتوميلي غير مستهدف بالتحقق من صحة توقيعات البروتين كعلامات EV ووصف محتويات EV النشطة بيولوجياً. كما استخدمت المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروجليا وظيفيا على الثقافة الأولية للخلايا العصبية لتقييم أهميتها كوسطاء المناعة في نمو neurite. وأظهرت النتائج أن المركبات الكهربائية المشتقة من الميكروغليا تساهم في تسهيل نمو النيورايت في المختبر. في موازاة ذلك، تم استخدام المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة الدم وظيفيا كوسطاء مناعية في الثقافات الكروية لخلايا الورم الدبقي C6، وتظهر النتائج أن هذه المركبات الكهربائية تتحكم في غزو خلايا الورم الدبقي في المختبر. يسلط هذا التقرير الضوء على إمكانية تقييم وظائف الخلايا المناعية بوساطة EV ولكن أيضًا فهم الأسس الجزيئية لمثل هذا الاتصال. يمكن أن يعزز هذا فك التشفير استخدام الحويصلات الطبيعية و / أو الإعداد في المختبر للحويصل العلاجية من أجل تقليد الخصائص المناعية في البيئة الدقيقة لباثولوجيا CNS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترتبط العديد من الأمراض العصبية بحالة الالتهاب العصبي وهي آلية معقدة يتم النظر فيها بشكل متزايد ، ولكنها لا تزال غير مفهومة بشكل جيد لأن العمليات المناعية متنوعة وتعتمد على بيئة الخلية. في الواقع ، لا تنطوي اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بشكل منهجي على نفس إشارات التنشيط وخلايا الخلايا المناعية ، وبالتالي يصعب تقييم الاستجابات المؤيدة أو المضادة للالتهابات كأسباب أو عواقب للأمراض. الضامة المقيمين في الدماغ ودعا "microglia" ويبدو أن في واجهة بين الجهاز العصبي والجهاز المناعي1. Microglia لها أصل النخاع وتستمد من كيس صفار خلال الهيماتوبوسيات البدائية لاستعمار الدماغ، في حين يتم اشتقاق الضامة المحيطية من الكبد الجنيني خلال الهيماتوبوسيات النهائية ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الثقافة الأولية من Microglia / الضامة

  1. الثقافة الأولية للميكروجليا
    1. الاستزراع التجاري للفئران الميكروجليا الأولية (2 × 106 خلايا) (انظر جدول المواد)في متوسط النسر المعدل في دولبيككو (DMEM) المكمل بمصل خال من الاكسوسوم بنسبة 10٪، و 100 U/mL من البنسلين، و 100 ميكروغرام/مل العقدية، و9.0 جرام/لتر عند 37 درجة مئوية و5% CO2.
    2. جمع المتوسطة مشروطة بعد ثقافة 48 ح والمضي قدما في عزلة المركبات الكهربائية.
  2. الثقافة الأساسية للالضامة
    1. الاستزراع التجاري للفئران الضامة الأولية (1 × 106 خلايا) في الوسط الذي توفره الشركة المصنعة (انظر

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحد التحديات الرئيسية لعزو الآثار البيولوجية إلى الحويصلات خارج الخلية (EVs) هو القدرة على عزل المركبات الكهربائية من وسط الثقافة بأكملها. في هذا التقرير، نقدم طريقة باستخدام ultracentrifugation (UC) والكروماتوغرافيا حجم الاستبعاد (SEC) التي يقترن التحليل على نطاق واسع من توقيعات البروتين للتحقق من علامات EV وتحديد المركبات النشطة بيولوجيا. تم عزل المركبات الكهربائية المشتقة من الضامة أو الميكروجليا عن الوسط المكيف بعد ثقافة 24 ساعة أو 48 ساعة على التوالي(الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العصبي المركزي (CNS) هو نسيج معقد ينظم فيه الاتصال من خلية إلى خلية وظائف الخلايا العصبية العادية اللازمة لـ التوازن30. تتم الآن دراسة المركبات الكهربائية على نطاق واسع ووصفها بأنها شحنات جزيئية مهمة للاتصال من الخلية إلى الخلية31. أنها توفر على وجه التحديد مزيج من الوسطاء إلى الخلايا المتلقية مما يؤثر على وظائفها في ظروف صحية ومرضية32. تشير الدراسات الحديثة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب دورا حاسما في الجهاز العصبي المركزي2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ودعمت الأعمال المقدمة كل من المجلس الوطني للتعليم، وشركة "إنسيرينمنت" و"دي لا ريتشرشي"، و"إنسيرم". ونحن ننوه بامتنان لمنشأة المدينة العلمية BICeL- الحرم الجامعي للوصول إلى الأدوات والنصائح التقنية. ونعترف بامتنان بجان - باسكال جيمينو، وسليمان أبووار، وإيزابيل فورنييه على المساعدة في قياس الطيف الجماهيري. ونحن ننوه بامتنان لتانينا عرب، وكريستيل فان كامب، وفرانسواز لو ماريك - كروك، وجاكوبو فيزيولي، وبيير إريك ساوتيير لمساهمتهم القوية في التطورات العلمية والتقنية.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12٪ ميني بروتين  جل البروتين الجاهز TGXBio-rad4561045EDU 
أسيتونيتريلفيشر للكيماوياتA955-1  ؛
مرشح الطرد المركزي Amicon 50 kDaMerckUFC505024 
بيكربونات الأمونيومسيجما ألدريتش9830  ؛
HSP90 α/β الجسم المضاد (RRID: AB_675659)سانتا كروزsc-13119 
مكمل B27 PlusGibcoA3582801 
BenchMixer V2 Vortex MixerBenchmark ScientificBV1003 
كاشف صبغ فحص البروتين Bio-Rad (برادفورد)Bio-Rad5000006 
C18 ZipTipsMerck MilliporeZTC18S096 
خلية الورم الدبقي C6 الفئرانATCCATCC CCL-107 
أنابيب كنسيSarstedt62.554.002 
جهاز طردمركزي Eppendorf5804000010 
CO2< / sub> حاضنةThermoFisher  ؛ 
مجهر متحد البؤر LSM880كارل زايسLSM880 
غطاء زجاجيMarienfeld111580 
صحن الثقافة (60 مم)Sarstedt82.1473 
DithiothreitolSigma-Aldrich43819 
DMEMGibco41966029 
EASY-nLC 1000 كروماتوجراف سائلThermoFisher  ؛ 
المجهر الإلكتروني JEM-2100JEOL  
الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيليثير) -N ، N ، N & Prime ؛ N & - حمض رباعي الأسيتيكسيجما ألدريتش03777-10G  ؛
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكسيجما-ألدريتشED-100G 
Exo-FBSOzymeEXO-FBS-50A-1Exosome مستنفد
قاعدة بيانات FBS ExoCarta (أفضل 100 بروتين من Evs)  http://www.exocarta.org/
مصل الأبقار الجنينيGibco16140071 
مصل الحصان الجنينيBiowestS0960-500 
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001 
Fisherbrand  Q500 Sonicator مع مسبارFisherbrand12893543 
FlexAnalysisBrucker  
تصاعد الفلورة المتوسطةAgilentS3023 
حمض الفورميكسيجما ألدريتش695076 
شبكات نحاسية مطلية بالكربون فورمفارAgar Scientific LtdAGS162-3 
الجلوكوزسيجما ألدريتشG8769  ؛
GlutaraldehydeSigma-Aldrich340855 
Hoechst 33342Euromedex17535-AAT 
الإيدوأسيتاميدسيجما ألدريتشI1149  ؛
InstantBlue Coomassie Protein StainExpedeonISB1L 
مجهر الضوء المقلوب CKX53Olympus  
L-الجلوتامينGibco25030-024 
LabTek II 8 آبار  Nunc154534 
Laemmli 2xBio-Rad1610737 
LamininCorning354232 
برنامج MaxQuant (برنامج تحديد البروتينات)  https://maxquant.net/maxquant/
MBT البولندية ستيلبروكر8268711 
MEM 10xGibco21090-022 
ميثيل السليلوزسيجما ألدريتشM6385-100G& nbsp ؛
ميليك ووترميرك ميليبور  
ميلكريجيلايتREGILAIT300 
خلية الرحلان الكهربائي العمودي المصغرة PROTEANBio-Rad1658000FC 
عمود MonoP FPLCGE Healthcare لم يعد متاحا
Nanosight NS300Malvern PanalyticalNS300  ؛
NanoSight NTA v3.2Malvern Panalytical  
مضخة حقنة NanoSightMalvern Panalytical  
NeurobasalGibco21103-049 
غشاء النيتروسليلوزGE Healthcare10600007 
Nonidet P-40Fluka56741  ؛
Nunc متعدد الأطباق 24 بئرThermoFisher82.1473 
المجهرالكهربائي بارافورمالدهايد15713 
PC-12 خط الخليةATCCATCC CRL-1721 
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140-122 
مزيج معايرة الببتيدLaserBio LabsC101  ؛
بيروكسيداز أفينيبيور ماعز مضاد للفأر IgG (H + L) JacksonImmunoResearch115-035-003 
برنامج Perseus (معالجة البروتينات المحددة)  https://maxquant.net/perseus/
Phalloidin-tetramethylrhodamine مترافقسانتا كروزsc-362065 
فينيل ميثان سولفونيل فلوريدسيجما ألدريتش78830  ؛
عازلة الفوسفات الملحيةInvitrogen14190094خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم
pluriStrainer M / 60 & micro ؛ مpluriSelect43-50060 
بولي د-ليسينسيجما ألدريتشP6407 
أنابيب الطرد المركزي من البولي كربوناتBeckman Coulter355651 
مثبط الإنزيم البروتينيسيجما ألدريتشS8830-20TAB 
أنظمة خليةPureCol5005  ؛
مطياف الكتلة Q-ExactiveThermoFisher  ؛ 
مطياف الكتلة rapifleXBrucker  
الخلايا العصبية القشرية للفئرانتطبيقات الخلاياR882N-20أصل الخلية: مشتق من القشرة الدماغية في اليوم 18 أدمغة الفئران الجنينية Sprague Dawley البلاعم
الفئران & تطبيقات الخلايا الدبقية الصغيرة للخلايا المتوسطةR620K-100Cell orgin: الجرذ السليم
الجرذ الضامة الأوليةالخلاياR8818-10a 
الفئران الدبقية الصغيرةالأولية LonzaRG535 
Sepharose CL-2BGE Healthcare17014001 
تسلسل الصف المعدل التربسينPromegaV5111  ؛
الغبار100204 
كلوريد الصوديومScharlauSO0227  ؛
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتشL3771  ؛
فلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS7920-100G 
هيدروكسيد الصوديومScharlabSO0420005P 
بيروفوسفات الصوديومسيجما-ألدريتشS6422-100G 
مكثف الفراغ SpeedVacThermoFisher  ؛ 
برنامج السلسلة (شبكات ارتباط البروتين الوظيفية)  https://string-db.org/
SuperSignal West Dura Extended Duration SubstrateThermoFisher34075  ؛
حقنة 1.0 ملTerumo8SS01H1 
Trans-Blot SD خلية نقل شبه جافةBio-Rad1703940 
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتشT6508  ؛
تريسإنترشيمUP031657 
تريس جلايسينيوروميدكسEU0550 
توين 20سيجما ألدريتشP2287 
جهاز طرد مركزي فائقBeckman CoulterA95765 
طرد مركزي فائق 70.1 TiBeckman Coulter342184 
أسيتات أورانيلأجار العلمية المحدودةAGR1260A 
ورق ترشيح WhatmanSigma-AldrichWHA10347510 
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidSigma-AldrichC2020-25G 
مركز برنامج علم السليم تطبيقات شريحة جهاز

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thion, M. S., Ginhoux, F., Garel, S. Microglia and early brain development: An intimate journey. Science. 362 (6411), 185-189 (2018).
  2. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesImmune CellsUltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyNanoparticle Tracking AnalysisWestern BlotProteomics AnalysisNeurite OutgrowthGlioma Cell InvasionMicroglia derived EVs

Related Articles